专利名称：一种促进体细胞增殖的方法
技术领域：
本发明属于细胞工程和组织工程领域，具体地是涉及一种促进体细胞增殖的方法。
背景技术：
随着分裂次数的不断增多，细胞的增殖能力逐渐减弱，最终停止增殖，这是细胞从干细 胞经过短暂扩增细胞到终末细胞的老化过程，此过程受诸多因素影响，有些因素可以减缓甚 至逆转这一老化过程，使细胞重新获得分化、增殖的能力。
目前，在体外使终末分化的成熟细胞重新获得分化、增殖能力主要策略包括核移植(Wihmxt I, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385:810-813)、 细胞融合(Tada M， et al. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrids cells. EMBO J， 1997, 16: 6510-6520; Tada M, et al. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells. Dev Dyn, 2003, 227:504-510; Tada M， et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol, 2001， 11:1553-1558)、利用细胞裂解液(Taranger C K, et al. Induction of dedifferentiation, genomewide transcriptional programming, and epigenetic reprogramming by extract of carcinoma and embryonic stem cells. Mol Bio Cell, 2005， 16: 5719-35)或者特殊成分的培养液(Chen S， et al. Dedifferentiated of lineage-committed cells by a small molecule. J Am Chem Soc, 2004, 126: 410-411; Shannon J， et al. Dedifferentiation of mammalian myotubes induced by Msxl. Cell, 2000,103: 1099-1109; Kondo T & Raff M. Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells. Science, 2000, 289: 1754-1757)诱导、多个转录因子组合 转染(Takahashi K & Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126:663-676; Okita K, et al. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448:313-7; Wernig M, et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature, 2007， 448:318-24; Maherali N, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell, 2007， 1:55-70)，病毒或端粒酶转染(Robertson, D. M.,et al. Characterization of growth and differentiation telomerase陽immortalized human corneal epithelial cell line. Investig Ophthalmol Vis Sci,2005,46: 470-478; Araki-Sasaki, K,， et al. An SV40
3immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995,36: 614-21; Kahn， C.R., et al. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993,34: 3429-41.)等。
(1)核移植核移植是最极端的例子，成年动物的体细胞能够通过与成熟卵子融合即体细胞核
移植(Somatic cell unclear transplantation, SCNT)的方法实现发育过程的重演。该过程依赖于卵 子的参与，因此存在伦理上的争议；虽然目前已经获得了许多种类的克隆动物，但是其效率 非常低，而且核移植产生的个体在发育中可能出现异常，因此限制了该方法的应用。
(2) 细胞融合不同细胞间的融合是研究分化细胞可塑性的常用手段，在大多数"杂交"细胞中， 参与融合的分化程度较低的细胞处于支配地位，而分化程度高的细胞失去了原有的细胞特性 转而表达分化程度较低的细胞的特性，如将体细胞与胚胎配子细胞(Embryonic germ， EG)或者 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ES)以一定的比例混合培养后筛选出融合的细胞，这些融 合产生的"杂交"细胞的表型呈现EG或者ES细胞的特征。同样，利用细胞融合进行分化细胞的 效率非常低，大约为万分之一，而且在这个过程中会产生异倍体。
(3) 特殊成分培养液诱导终末分化的鼠肌源性定向谱系成肌细胞C2C12可以在2， 6位取代嘌 呤的诱导下或者额外表达Msxl基因的条件下再程序化为间充质前体细胞，随后增殖再分化为 骨和脂肪细胞。少突前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells， OPCs)依次经胎牛血清血清或 者骨形态发生蛋白(Bone morphogenic proteins, BMPs)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)处理后能够再程序化形成多能的CNS干细胞。但是这些化合物或者因子 的应用只局限于特定种类的细胞，通用性差。
(4) 转录因子组合转录因子组合诱导成纤维细胞或者皮肤细胞发生再程序化是目前最热门 的研究领域之一，常用的转录因子组合主要包括Oct-4、 Sox-2、 c-myc和Kl傳，而导入基因的 主要方式则是通过腺病毒或者慢病毒载体。经过这种方法获得的细胞的特性与ES细胞类似因 此被称为诱导的全能性干细胞(inducedpluripotent stem cells, iPS)。但是，对这些杂核后代的研 究发现，这些细胞具有致瘤性，可能是由于利用逆转录病毒作为载体以及转入原癌基因c-myc 带来的潜在危险，除此之外制备iPS的效率非常低，不是所有的iPS都具有发育的全能性；iPS 向特定细胞诱导分化的效率低，分化的细胞中含有不等量的杂细胞。
(5) 全能性细胞细胞裂解液全能性细胞—胚胎癌细胞(Embryonic Carcinoma, EC)和ES细胞的 细胞核和胞浆提取液(ES细胞或EC细胞用裂解液(lOmM HEPES， pH8.2, 50mM NaCl， 5 mM MgCl2, lraM二硫苏糖醇，蛋白酶抑制剂)处理后经反复冻融，超声波裂解后，离心或过滤后除去不溶性的细胞成分后使用，因其中己经不含有完整的细胞，在有些文献中这些提取液也 被称为cell free extracts,但是这种提取液的本质还是将细胞裂解后提取的可溶性的产物，和 本发明所述培养培养上清是有本质区别的，本发明所述培养培养上清是完全不含细胞的，就 是细胞分泌的生长因子等成分)可以使人成纤维细胞发生再程序化，而表达ES或EC细胞的部 分特性和功能。但是该方法具有一定局限性蛋白进入细胞内需要使用链球菌溶血素(SLO) 在细胞膜上可逆性的打孔，对细胞有一定的毒性，并且需要的蛋白量也比较大(20-30mg/mL)， 操作过程复杂，效率低；细胞只能被诱导成类ES细胞，可控性差，具有致瘤性，向特定终末 分化细胞分化的效率低。 (6)病毒或端粒酶转染细胞转染SV40及劳氏肉瘤病毒基因或者端粒酶催化亚单位(hTERT) 后可以实现"永生化"。但是细胞在转染癌基因之后，部分细胞的表型容易发生改变，少数 细胞系甚至有潜在的致瘤性，培养过程中部分细胞有病毒颗粒的释放。而端粒酶转染后的细 胞在体外长期生长后，形态学，基因型，核型和分子水平都发生了改变
组织工程对所需的种子细胞的最基本要求就是扩增快，效率高。上述列出的前五种方法 存在一个共同点，即这些处理在增强细胞活性的同时却改变了原有细胞的特性，而且效率低，
需要重新诱导为需要的靶细胞，才能够应用。并且获得的类ES细胞或者iPS可能存在致瘤性 而限制了其临床应用。而通过转染方法获得的细胞，虽然可以增殖，但是由于转染过程使用 的多是病毒载体，或者本身转染的就是病毒，也存在潜在的安全性问题，而本身这种转基因 操作可能会将外源基因转入受体的基因组而干扰其原有DNA的序列。因此如何在保持原有 细胞特性的基础上实现种子细胞的快速高效扩增已经成为组织工程亟待解决的重大课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进体细胞增殖的方法，该方法在保持细胞原有特性的基础 上能有效地增强体细胞增殖能力，延缓体细胞衰老。 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案
一种促进细胞增殖的方法，所述方法为利用来自商品的人或动物的胚胎干细胞培养后的 上清液培养体细胞或干细胞与体细胞共培养。
所述胚胎干细胞为同种和/或异种干细胞，所述胚胎干细胞培养后的上清液为原液、稀释 液、浓縮液或干粉。
所述的体细胞包括但不仅限于人、动物的角膜上皮细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、皮 肤细胞、肝细胞及心肌细胞等在体外扩增困难的细胞。所述共培养为同种和/或异种的胚胎干细胞与细胞直接接触培养或同种和/或异种的胚胎 干细胞与细胞通过液体交换的介质间接接触培养。
上述将体细胞与胚胎干细胞直接接触共培养的方法包括将两种细胞混和后培养，以及将一
种细胞种植后再接种另一种细胞。
共培养中的干细胞和体细胞中的一种是经过荧光染料标记的细胞。上述共培养的细胞可以 通过传代过程而进行分离(增殖受到抑制的细胞随传代而逐渐消失)，也可以通过利用荧光染 料的特性进行分离(将荧光阳性和荧光阴性细胞分离)，还可以根据细胞特性不同而得到分离。 共培养中的胚胎干细胞是经过物理和/或化学方法抑制增殖的细胞。所述抑制干细胞增殖 的方法为用2 mM丝裂霉素C处理0.5-5小时，或用Y射线照射0.5-5小时，或用1%的多聚 甲醛处理0.5-5小时。
本发明是一种利用胚胎干细胞微环境延缓体细胞衰老过程、促进体细胞增殖的方法。在 实际应用中，以往研究者或者是将体细胞和干细胞共培养以诱导干细胞发生定向分化(Wang, Z, C, et al. Preliminary experimental study on commitment differentiation of embryonic stem cells induced by corneal limbal stoma in vitro. Eye Science 1999,15(4), 195-198; Wang, Z. C., et al Differentiation of embryonic stem Cells into corneal epithelium. Science In China Ser. C Life Sciences 2005, 48(5)， 471-480.)，或者是在细胞可塑性的研究中，利用细胞间自然发生的融合作用，使分化程度高 的细胞获得分化程度低的细胞(一般为干细胞，原癌细胞，配子细胞等)的特性(TadaM,et al.1997; 2001; 2003)，却并未有人报道在不改变原有细胞特性的基础上利用胚胎干细胞微环 境来促进细胞的增殖，这也是本发明的最大创新。本发明的最大创新在于在保持细胞原有生 物学特性的基础上实现了细胞的快速，高效扩增，使从小块组织扩增细胞成为可能，将为组 织工程研究提供充足的种子细胞。本发明促进体细胞增殖的方法简单实用，效率高，纯度高。 经过处理的体细胞，在增殖活性提高的同时保持了原有的体细胞特性，用于体内移植或者体 外组织工程化器官的构建时没有异源排斥问题。
图1是干细胞培养后的上清液连续培养后的人角膜上皮细胞的部分生物学特性； 图2是干细胞培养后的上清液连续培养后的兔角膜上皮细胞的部分生物学特性； 图3是干细胞培养后的上清液连续培养后的兔结膜上皮细胞的部分生物学特性； 图4是干细胞培养后的上清液连续培养后的猫角膜内皮细胞的形态；
6图5是干细胞培养后的上清液连续培养后的兔皮肤细胞的形态； 图6是与干细胞直接接触培养对人角膜上皮细胞增殖的影响； 图7是与干细胞间接接触培养对人角膜上皮细胞增殖的影响； 图8是细胞的功能恢复情况。
具体实施例方式
本发明胚胎干细胞培养后的上清液的应用方式包括在体外添加到培养液中促进体细胞生 长、增殖、快速扩增、建系、为组织工程器官构建提供种子细胞；以适当的浓度制成药品后 注射到体内细胞受损部位，滴加到身体表面细胞受损部位及将其制成化妆品延缓及抵抗皮肤衷老。
胚胎干细胞与体细胞共培养的方式包括直接接触培养，或者通过可以发生液体交换的介 质进行培养。
本发明从体细胞的生物学特性、安全性等方面进行了系统研究，进行了促进人和兔的角 膜上皮细胞、兔结膜上皮细胞、兔内皮细胞衰老过程的实验，以及制成滴眼液治疗干眼的实 验。结果都显示本发明方法能够延缓体细胞的衰老过程，促进体细胞增殖。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
小鼠E14胚胎干细胞(美国模式菌种收集中心，ATCC CRL-1821)， GFP标记的小鼠胚胎 干细胞(OriCellTMC57BL/6小鼠胚胎干细胞/GFP， Cyagen Biosciences),人胚胎干细胞 (OriCeirM人胚胎干细胞，Cyagen Biosciences),人GFP标记的胚胎干细胞(OriCeirw人 胚胎干细胞/GFP， Cyagen Biosciences)。
以下实施例中所用的ES细胞培养液为高糖Knockout DMEM培养基(Gibco BRL)或者高 糖DMEM培养基(GibcoBRL)，添加5-15% (体积比)胎牛血清(Hyclone) 、 100U/mL青链霉素 (Sigma) 、 1% (体积比)谷氨酰胺替代物(Glutamax-I' Invitrogen)、 100umol/L 2-巯基 乙醇(Sigma)、白血病抑制因子(LIF) 1X106IU/L (Mill印ore)、 1% (体积比)非必需氨 基酸(Gibco BRL)
以下实施例中所用的干细胞培养后的上清液的制备方法以IX 104-IX 105个/1^细胞密 度接种小鼠E14胚胎干细胞(美国模式菌种收集中心，ATCCCRL-1821)于0. 1%明胶(Sigma) 包被的培养瓶(BD)中，置5^C02、 37'C培养箱内培养，每日半量换液，2-3天传代。培养 每24h后取上清，1500r/min离心后用0. 22 n m微孔滤膜过滤除菌，即为胚胎干细胞培养上 清。实施例1:利用胚胎干细胞培养后的上清液促进角膜上皮细胞增殖 取材并用角膜上皮细胞培养液(高糖DMEM基础培养基(Gibco BRL)，添加10-15%% (体 积比)胎牛血清、5ug/mL胰岛素(Gibco BRL)、 5ug/mL转铁蛋白(Simga)、 10ug/raL表 皮生长因子(EGF) (Gibco BRL)、 100U/raL青链霉素(Simga)、 1% (体积比)Gluta腿x-1、 400 ng/mL氢化可的松(Gibco BRL)、 1% (体积比)非必需氨基酸(Gibco BRL)培养人和 兔角膜上皮细胞，从PI代细胞开始在角膜上皮培养液中添加10-50%(体积比)的小鼠胚胎干 细胞培养后的上清液(原液)，进行连续培养。
测定利用胚胎干细胞培养后的上清液连续培养后的角膜上皮细胞的生物学特性。结果显 示(1)在倒置相差显微镜下，干细胞培养后的上清液培养的Pl人角膜上皮细胞增殖更快， 形态更典型，细胞仍然表达角膜特异性标记物CK3/CK12，处于S期的细胞更多(图l)。 (2) 研究结果显示经过ES上清液处理的细胞增殖能力明显增强，在体外可以连续传代，形态 规则，大小均一，并表达特异性的标记物(图2)。
图1为胚胎干细胞培养后的上清液连续培养后的人角膜上皮细胞的部分生物学特性。 A:倒置相差显微镜下常规角膜上皮培养液培养的人角膜上皮细胞的形态(Pl，培养IO
天)；
B:倒置相差显微镜下干细胞培养后的上清液连续培养后的人角膜上皮细胞的形态(PI, 培养10天)；
C: MTT法测定的PI细胞的生长曲线；
D:干细胞培养后的上清液培养的人角膜上皮细胞CK3/CK12 (角膜特异性细胞表面标 记物)呈阳性表达；
E:干细胞培养后的上清液培养的人角膜上皮细胞CK19 (增殖相关的细胞表面标记物) 呈阳性表达；
F:常规角膜上皮培养液培养的人角膜上皮细胞(P5)的细胞周期分析；
G:干细胞培养后的上清液培养的人角膜上皮细胞(P5)的细胞周期分析。
图2为干细胞培养后的上清液连续培养后的兔角膜上皮细胞的部分生物学特性。对照组
为常规角膜培养液培养的细胞，处理组为干细胞培养后的上清液连续培养后的细胞。
A-I:倒置相差显微镜下培养的兔角膜上皮细胞的形态，A-F为P1细胞，G-I分别为处
理组PIO、 P20、 P40细胞，％为添加的干细胞培养后的上清液浓度。
J: PI细胞表面标记物(CK3， CK12， P63， ABCG2) mRNA表达的RT-PCR分析，持家基因GAPDH作为阳性对照
K: MTT法测定的细胞的生长曲线 L:细胞的克隆形成能力分析。 M:克隆的形态
N:细胞表面标记物(CK3/CK12, P63， ABCG2)表达的免疫荧光检测结果。
实施例2:利用胚胎干细胞培养后的上清液促进结膜上皮细胞增殖
取材并利用常规结膜上皮细胞培养液(高糖DMEM: F12-3: 1基础培养基(Gibc。)，添加 5-15% (体积比)胎牛血清、lOixg/mL表皮生长因子(EGF) (Gibco BRL)、 lOOU/mL青链霉 素(Simga)，从P1代细胞开始添加用常规结膜上皮细胞培养液稀释的小鼠胚胎干细胞培养后 的上清液(稀释为10%-50%，体积比)，进行连续培养。
结果显示干细胞培养后的上清液能够促进结膜上皮增殖，在形态上，ES上清液处理的 细胞呈典型的多边形，细胞形态规则(图3)。
图3为干细胞培养后的上清液连续培养后的兔结膜上皮细胞的部分生物学特性，其中， A:常规结膜培养液培养的P2结膜细胞的形态 B:干细胞培养后的上清液连续培养后的P2结膜细胞的形态 C: MTT法测定的细胞的生长曲线(P2) D:结膜细胞表面标记物的表达的免疫荧光检测结果
实施例3:利用干细胞培养后的上清液促进角膜内皮细胞增殖
将收集的小鼠胚胎干细胞培养后的上清液分装后利用真空冷冻冻干机完全冻干，_2(TC 保存备用。
取材并用常规内皮细胞培养液高糖DMEM: F12=3: 1基础培养基(Gibco)，添加5-15% (体积比)FBS,硫酸软骨素(lug/ml) ，bFGF(lng/ml)， EGF(10ug/roL), NGF(5ng/ml), 100U/raL 青链霉素(Siraga)、 1°/。(体积比)Glutamax-1、 1% (体积比)非必需氨基酸(Gibco BRL)培 养猫角膜内皮细胞(在体外几乎没有增殖活性的细胞)，从P1代细胞开始在100mL常规内皮 细胞培养液中添加1-lOOmg冻干的小鼠胚胎干细胞培养后的上清液干粉，进行连续培养(6 代)。
结果显示干细胞培养后的上清液能够促进猫内皮细胞增殖，在形态上，干细胞培养后
9的上清液处理的细胞呈典型的多边形，细胞形态更规则(图4)。经过6代体外培养，干细胞 培养后的上清液处理的细胞扩增了约100倍，而常规培养的细胞仅扩增了大约30倍。
图4为干细胞培养后的上淸液连续培养后的猫角膜内皮细胞的形态，其中， A:常规角膜内皮培养液培养的P3内皮细胞的形态 B:干细胞培养后的上清液连续培养后的P3内皮细胞的形态。 实施例4:利用千细胞培养后的上清液促进皮肤细胞增殖
将收集的小鼠胚胎干细胞培养后的上清液分装后利用真空冷冻冻干机冻干1-2倍，-20 'C保存备用。
取材并用角质细胞培养液K-SFM (Gibco)培养兔皮肤细胞(在体外几乎没有增殖活性的 细胞)，从Pl代细胞开始在K-SFM中添加2. 5%-25%(体积比)的小鼠胚胎干细胞培养后的上清 液(浓缩液〉，进行连续培养。
结果显示干细胞培养后的上清液能够促进兔皮肤细胞增殖，在形态上，干细胞培养后 的上清液处理的细胞形态更规则，更典型(图5)。
图5干细胞培养后的上清液连续培养后的兔皮肤细胞的形态，其中， A: K-SFM培养液培养的P2皮肤细胞的形态； B:干细胞培养后的上清液连续培养后的P2皮肤细胞的形态。
实施例5:利用与千细胞直接接触培养的方法促进角膜上皮细胞增殖(注本实施例所 用的胚胎干细胞可以是同种和/或异种干细胞，体细胞可以为任何代数，效果与以下相同)
取材并培养人角膜上皮细胞，将人角膜上皮细胞与绿色荧光蛋白(GFP)标记的ES细胞 (GFP-ES)直接接接触培养，培养1代后，利用流式细胞仪分离荧光阴性细胞。
结果显示；与胚胎干细胞直接接触共培养的人角膜上皮细胞体积变小，核浆比变大，形 态也变得比较规则，更接近原代从角膜缘萌出的细胞。流式细胞仪分选前荧光阴性率为4. 2%， 分选后阴性率为92.2% (图6)。
图6为与干细胞直接接触培养对人角膜上皮细胞增殖的影响，其中， A:倒置相差显微镜下观察的人P3角膜上皮细胞与绿色荧光蛋白标记的干细胞直接接触后的 形态；
B:荧光显微镜下干细胞克隆；
C:流式细胞仪分选前荧光阴性细胞比例(4.2%);
D:流式细胞仪分选后荧光阴性细胞比例(92.2%)。
10实施例6:利用与经过物理和/或化学方法抑制增殖后的干细胞共培养的方法促进角膜上皮细 胞增殖(注本实施例所用的胚胎干细胞可以是同种和/或异种干细胞，体细胞可以为任何代 数，效果以下相同)
1. 按常规方法取材并培养兔角膜上皮细胞；
2. 按常规方法培养小鼠ES细胞达到80%融合后，用2mM丝裂霉素C抑制细胞增殖 0.5-5小时后，用无菌PBS充分洗涤5 — 6次；(也可以用Y射线照射0.5-5小时后； 或者用1%多聚甲醛抑制细胞增殖0.5-5小时后)，用PBS充分洗涤；
3. 将角膜上皮细胞种植在经过处理的ES细胞上继续培养至80%细胞融合；
4. 根据细胞扩增情况和生长状态决定是否继续将角膜上皮细胞种植在经过处理的ES 细胞上；
5. 由于经过处理的ES细胞失去了继续增殖能力，最终可以通过连续传代的方法将ES 细胞逐渐除掉。
虽然ES细胞经过处理后失去了连续增殖能力，但是仍然能够其分泌的生长因子影响与 其共培养的细胞，而不会发生细胞融合。
实施例7:利用与千细胞间接接触培养的方法促进角膜上皮细胞增殖
1. 按常规方法取材并培养人角膜上皮细胞；
2. 将小鼠ES细胞种植在六孔板底部或者下表面；铺上1-5层细胞外基质成分(包括但 不仅限于I型胶原，IV型胶原，层粘联蛋白，丝粘联蛋白)，将P1代角膜上皮细胞 种植在Tmnswell膜上(BD)(使用角膜上皮完全培养液)，将Transwell膜置于六孔 板中，继续培养2-6天。ES细胞种植于培养板底部，而角膜上皮细胞种植在Transwell 膜上，由于ES细胞和角膜上皮细胞之间隔了一层Transwell膜，两种细胞不能相互 直接接触而避免了细胞融合，但可以通过分泌的生长因子相互影响。而两种细胞之 间的介质包括但不仅仅限于Transwell膜，也可以使用热敏膜，羊膜等可以发生液体 交换的介质。
结果发现:与干细胞间接接触培养的人角膜上皮细胞增殖速度更快，形态也更典型(图7)。
图7为与干细胞间接接触培养对人角膜上皮细胞增殖的影响，其中， A:与干细胞间接接触培养的人角膜上皮的形态，人角膜上皮细胞种植于Transwell膜上， ES细胞种植于6孔板上，100x。
11B:正常培养的人角膜上皮细胞的形态，100x。 实施例8:细胞的功能恢复和安全性检验
通过本发明所处理的兔角膜上皮细胞，在体外气一液界面刺激下可以形成复层上皮，注 射到Balb/c裸鼠皮下不致瘤。证实本发明不但可以维持细胞正常的功能，还具有安全性。
功能恢复试验-
以实施例1方法获得的P20代兔角膜上皮细胞，以3.5xl()S个/ral的密度接种到脱细胞猪 角膜基质上，细胞培养箱中静置培养。当细胞融合后，利用气-液界面培养3周后，HE染色 可见细胞能够形成2-3层的复层，下层细胞比较圆，上层细胞逐渐变得扁平。扫描电镜下可 见细胞呈重叠的多层结构，细胞表面有丰富的微绒毛和伪足(图8)。
图8为细胞的功能恢复情况，其中
A:接种于Transwell培养池48h后角膜上皮细胞形成单层。标尺100um B:气-液界面培养IO天后角膜上皮细胞的形态。标尺100um
C:复层上皮表面的扫描电镜分析。标尺10umD:接种于猪脱细胞角膜基质上的角膜上
皮细胞形成的复层上皮的HE染色结果
E:形成的复层上皮呈CK3/CK12阳性表达。标尺20um F:形成的复层上皮呈P63阴性表达。标尺20um G:形成的复层上皮呈ABCG2阴性表达。标尺20咖。
安全性检验
以实施例1方法获得的P20代兔角膜上皮细胞，以5><106个/[111的密度接种到Balb/c裸 鼠腹股沟皮下。接种后，未见有明显不良反应。饲养80天后，颈背部皮下组织未见有肿瘤生 长。处死裸鼠后，经大体解剖未见接种部位皮下组织有结节和肿块，肝脏，肺脏，肾脏和脾 脏未见明显病理性改变。
权利要求
1. 一种促进体细胞增殖的方法，其特征在于所述方法为将来自商品的人和/或动物的胚胎干细胞培养的上清液培养体细胞；或所述方法为不改变原有细胞的特性的情况下将来自商品的人和/或动物的胚胎干细胞与体细胞共培养。
2. 根据权利要求1所述的促进体细胞增殖的方法，其特征在于所述胚胎干细胞为同种和/ 或异种胚胎千细胞，所述干细胞培养后的上清液为原液、稀释液、浓缩液或干粉。
3. 根据权利要求1所述的促进体细胞增殖的方法，其特征在于共培养中的胚胎干细胞和 体细胞中的一种是经过荧光染料标记的细胞。
4. 根据权利要求1所述的促进体细胞增殖的方法，其特征在于共培养中的胚胎干细胞是 经过物理和/或化学方法抑制增殖的细胞。
5. 根据权利要求4所述的促进体细胞增殖的方法，其特征在于所述抑制胚胎干细胞增殖 的方法为用丝裂霉素C处理0.5-5小时，或用Y射线照射0.5-5小时，或用多聚甲醛处理 0.5-5小时。
6. 根据权利要求1所述的促进体细胞增殖的方法，其特征在于所述体细胞选自但不限于 角膜细胞、结膜细胞、内皮细胞、皮肤细胞、肝细胞或心肌细胞。
全文摘要
本发明公开了一种促进体细胞增殖的方法，所述方法为利用干细胞培养后的上清液培养体细胞或干细胞与体细胞共培养。该方法简单实用，效率高，纯度高。经过处理的体细胞，在增殖活性提高的同时保持了原有的体细胞特性，用于体内移植或者体外组织工程化器官的构建时没有异源排斥问题。
文档编号C12N5/08GK101497874SQ200910037590
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者颖 刘, 王智崇, 冬 陈 申请人:中山大学中山眼科中心