专利名称：：Braf基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体的是涉及BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。
背景技术：
：BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体Bl，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调节细胞的生长、增值和凋亡。现在己普遍认同的是BRAF基因第15外显子上的T1799A突变导致BRAF蛋白产物的600残基中的缬氨酸被谷氨酸替代(V600E)，进而持续激活BRAF激酶，造成MAPK通路持续活化，细胞无限制分裂、增值。。BRAF基因突变其它位点出现的频率较低，据报道BRAF突变率为15%左右，且90%以上为外显子15的V600E突变。目前，很多实验室在对BRAF基因研究分析中，会碰到例如检测的灵敏度和特性都很低的困难。已经建立的BRAF基因突变检测技术，主要是PCR—测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用最广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20%—25%，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性也差，对于要求高时效性和高灵敏度临床检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其灵敏度可以达到1%—2%，检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了髙通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。
发明内容本发明的目的之一在于提供BRAF基因外显子15突变检测的探针序列。用于服AF基因外显子15突变检测的探针包括有选自于SEQIDNO.1SEQIDN0.2任一种的、针对外显子15的野生型探针，和选自于SEQIDNO.3SEQIDN0.4任一种的、针对外显子15的突变型探针。本发明的另一目的是提供BRAF基因外显子15突变检测液相芯片。实现上述目的的技术方案如下-一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有(A)包被有碱基序列选自于SEQIDNO.lSEQIDN0.2任一种的、针对外显子15野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQIDN0.3SEQIDN0.4任一种的、针对外显子15突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及(B)用于扩增出具有BRAF基因外显子15突变位点的目标序列的引物，该引物带有酶切位点，且扩增到的目标序列的末端具有生物素标记。以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n>3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5—30个T。优选地，用于扩增出具有外显子15突变位点的目标序列的引物为包括有两轮PCR引物，第一轮PCR引物带有酶切位点，两轮PCR引物中至少有一条带有末端的生物素标记。更优选为，第一轮PCR引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6序列，第二轮PCR引物为SEQIDNO.5和SEQIDN0.7,所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。本发明的另一目的还在于提供一种BRAF基因外显子15突变的检测方法，该方法具有快速、准确、操作简便等优点。一种BRAF基因外显子15突变的检测方法，使用上述的BRAF基因外显子15突变检测液相芯片，包括以下步骤(1)将待测样木DNA用带有酶切位点的PCR引物进行第一轮PCR扩增；(2)将步骤(1)中的PCR扩增后的产物用内切酶进行酶切；6(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的BRAF基因进行第二轮PCR扩增；得到具有外显子15突变位点的目标PCR扩增后产物，且产物的末端具有生物素标记；(4)第二轮PCR扩增产物与上述相应的包被有探针的微球进行杂交；(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后进行信号检测。本发明的主要优点在于(1)采用本发明提供的BRAF基因外显子15突变检测液相芯片，检测结果特异性好，灵敏度高，检测准确度达99%以上。(2)本发明的检测方法步骤简单，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，可用于分析组织样品中的DNA,也可分析体液中的DNA。(3)本发明所提供的检测方法和液相芯片所需要的检测时间远远低于常用的测序技术。(4)本发明采用酶切富集的方法进行目标序列的PCR扩增进而用于检测，避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰。图lBRAF基因外显子15野生型TspRI酶切示意图；图2BRAF基因外显子15突变型TspRI酶切示意图。具体实施例方式BRAF基因突变是一种体细胞突变，突变检测受大量野生型基因的干扰，因此本发明的除了设计到能有效检测BRAF基因突变的探针外，另一个关键问题是如何检测出核酸中受大量野生型基因干扰的极少量BRAF突变性序列。如可排除野生型序列对检测的干扰是研发首要解决的一个关键问题。设计两对PCR引物，其中，第一轮PCR引物带有内切酶酶切位点。为使最终扩增产物带上生物素标记，可使引物带有末端的生物素标记，也可以在第二轮PCR反应过程中掺入生物素标记的dCTP,本发明实施例中优选为使引物带有末端的生物素标记。本发明采用酶切富集方法，先用一轮PCR同步扩增野生和突变序列，然后通过酶切去除大量的野生型基因，再用二轮PCR扩增突变型基因，从而达到富集突变型序列的目的，然后用液相芯片技术检测BRAF基因外显子15突变型。本发明需要用到的主要材料溶液配方偶联液(pH4.5):0.lmol/LMES(SigmaM-2933)洗涤液0.2ml/LTween-20(SigmaP-9416)，lg/LSDS(SigmaL-4390)TE(pH8.0)(储存液):10mmol/LTris(Sigma337501),l腿ol/LEDTA(SigmaE-5134)2XTm杂交缓冲液试剂来源终浓度每250ml的用量lMTris-HCl,pH8,0SigmaT30380.2M50ml5MNaClSigmaS51500.4M20ni1TritonX-100SigraaT87870.腦0.4ral过滤后贮存于4°C。实施例lBRAF基因外显子15突变检测液相芯片的制备一、探针序列设计及微球包被8针对BRAF外显子15的野生型与突变型序列，设计特异的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针序列合成时，加上一段5—30个T的间隔臂序列(通常为10个T，效果与5—30个T一致)每种微球包被的具体步骤如下(按常规方法进行)(1)取微球母液(购自Luminex公司)涡旋振荡成微球悬液；(2)取出8ul微球母液，共含0.8X1()5—1.2X105个微球至0.5ml离心管中；(3)10,OOOrpm离心3min，弃去上清液；(4)加入10ul偶联液(pH4.5)，充分混匀；(5)加入2pmol/ul探针工作液2ul;(6)加入2.5ul浓度为5mg/ml的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐)工作液，25。C孵育30min;重复该步骤一次；(7)加入0.2ml洗涤液，充分混匀，12，000g离心3min，弃去上清液；重复该步骤一次；(8)加入500ulTE溶液，充分混匀；(9)12，000g离心3min，弃去上清液;(10)加入20ulTE溶液，储存于2-8'C。制备得到的BRAF基因外显子15突变检测液相芯片包括有两种包被有野生型探针的微球和两种包被有突变型探针的微球，使用时选择其中的一对包被有野生型探针和突变型探针的微球液相芯片既可用于检测。A.包被探针的微球，每种微球包被的探针的碱基序列如下:微球号探针名称探针碱基序列SEQ.IDNO.9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>B.引物用于扩增出富集有BRAF基因外显子15需检测的相应突变位点的目标序列的引物，且扩增出的目标序列的末端可具有生物素标记，每种引物的碱基序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2运用BRAF基因突变检测液相芯片对临床样本的检测一、待测样本的准备参照AxyPr印提取试剂盒说明提取核酸，得到10例待检测的DNA样品。二、待测样品的PCR扩增与酶切富集(1)第一轮PCR扩增PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5XBuffer102.5mMdNTP混合液2MgCl225mM5引物F:B15F(10uM)1引物R:B15R1(lOuM)1Taq酶(5U/ul)0.2模板DNA2总体积50PCR反应条件:(2)PCR产物TspRI酶切:反应体系如下样品体系(6(TC温育2小时)步骤温度时间循环数预变性94°C3tnin1变性94°C20sec25循环退火58°C30sec延伸72'C20sec最后延伸72°C10min保存4°C1每反应(nl)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>三、杂交及Luminex检测(1)配制微球工作液将实施例1中，包被有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2针对BRAF基因密码子15的野生型氨基修饰探针的微球和包被有SEQIDNO.3和SEQIDNO.4针对BRAF基因密码子15的突变型氨基修饰探针的微球(野生型氨基修饰探针和突变型氨基修饰探针组成不同探针组)，涡旋震荡成微球悬液，随即取出所需微球到灭菌离心管中(每反应0.5ul，其中每种微球为2000个/ul)，加入1.5X杂交液缓冲液(每个反应32.5uI)和TE缓冲液(每个反应14ul)，此为微球工作液；(2)根据样品情况，使用记号笔对96孔板(杂交板)进行标记(阴性对照孔标记为"N")，然后每孔加入47ul微球工作液；(3)各样品孔加入3ul相应的待杂交检测样品(第二轮PCR产物)"N"孔加入3ulTE;(4)置杂交板于PCR仪中，95。C变性3rain;55°C—60。C杂交15min;(5)往杂交完毕的杂交板中加入SA-PE工作液(10ug/ml),每孔25ul;(6)置PCR仪上60。C反应5niin;(7)按Luminex仪器使用方法设置仪器参数(每个样品读取微球100个，读数时间25s)。将杂交板置于Luminex仪器托盘中，检测样品MFI值。四、检测结果与数据分析反应后产物通过Luminex序列分析仪器检测，检测结果如表1所示。以荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当突变型探针的MFI值大于100时，判定该样本为存在外显子15的V600E突变，否则判定该样本为外显子15野生型。根据上述判定标准，本实施例所检测的10份样本中，2例存在外显子15点突变(3号，5号样本)。实验结果显示，液相芯片检测的分析结果与用直接测序检测分析的结果一致，即例样本中存在2例外显子15的点突变V600E(3号，5号样本)。说明本发明所提供的用游离核酸进行BRAF基因突变检测的方法是可行的，也说明本发明所提供的液相芯片和方法是稳定可靠的；如表1和表2所示，不同探针组的检测结果和分析结果是一致的，即10例样本中存在2例外显子15的点突变V600E(3号和5号样本)。说明本发明所提供的两组探针(SEQIDNO.1和SEQIDNO.3;SEQIDNO.2和SEQIDNO,4)进行BRAF基因突变检测的方法是可行的，也说明本发明所提供的探针是准确可靠的。表l样本的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>SEQIDNO.2;21949588334335907突变型42345158SEQIDNO.35173218516251058557219027182965754932916451019124159表2样本BRAF基因外显子15突变类型分析结果探针组类型样本号测序分析结果液相芯片分析结果1野生型野生型2野生型野生型野生型SEQIDNO.1;3V600E点突变V600E点突变4野生型野生型5V600E点突变V600E点突变突变型SEQIDNO.36野生型野生型7野生型野生型8野生型野生型9野生型野生型10野生型野生型野生型1野生型野生型SEQIDNO.2;2野生型野生型3V600E点突变V600E点突变突变型4野生型野生型SEQIDNO.45V600E点突变V600E点突变6野生型野生型16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>序列表<110〉广州益善生物技术有限公司〈120〉BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法〈160〉9〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>23〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉1tctagctacagtgaaatctcgat23〈210〉2〈211〉23<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉2ctagctacagtgaaatctcgatg23〈210〉3<211〉23〈212〉■〈213〉人工序列〈400〉3tctagctacag3gaaatctcgat〈210〉4<211〉23〈212>DNA<213〉人工序列〈400〉4ctagctacagagaaatctcgatg〈210〉5〈211〉23〈212〉醒〈213〉人工序列〈400〉5tcataatgcttgctctg3tagga<210〉6〈211〉23<212〉醒〈213>人工序列〈400〉619tagcctcaattcttaccatccac23〈210〉7〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉7aC33CtgttC333Ctg3tggg3C2权利要求1.用于BRAF基因外显子15突变检测的探针，其特征是，包括有选自于SEQIDNO.1～SEQIDNO.2任一种的、针对外显子15的野生型探针，和选自于SEQIDNO.3～SEQIDNO.4任一种的、针对外显子15的突变型探针。2.—种BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)包被有碱基序列选自于SEQIDNO.1SEQIDNO.2任一种的、针对外显子15野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQIDN0.3SEQIDN0.4任一种的、针对外显子15突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及(B)用于扩增出具有BRAF基因外显子15突变位点的目标序列的引物，且扩增到的目标序列的末端具有生物素标记。3.根据权利要求2所述的BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，(B)中所述引物包括有两轮PCR引物，第一轮PCR引物带有酶切位点，两轮PCR引物中至少有一条带有水端的生物素标记。4.根据权利要求3所述的BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述第一轮PCR引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6序列，所述第二轮PCR引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.7，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。5.根据权利要求2—4任一项所述的BRAF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5—30个T。6.—种BRAF基因突变的检测方法，其特征是，使用权利要求l一5任一项所述的BRAF基因突变检测液相芯片，包括以下步骤(1)将待测样本DNA用带有酶切位点的PCR引物进行第一轮PCR扩增；(2)将步骤(1)中的PCR扩增后的产物用内切酶进行酶切；(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的BRAF基因进行第二轮PCR扩增；得到具有外显子15突变位点的目标PCR扩增后产物，且产物的末端具有生物素标记；(4)第二轮PCR扩增产物与所述相应的包被有探针的微球进行杂交；(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后进行信号检测。7.根据权利要求6所述的BRAF基因外显子15突变的检测方法，其特征是，所述第一轮PCR引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6序列，第二轮PCR引物为SEQIDNO.5和SEQIDNO.7，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。8.根据权利要求6所述的BRAF基因外显子15突变的检测方法，其特征是，所述步骤(4)中的杂交温度为55—6(TC。全文摘要本发明公开了一种检测BRAF基因外显子15突变的核酸探针、液相芯片及检测方法。所述BRAF基因外显子15突变检测液相芯片，包括有包被有氨基修饰的针对BRAF基因外显子15的野生型和突变型探针的微球，以及用于扩增出富集有BRAF基因外显子15需检测的突变位点的、末端具有生物素标记目标序列的引物。本发明所提供的方法快速，准确，操作简便，大大提高检测效率。文档编号C12Q1/68GK101487051SQ20091003735公开日2009年7月22日申请日期2009年2月24日优先权日2009年2月24日发明者朱泽尧,许嘉森,玲陈申请人:广州益善生物技术有限公司