专利名称：菊花滑刃线虫的检测方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测或鉴别菊花滑刃线虫的方法以及一种可检测菊花滑刃线虫的诊断试剂盒。
背景技术：
菊花滑刃线虫(Aphelenchoides ritzemabosi)是花卉重要的植物寄生线虫病害 之一，其寄主广泛，能在观赏植物、蔬菜类、小果类和杂草等200多种植物上寄生。该线虫主 要危害叶片，同时也能侵染花芽和花。该线虫除危害菊花外，还危害翠菊、金光菊、大丽菊、 百日草等多种菊科植物，以及茄科植物或罂粟科植物，或烟草、草莓、珠兰、百合、蒲包花、飞 燕草、夹竹桃等作物或花卉。被害株叶片枯死，开花不好或不能开花，重则整株变黑，最终导 致植株枯死。菊花滑刃线虫分布广泛，在日本、美国菊花叶线虫病被认为是菊花的灾难性病 害。全世界有75个国家在菊花上发现这种病害，损失率达12.3%，因而被我国列为对内对 外重要的检疫线虫。菊花滑刃线虫主要是种苗带病传播，一旦侵入植株就难以用药剂防治，只能及时 拔除，集中烧毁，因此防治的主要措施是通过检疫进行隔绝。然而，目前的检测手段主要是 用直接浸泡法或贝曼漏斗法分离线虫，然后镜检，根据菊花滑刃线虫的形态特征进行判断。 这种方法存在一定的弊端，主要表现在一、菊花滑刃线虫属于滑刃线虫属，滑刃线虫种类 繁多，通常鉴定的样品中会有多种形态相似的线虫，这就要求鉴定者具有丰富的经验；二、 线虫个体间存在差异，这需要有足够的鉴定样本；三、形态学鉴定只适用于成虫，而对于幼 虫不适用。因此，研究出对菊花滑刃线虫快速、准确的检测方法实为必要。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种快速、准确地检测出菊花滑刃 线虫的方法。本发明的另一目的在于提供菊花滑刃线虫诊断用试剂盒。为实现上述目的，本发明提供的菊花滑刃线虫的检测方法包括(a)从可疑植物材料或土样中分离出待检测线虫，提取DNA ；(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2的引物， 进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物，根据检测结果判断菊花滑刃线虫的存在。优选地，步骤(c)中所述的检测的方法为电泳检测，更优选为琼脂糖凝胶电泳。通 过琼脂糖凝胶电泳可方便、快捷地检测出扩增产物中是否含有特异性扩增的片段，以及该 片段的大小。本发明的方法利用分子生物学原理，使用发明人设计的如序列表中所列的一对特 异性引物，来扩增菊花滑刃线虫的基因组DNA。如果待检测的线虫确为菊花滑刃线虫，则通 过聚合酶链式反应(PCR)后可获得扩增的特异性片段，当电泳检测时，会显示出特异性条 带；如果待检测的线虫非菊花滑刃线虫，则通过PCR后不能获得扩增的特异性片段，当电泳检测时，就不会显示出特异性条带。因此，可通过电泳检测结果中是否出现特异性条带来判 断出待检测线虫是否为菊花滑刃线虫。为更好地实现本发明，针对不同数量的线虫，其DNA提取方法可分为(1)当所述可疑植物材料或土样中存在大量线虫时，采用Minipr印DNA提取法分 离出DNA。(2)当所述可疑植物材料或土样中存在单条线虫时，步骤(a)中所述的提取包括 以下步骤(i)将单条线虫加入含有WLB溶液的管中；(ii)于-70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C处理30min-2h ；95°C处理15_20min，以获得作为单条 线虫DNA模板的产物。优选地，上述植物材料是菊科植物材料、茄科植物材料或罂粟科植物材料。所述菊 科植物选自翠菊、金光菊、大丽菊和百日草的种苗或植株。在另一实施方式中，所述植物材料是烟草、草莓、珠兰、百合、蒲包花、飞燕草或夹 竹桃的种苗或植株。另一方面，为了更方便地使用本发明的方法，本发明还提供一种用于诊断菊花滑 刃线虫的试剂盒，其包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物对。本发明的方法适用于土样、种苗和植株样品中菊花滑刃线虫的快速检测和鉴定， 与现有方法相比，本发明的优点表现在(1)结果可靠通过对菊花滑刃线虫的3个不同地理种群和水稻干尖线虫 (A. besseyi)、福建滑刃线虫(A. fujianensis)、拟滑刃线虫(Paraphelenchidea sp.)、真 滑刃线虫(Apelenchus sp.)、阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus athuri)和松材线虫 (B. xylophilus)的测试验证表明，本发明的方法检测的结果具有极高的可靠性。(2)操作简便快速应用本发明方法，对线虫样本进行简单处理、PCR扩增和常规 的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在4小时内完成。(3)检测灵敏度高利用本发明的引物对可扩增出单条菊花滑刃线虫的幼虫或成 虫的特异性片段，因此本发明的方法灵敏度高、实用性强，可满足农作物种植前和植物检疫 过程中对菊花滑刃线虫快速可靠的检测和鉴定需要。
图1显示的是利用本发明的引物对，对不同滑刃线虫的基因组DNA的PCR扩增的
结果；图2显示的是利用本发明的引物对，对菊花滑刃线虫的单条线虫基因组DNA的PCR 扩增的结果；图3显示的是利用本发明的引物对，对3个不同菊花滑刃线虫地理种群的单条线 虫基因组DNA的PCR扩增的结果。
具体实施例方式以下通过具体实验例来进一步详细描述本发明。
本发明提供的菊花滑刃线虫基因组DNA扩增引物序列如下所示5， -TCGATGAAGAACGCAGTGAATT-3，；5， -CTCCACACGCCGACCGA-3，上述引物可在菊花滑刃线虫基因组DNA上特异性地扩增出208bp的产物。1.准确件试验-菊花滑刃线虫的特异件扩增
试验步骤采用本领域技术人员熟知的酚氯仿法(Minipr印DNA提取法)，分别提 取菊花滑刃线虫、水稻干尖线虫、福建滑刃线虫、滑刃线虫种1、滑刃线虫种2、拟滑刃线虫、 真滑刃线虫、阿苏里伞滑刃线虫和松材线虫的基因组DNA。提取方法如下(1)将线虫收 集到1. 5mL离心管中，用与离心管配套的锥形研磨棒研磨成粉末，加入700 μ 1提取缓冲液 (50mM Tris-HCl, ρΗ7· 5 ；50mM NaCl ；5mM EDTA, ρΗ8· 0 ；0. 5% SDS)禾口 7 μ 1 的 20mg/ml 蛋 白酶K，轻轻混勻；(2) 50°C水浴2-5h ； (3)加入等体积的Tris饱和酚，轻轻混勻，12000rpm, 4°C下离心lOmin，取上清液转入另一灭菌的1.5ml离心管中；(4)加入等体积的氯仿/异 戊醇(24 1)，轻轻混勻，12000rpm，4°C下离心lOmin，取上清液转入另一灭菌的1. 5ml离 心管中；(5)加入1/10体积的3M/L醋酸钠(pH5. 2)和2. 5体积经预冷的无水乙醇，轻轻混 勻，放入-20°C冰箱中放置2h以上，过夜效果更好；(6) 12000rpm，4°C下离心IOmin以沉淀 DNA ； (7)沉淀物用75%的乙醇洗涤2次，待乙醇挥发完全后，将沉淀的DNA溶解于20 μ 1 TEdOmMTris-HCL ρΗ8. 0，ImMEDTA)中；(7)任选地，取1 μ 1在1. 0%的琼脂糖凝胶上粗略 检测所提DNA的量和纯度。然后，按如下PCR反应体系和条件，使用本发明的引物对对线虫 样本进行PCR扩增PCR 反应体系25μ L，包括5ng 线虫 DNA，引物各 0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs，lXPCR 缓 冲液(包括2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反应条件预变性 94 °C 3min ；32 个循环的 94 °C 40s, 57 °C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。将5 μ L PCR产物用1. O % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色 后于紫外凝胶成像系统下显像。实验结果结果如图1所示，其中各泳道分别为M :DNA标记DL 2000 (Takara Biotech,大连，中国)(其条带大小由上至下分别对应为2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp 和 IOObp) ；1 菊花滑刃线虫(Aphelenchoides ritzemabosi) ；2 水稻干尖线虫 (Aphelenchoidesbesseyi) ；3:福建滑刃线虫(A. fujianensis) ；4 滑刃线虫种群 1 (Α. sp.l) ；5 滑刃线虫种群 2 (A. sp. 2) ；6:拟滑刃线虫(Paraphelenchidea sp. ) ；7 真滑刃 线虫(Apelenchus sp.) ；8 阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus athuri) ；9 松材线虫 (B. xylophilus)。从图中可看出，只在菊花滑刃线虫上扩增出大小为208bp的特异性条带 (对应于第1泳道)。因此，可看出本发明的方法使用的引物对具有高度的特异性，从而保证了检测结 果的高准确性。2.灵敏Itt验-X寸单 ？花滑刃线虫的扩Jf实验步骤在解剖镜下分离出的单条成虫或幼虫，将其加入含有8 μ LffLB溶液 (2. 5mmol/L 二硫苏糖醇，1. 125%吐温 20,0. 25g/L 明胶，125mmol/L 氯化钾，3. 75mmol/L 氯 化镁，25mmol/L Tris-Cl (pH 8.3))的 PCR 管中，然后-70°C放置 30min ;95°C放置 15min ；65°C放置2min ；再加入20mg/mL的蛋白酶K 1 μ L，65°C处理30min ；95°C处理15min后，作为单条线虫DNA模板直接用于PCR扩增。PCT反应体系和条件如下PCR反应体系25μ L，包括2μ L单条线虫裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR缓冲液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反应条件预变性 94 °C 3min ；32 个循环的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16°C 保存；将5 μ L PCR产物用1. 0 % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色 后于紫外凝胶成像系统下显像。实验结果结果如图2所示，其中泳道M :DNA标记DL 2000 (TakaraBiotech，大连， 中国)；泳道1-11为单条菊花滑刃线虫裂解DNA扩增；泳道12 清水对照。从图中可看出， 实验泳道都扩增出特异性条带，经分析为208bp的产物，而对照组则没有特异性条带。因此，本发明的方法灵敏度非常高，即使单条菊花滑刃幼虫亦能准确检测出，大大 方便了实际应用。3.龍十牛_-_諸碰秘__雜触隱曾实验步骤对采集于昆明、广州和美国的菊花上的菊花滑刃线虫的3个种群单条 线虫，按上述灵敏度实验中的方法裂解DNA，以进行PCR扩增。PCR反应体系和条件如下PCR反应体系25μ L，包括2μ L单条线虫裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR缓冲液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反应条件预变性 94 °C 3min ；35 个循环的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。将5 μ L PCR产物用1. 0 % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色 后于紫外凝胶成像系统下显像。实验结果结果如图3所示，其中泳道M :DNA标记DL2000 (TakaraBiotech，大连， 中国)；泳道1 昆明菊花滑刃线虫裂解DNA扩增；泳道2 广州菊花滑刃线虫裂解DNA扩增； 泳道3 美国菊花滑刃线虫裂解DNA扩增；泳道4 清水对照。从图中可看出，实验泳道均显 示出特异性条带，经分析对应大小为208bp，而对照组则未显示。因此，本发明的方法具有很高的可靠性，对于不同地区的菊花滑刃线虫均能非常 灵敏地检测出。因而，本发明的方法适用范围广，不受局部地区的限制。另一方面，为更加方便地实施本发明的方法，本发明还提供一种用于诊断菊花滑 刃线虫病的试剂盒，其包含如序列表中SEQ ID NO 1和SEQID NO 2所提供的引物对、PCR 反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和DNA提取液。利用本发明提供的方法或试剂盒检测或鉴定菊花滑刃线虫，具有很高的可靠性和 灵敏度，且操作方便，不依赖操作人员的经验，准确度高，实用性强，可满足农作物种植前和 植物检疫过程中对菊花滑刃线虫快速可靠的检测和鉴定需要。虽然本发明只对菊科植物中的菊花上的菊花滑刃线虫作出介绍，但本领域的技术 人员在了解本发明的内容后，将很容易地意识到，本发明的方法和试剂盒仍能够适用于其 他任何疑似感染菊花滑刃线虫的植物材料(例如，其他菊科植物以及其他花卉等)的检测 和诊断。序列表
<110> 崔汝强<120>菊花滑刃线虫的检测方法及诊断试剂盒<160>2
<210>1
<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgatgaaga acgcagtgaa tt<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2ctccacacgc cgaccga
权利要求
一种检测菊花滑刃线虫的方法，其包括(a)从可疑植物材料或土样中分离出待检测线虫，提取DNA；(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的引物对，进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物，根据检测结果判断菊花滑刃线虫的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述可疑植物材料或土样中存在大量线 虫时，采用酚氯仿提取法提取DNA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述可疑植物材料或土样只存在单条线 虫时，步骤(a)中所述的提取包括以下步骤(1)将单条线虫加入含有WLB溶液的管中；(2)于_70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C处理30min-2h；95°C处理15_20min，以获得作为单条线虫 DNA模板的产物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料为菊科植物材料、茄科植物材 料或罂粟科植物材料。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料为烟草、草莓、珠兰、百合、蒲 包花、飞燕草或夹竹桃的种苗或植株。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(c)中所述检测步骤(b)中获得的 扩增产物的方法为电泳检测。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菊科植物为翠菊、金光菊、大丽菊或百 日草。
8.一种用于诊断菊花滑刃线虫病的试剂盒，其包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引 物对。
全文摘要
本发明公开了一种菊花滑刃线虫的检测方法，该方法使用序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2作为引物对，进行聚合酶链式反应，通过电泳分析可得知是否得到特异性片段，从而检测或鉴定出是否为菊花滑刃线虫。另外，本发明还提供了诊断菊花滑刃线虫的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物对。本发明的方法和试剂盒具有很高的可靠性和灵敏度，且操作方便，不依赖操作人员的经验，准确度高，实用性强，可满足农作物种植前和植物检疫过程中对菊花滑刃线虫快速可靠的检测和鉴定需要。
文档编号C12Q1/68GK101812502SQ200910037299
公开日2010年8月25日 申请日期2009年2月20日 优先权日2009年2月20日
发明者冯黎霞, 刘中勇, 吴海荣, 孙晓棠, 崔汝强, 胡佳, 胡学难, 赵立荣, 钟国强 申请人:崔汝强