专利名称：miR397在培育抗旱性植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物育种，具体涉及miR397在培育抗旱性植物中的应用。
背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几个难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增加农业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会碰到需要克服逆境限制或减轻逆境危害的问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。
随着人类的经济发展和人口膨胀，土壤的盐渍化和水资源短缺现象日趋严重，这些因素严重地影响了农业生产和生态环境，土壤的盐渍化和干旱化趋势已成全球关注的问题，因此寻求植物特别是农作物耐盐、抗旱途径是十分必要的。
miRNACmicroRNA)是一组非编码单链RNA，广泛存在于动物和植物等多细胞生物中，它可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或转录后水平导致基因沉默，从而参与基因的表达调控。miRNAs参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用。
在植物中，DCL1酶在细胞核内识别miRNA前体(pre-miRNA)的茎环结构，将其切割成miRNA: miRNA*双体，然后由HST蛋白将其转运到细胞质中进行进一步的加工。在不同的植物组织、器官和发育时期，miRNA的表达谱是不同的，并且部分miRNA在不同的外界环境下也有着不同的表达水平。因此，研究miRNA表达谱对miRNA生物功能的研究是非常重要的。
植物miRNA主要参与植物发育调控、信号转导、自身生物合成调控等。 例如miR156的靶基因是SPL转录因子家族的成员，过量表达miR156会导 致植物营养生长时期的延长和迟花的现象；在拟南芥中，miR159切割一类受 赤霉素调控的MYB家族基因，组成型表达miR159会引起短日照情况下开花 的推迟和花粉的不正常发育；miR165/166调控叶子的极性、维管组织的发育， 拟南芥有五个HD-ZIPIII基因(REV、 PHB、 PHV、 ATHB-8及ICU4)参与调 节发育方面重要的方面，比如维管束的形成、在器官中建立或维持离轴及近轴 的极性，所有这些基因内部都存在miR165/miR166的靶位点，miRNA调节对 于维持正常器官的极性，维管系统及分生组织的发育是必不可少的。
另外，还有一些植物miRNA参与逆境生理。例如miR393与生长素信 号介导的病原菌抗性，miR393的耙蛋白为F-box类的生长素因子(TIRl,AFB2， AFB3)，这些蛋白是生长素信号的转导的重要节点，miR393的表达量提高会 减少TIR1的表达，并进一步抑制生长素信号转导，从而使植物对病菌感染产 生抵抗能力；miR398的表达受氧化胁迫的作用下下调表达，在拟南芥中， miR398的靶蛋白是超氧化物岐化酶CSD1和CSD2，它们在植物中可以清除 氧负离子自由基，在植物抗氧化作用中起重要作用，组成型表达抗miR398切 断CSD基因的转基因植物，对强紫光照射、重金属等高氧化状态的逆境有更 好的抗性；miR399与植物无机磷吸收存在联系，miR399的表达受磷(Pi)饥 饿的诱导而上调，这种上调在额外加入Pi之后马上被抑制，miR399的靶基因 为一种UBC (Ubiquitin-conjugating E2 enzyme)蛋白，组成型表达miR399 会引起植物体内Pi的代谢失调，使植物体内积累过多的Pi，导致植物呈现Pi中毒的症状。
干旱、高盐、低温等非生物胁迫是制约植物生长发育的最常见不利环境因 子。对需水量极大，并且作为重要粮食作物而言，提高其抗旱性是一项极其重 要的工程。
已有t艮导显示(Jian-Kang Zhu， Xiangyang Hu， Jian-Hua Zhu， role of microRNA in plant salt tolerance, Pub.No.: US 2007/0214521 Al)，过表达
miR397可以显著提高双子叶植物拟南芥对高盐环境的抵抗力，由此看以看出m iR397可能会对植物起到一定的抗逆作用，但目前尚未有miR397对植物抗旱作 用的研究。
发明内容
本发明的目的是针对当前植物尤其是农作物生长需水量大，易受干旱影响 这一重大问题，将miRNA调控技术引入植物的品种改良中，从而提供miR397
在培育抗旱性植物中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
本发明人首先选择重要粮食作物——水稻作为研究对象，通过分析miR39 7的顺式调控元件，发现其可能与水稻的逆境应激反应相关。于是本发明人对 水稻进行干旱，高盐和冷冻处理后，提取处理样品和未处理样品(对照)的总 RNA，并通过northem blot检测样品中miRNA的表达水平，结果发现处理样品 中miR397的表达量均有不同程度上调趋势，其中干旱处理样品上调程度最为 显著，且干旱处理5h时miR397表达量的上调要比干旱处理12h时miR397表达量 的上调更为显著。由此可以得出初步的结论，miR397的表达量可能和水稻抗 旱性有一定的关系。为了进一步验证miR397与水稻抗旱性的关系，本发明构建了过表达 miR397的水稻突变株，该突变株在相对低温(15~20°C)下生长状况优于野生 型水稻，结实情况与野生型水稻无明显差异。对该条件下生长至20天的水稻 进行模拟干旱和干旱后复苏处理，观察结果显示，过表达miR397的突变株存 活率与恢复生长程度明显高于野生型，即突变株水稻的抗旱性优于野生型水 稻。
综上所述可以得出结论miR397的表达水平和水稻的抗旱性是有关系的， 而且过表达miR397可以在不减缓生长或降低结实率的前提下，显著提高水稻 的抗旱性，因此miR397可以用于培育抗旱性水稻。
此外，本发明人通过研究发现，miR397及其靶基因在各种高等植物(如 水稻、高粱、油菜、葡萄和杨树等农林作物)中都是保守的，因此miR397的 过表达能对植物(双子叶、单子叶)都能起到抗旱性的作用，miR397可用于 植物尤其是农作物的抗旱性育种中。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明发现过表达miR397可以在不减缓生长或降低结实率的前提下， 显著提高水稻的抗旱性，这一结果为培育抗旱性水稻以及抗旱性植物提供了一 种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用；
2. 本发明通过分子生物学技术培育抗旱性水稻，不但水稻的抗旱性效果 好，而且不会对环境造成污染，食用安全。
图1为northern检测干旱处理后水稻中miR397的表达水平电泳图； 其中，l为5h未处理对照，2为干旱处理5h样品，3为高盐处理5h样品，4为12h未处理对照，5为千旱处理12h样品，6为高盐处理12h样品； 图2为southern blot鉴定电泳图； 其中，l为野生型对照，2 11为各T2代突变株； 图3为northern检测各T3代突变株中miR397的表达水平电泳； 其中，l为野生型对照，2 10为各T3代突变株； 图4为干旱处理前的野生型与突变株水稻；
其中，1为野生型，2为过表达miR397a的突变株，3为过表达miR397b 的突变株；
图5为干旱处理1天后的野生型与突变株水稻；
其中，1为野生型，2为过表达miR397a的突变株，3为过表达miR397b 的突变株；
图6为干旱处理1天，复苏10天后的野生型与突变株水稻；
其中，1为野生型，2为过表达miR397a的突变株，3为过表达miR397b
的突变株。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述，但具体实施例并不对本发
明做任何限定。
实施例l水稻干旱处理及总RNA提取
本实施例对2周龄的水稻幼苗(使用Yoshida培养液)进行干旱处理，即用 20。/。PEG6000模拟干旱条件对水稻幼苗分别处理5h和12h，然后提取处理后水 稻幼苗的总RNA，同时提取未进行干旱处理的水稻幼苗的总RNA作为对照组。
本实施例采用本领域常用的酚氯仿异戊醇法提取水稻总RNA，其具体步骤如下
(1) 称lg水稻样品液氮研磨成细粉，加入10mL RNA zol (100ml中含有异硫氰酸胍47.2g ， lMPH7.0的柠檬酸钠2.5ml， 10%月桂酰基氮酸钠5ml)和lmL醋酸钠(2M， pH4.0)，继续研磨；
(2) 加入10mL的水饱和酚，4mL的氯仿异戊醇(49:1，体积比)混合液，混匀后转入离心管，涡旋lmin，冰上放置5分钟，然后4X:， 12000rpm离心15min;
(3) 离心后取上清，并向上清液中加入等体积的酚氯仿异戊醇(50:49:1，体积比)混合液，涡旋lmin，冰上放置5分钟，然后4°C ， 12,000rpm离心15min;
(4) 离心后取上清，重复步骤(3) 2~3次；
(5) 离心后取上清，并向上清液中加入异丙醇(异丙醇和上清液的体积比为0.6: 1)，冰上放置30min lh;
(6) 4°C， 12,000rpm离心15min，弃上清，往管中加入1.2mL DEPC处理水溶解管底沉淀，然后每管600|il分装转入1.5mL的离心管；
(7) 向上述1.5L离心管中加入600^d的酚:氯仿:异戊醇(50:49:1，体积比)混合液，上下颠倒混匀后，冰上放置5分钟，室温12,000rpm离心15min;
(8) 离心后取上清，重复步骤(7) 2~3次；
(9) 离心后取上清，将上清液每管分装300)aL分装入新的离心管中，并向分装后的离心管中加入1/10上清体积的3M NaAc (pH 5.2)和3倍上清体积的无水乙醇，混匀，-20"放置过夜；
(10) 4°C， 12,000rpm离心15min，弃除上清，70%乙醇洗两次，95%乙醇洗一次，晾干，用15~3(HiL DEPC处理水溶解，-20匸保存备用，即获得水稻总RNA。
本实施例总RNA提取时所用到的各种试剂均为市售。实施例2 miRNA的Northern杂交
本实施例对实施例1提取的处理样品组总RNA和对照组总RNA进行Northern blot检测，所用方法均可参考本领域Northern杂交的常规操作。
取实施例1制备的水稻总RNA lpL进行甲醛变性胶电泳，变性电泳采用本领域的常规操作。
待电泳完毕，取下电泳板后揭板，用一张和目标区域差不多大小的干滤纸覆在凝胶样品区域上，用刀片切去多余的凝胶，利用滤纸把胶翻转，剥离另一块电泳板。在胶上盖一张等面积的预先用0.5xTBE浸润的Hybond W尼龙膜，将滤纸-凝胶-尼龙膜放于电泳转移系统(Bio-Rad)电极之间，胶在上面，尼龙膜在下面，上下各垫10层用0.5xTBE浸湿并赶走气泡的滤纸。用0.8 mA/cm2尼龙膜的电流强度，通电45分钟。之后关闭电源，取下尼龙膜。尼龙膜在253nm紫外灯下正反两面分别交联3分钟，将RNA及分子量标记固定于膜上。将交联好的尼龙膜放入杂交管中，加入5 10mL杂交液(杂交液的配制可参考本领域Northern杂交所采用的常规杂交液配制)，42"C预杂交1小时，然后加入同位素标记探针20pL， 42"C杂交过夜。杂交完毕，将杂交液倒出，用洗膜液(2XSSPE， 0.5% SDS)于室温下洗3次，每次10分钟。将杂交膜包入保鲜膜中，压磷屏3小时以上，再用磷屏扫描仪Typhoon 8600 imager扫描，并保存结果。
本实施例的Northern杂交检测结果如图1所示，干旱，高盐，冷冻处理的样品中miR397的表达量均有不同程度上调趋势，其中干旱处理样品上调程度最为显著，且干旱处理5h时miR397表达量的上调要比干旱处理12h时miR397表达量的上调更为显著。
实施例3过表达miR397水稻突变株的构建
本实施例在实施例2的检测结果基础上，进一步构建了过表达miR397的水稻突变株，其具体步骤如下所示
1. miR397组成型表达质粒的构建
本实施例选择载体pCAMBIA1390 (市售)，并且在该载体的酶切位点///"dll和之间插入CaMV35S启动子，该启动子以后可以作为控制miR397表达的组成型启动子。这里的试验操作采用本领域的常规技术。
从以实施例1制备的处理样品总RNA为模板，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，并且在扩增产物两端加上ZZwI和五coi I的酶切位点。PCR扩增反应条件参考PCR扩增反应试剂盒说明。
PCR结束后回收扩增产物并进行和双酶切，同时对pCAMBIA1390载体也进行力d和Ecoi I双酶切，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来即构建成miR397组成型表达质粒。
上述所涉及的扩增产物回收，双酶切反应，T4连接等反应均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。
2、 miR397组成型表达质粒转化水稻愈伤组织
将上述构建的miR397组成型表达质粒转化根癌农杆菌(市售)，所述转化方法为本领域常规操作，然后将该转化有miR397过表达质粒的根癌农杆菌菌种，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培养基(10g酵母膏，10 g蛋白胨，5 gNaCl， 15 g琼脂)上进行划线培养，28t:黑暗培养2 3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，28'C黑暗培养2天，刮取适量菌体悬浮于含有100 li M乙酰丁香酮的液体共培养基中，使之稀释至OD550为0.3左右，28i:摇床(140rpm)培养40分钟，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于侵染。
取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75%酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用1%次氯酸钠处理两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基(N6大量元素，B5微量元素，B5维生素，Fe-EDTA， 2mg/L2，4-D， 30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝胶)上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2 3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养。
挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入上述制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次。侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1 2小时。然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于26。C黑暗培养2 3天。
3、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化
取出共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26"C黑暗培养14 21天。共筛选两次。挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26t:光照培养。21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行200910037075.6
再生。
待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4 6 cm时，将其转到生根培养基上， 继续在26"C光照培养。待小苗长至10 12cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生 长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得 到转基因水稻(过表达miR397)。
上述筛选培养基的配方为N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少 量+lg/L水解酪蛋白+lg/L脯氨酸+2mg/L (2， 4-D) +30g/L蔗糖+潮霉素 50mg/L+头孢500mg/L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH=5.8。
上述预分化培养基的配方为MS培养基+lg/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖 +lmg/L (2， 4-D) +头孢50011^/1>潮霉素5011^/1^+4§^植物凝胶，预分化培 养基的终PH:5.8。
上述分化培养基的配方为MS培养基+2mg/L (6-BA) +0.5mg/L萘乙酸 + lmg/L激动素+30g/L蔗糖+3。/。山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终 PH=5.8。
上述生根培养基的配方为1/2 MS培养基。
本实施例中所采用的MS培养基、1/2MS培养基和N6培养基等的配方均 采用本领域的常规配方。上述各培养基配方中所涉及的试剂均为市售。 实施例4转基因水稻的southern blot鉴定
本实施例采用southern blot检测来筛选实施例3所得转基因水稻的阳性突 变株。
以水稻基因组DNA为模版，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列 如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，PCR扩增反应条件同实施例3，均参考PCR扩增试剂盒的说明，将扩增得到的miR397 序列作为本实施例southernblot检测的探针。
本实施例的southern blot检测可参考本领域的常规做法，检测结果如图2 所示，大部分突变株检测为阳性，成功在基因组中插入目的片断。
将上述southern blot鉴定筛选出的阳性突变株培养至T3代，培养结果发 现突变株的生长与结实情况与野生型水稻无明显差异，然后进一步使用 northern blot检测(参照northern blot操作试剂盒的说明)各T3代突变株的 miR397表达水平，结果如图3所示，所有突变株的miR397的表达水平均有 不同程度的上调。选择miR397表达量最高的T3代突变株进行随后试验。
含有表达载体的农杆菌转化的愈伤组织诱导分化而成的植株用T。代表， T,代表示To代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T,代自交产生 的种子及由它所长成的植株。T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的 植株。
实施例5干旱处理野生型与转基因水稻
将野生型水稻和实施例4筛选得到的miR397表达量最高的T3代突变株 于相对低温(15~20°C)下萌发，并用水培养20天。
将幼苗同时转入含有15% PEG6000 (1L水中含有15g PEG6000)的水中 模拟干旱处理24h，至幼苗叶子巻曲干枯，然后更换成水进行复苏10天。
本实施例对野生型和转基因水稻的抗旱处理以及旱后复苏研究结果如图 4、图5和图6所示，处理1天后，野生型与突变株水稻均千枯，但复苏10 天后，野生型水稻基本枯死，而突变株的水稻均恢复正常生长。miR397在培育抗旱性植物中的应用序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉中山大学华南师范大学
〈120〉 niiR397在培育抗旱性植物中的应用
〈130〉
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 31
<212〉 腿 <213>人工序列
<400> 1
gaatctagaa cacgctctac ctacatcgtg t 31
<210> 2
<211> 31
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<400> 2
attgaattct cacctcgtct gctggggacc t 3权利要求
1、miR397在培育抗旱性植物中的应用。
2、 根据权利要求l所述应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子 叶植物。
3、 根据权利要求l所述应用，其特征在于所述植物为水稻、高粱、油菜、 葡萄或杨树。
4、 根据权利要求1所述的应用，其特征在于该应用是通过筛选过表达 miR397的植物从而得到抗旱性植物。
全文摘要
本发明公开miR397在培育抗旱性植物中的应用。本发明人通过对水稻进行干旱处理并检测处理后样品miRNA表达水平，发现干旱处理后样品中miR397的表达量呈显著上调趋势，且干旱处理5h时miR397表达量的上调要比干旱处理12h时miR397表达量的上调更为显著。然后本发明人构建了过表达miR397的水稻突变株，该突变株在相对低温下生长状况优于野生型水稻，结实情况与野生型水稻无明显差异，并且模拟干旱和干旱后复苏处理的结果显示，突变株水稻的抗旱性优于野生型水稻。这一结果为培育抗旱性水稻及抗旱性植物提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用，且不会对环境造成污染，食用安全。
文档编号C12N15/82GK101487021SQ20091003707
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月6日 优先权日2009年2月6日
发明者清 刘, 张玉婵, 杰 徐, 李洪清, 王小菁, 王聪颖, 陈月琴 申请人:中山大学;华南师范大学