专利名称：一个旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个来源于旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因及其编码蛋白与其在培育抗旱、耐盐性提高的植物中的应用。
背景技术：
植物在干旱盐害胁迫的条件下，除了引起代谢的变化以外，还可以激活体内一些其它基因的表达，使植物的营养组织中产生新的蛋白积累。这些蛋白的累积可提高植物对不良环境的适应能力，如LEA蛋白，就是一种受干旱盐害诱导基因的编码产物(俞嘉宁，山仑.LEA蛋白与植物的抗旱性生物工程进展2002，22(2)10-14)。LEA蛋白具有高度的亲水性，在植物受干旱盐害胁迫下可以将大量的水分子捕获导细胞内，保护细胞中的生物大分子，维持细胞的特定结构，提高植物对环境胁迫的耐性和抗性。目前已在很多植物中发现LEA蛋白，并根据这些的LEA蛋白的结构特点将其分为5组，均与植物的抗旱、耐盐密切相关(俞嘉宁，山仑.LEA蛋白与植物的抗旱性，生物工程进展，2002，22(2)10-14；Michael J Wise.LEAping to conclusionsAcomputational reanalysis of late embryogenesis abundant proteins and theirpossible roles.BMC Bioinformatics 2003，452；俞嘉宁，张劲松，山仑，陈受宜.小麦中两个新的第三组LEA基因及酵母中功能分析2005，47(11)1372-1381)。该基因对植物抗逆反应的重要性及其在植物抗逆基因工程领域的应用价值已被普遍关注。在我国虽然利用抗逆基因培育作物、林草等的抗逆品系已成为植物育种的主要思路，但拥有我国自主知识产权的抗逆资源基因还十分缺少。因此深入了解该基因的作用机制，一方面可以为研究植物抗旱的生理生化机制提供理论基础，另一方面，可以为培育抗逆植物品种提供拥有自主知识产权的抗逆资源基因。
绝大多数植物(包括主要农作物品种和模式植物)不能忍受严重的干旱和盐胁迫。只有更苏植物可以忍受极度干旱的条件，待水份充足时就能很快恢复正常的生命活动，因此是研究耐旱机制和提供耐旱基因的极好的植物资源。已知被子植物中的更苏植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亚。苦苣苔科植物旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)是第一种在我国展开分子和生理水平系统研究的更苏植物。该植物的叶片具有很强的耐旱复苏能力，在室温、相对空气湿度均为0的条件下实施干旱胁迫72小时后，叶片相对含水量降至约3％，叶片皱缩至原叶面积的1/3以下，光合作用基本停止，只要重新给水，叶片就可以吸水伸展，并恢复成未处理前的叶片表观状态和生理状态(包括光合作用的恢复)(Deng X，Wang H，Hu Z，mRNA differential displayvisualized by silver staining tested on gene expression in resurrection plantBoea hygrometrica.Plant Moecular Biology Reporter 17279.1999；Deng X，Hu Z，Wang H，Wen X，Kuang T.A comparison of photosynthetic apparatus of thedetached leaves of the resurrection plant Boea hygrometrica with itsnon-tolerant relative Chirita heterotrichia in response to dehydration andrehydration.Plant Science.165851-861.2003)。利用该植物，已有多个抗旱相关基因被鉴定和克隆(未发表数据)。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因。
本发明所提供的抗旱、耐盐相关基因，名称为BhLeal，来源于苦苣苔科旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由588个碱基组成，其编码序列为自5’端第43-432位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明BhLeal基因所编码的蛋白(BHLeal)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗旱、耐盐能力的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由129个氨基酸残基组成。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增BhLeal中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物抗旱、耐盐性的方法。
本发明所提供的提高植物抗旱、耐盐性的方法，是将所述旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因导入植物组织或细胞，得到抗旱、耐盐性提高的植物。
所述旋蒴苣苔的BhLeal基因可通过含有所述旋蒴苣苔的BhLeal基因的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。
使用BhLeal基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明BhLeal基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，还可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。
本发明所提供的旋蒴苣苔的抗旱相关基因BhLeal，可调控植物的耐旱复苏能力，从而显著提高植物的耐旱性。该基因及其编码蛋白对于培育耐旱的作物、林草新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为Northern杂交检测BhLeal表达模式的结果图2为BhLeal原核表达载体pGEX-4T-1/BhLeal的物理图谱图3为过量表达BhLeal基因的原核细胞的抗旱能力得到显著提高的验证实验的结果图4为过量表达BhLeal基因的原核细胞的耐盐能力得到显著提高的验证实验的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。
实施例1、旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因BhLeal的获得提取经干旱胁迫8小时的旋蒴苣苔叶片的总RNA，利用ZAP-cDNA文库构建试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)构建cDNA文库。从中随机挑选4800个基因，用BioGrid robot(BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)自动化点样在Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)上，制成cDNA微阵列(cDNA芯片)。将芯片与未经干旱处理正常生长的旋蒴苣苔叶片和经干旱胁迫8小时的旋蒴苣苔叶片的polyA-RNA所制备的33P标记的探针杂交，分析它们在正常条件及干旱诱导后基因表达的动态变化。对干旱诱导后基因进行测序，测序结果表明有1个干旱诱导上调的基因克隆，该基因具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由588个碱基组成，其编码序列为自5’端第43-432位碱基，编码具有序列表中SEQID №2的氨基酸残基序列的蛋白质，将该基因命名为BhLeal，将其编码蛋白命名为BHLeal。
实施例2、BhLeal的表达模式分析实验分别提取未受胁迫处理，经干旱胁迫2、8、24、72小时，及0.2M NaCl胁迫和水淹胁迫9小时的旋蒴苣苔叶片的总RNA并测定浓度，取等量的各个样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，待经嗅酚蓝染色的样品迁移到凝胶距点样孔2/3处，将RNA转移到尼龙膜上，在80℃下烤膜120分钟，再将转有上述RNA的尼龙膜放入杂交管中，经65℃预杂交2.5h后，加入经纯化、变性的荧光素标记的BhLeal探针(序列表中SEQID №1中自5’端第1至588碱基位核苷酸序列)，65℃杂交24小时，倒出杂交液，用2×SSC、0.1％SDS、0.1×SSC和0.1％SDS溶液在65℃下，各洗膜30min，最后用Gene Images CDP-Star Detection Module(Amersham Phamacia Biotech，Little Chalfont Buckinghamshire，UK)检测杂交信号的位置和强度。部分检测结果如图1所示，表明BhLeal的mRNA在未受干旱胁迫的及水淹胁迫的旋蒴苣苔叶片中检测不到表达，经干旱胁迫8小时及盐胁迫9小时后可诱导其大量表达。
实施例3 BhLeal的细胞学定位利用PSORT计算机程序分析软件(Nakai and Kanehisa，Expert system for predicting protein localization sites in gram-negative bacteria.Proteins.11(2)95-110，1991)对BhLeal所编码的蛋白质BhLeal进行细胞学定位，结果表明BhLeal定位于旋蒴苣苔叶细胞的细胞质中。
实施例4、BhLeal的抗旱功能验证实验先以经干旱胁迫8小时的旋蒴苣苔叶片的总RNA为模板，由oligo-dT反转录合成其cDNA，再以此cDNA为模板，在引物OB-44-full-f(5’-AGAATTCATGCAGACTGCGAAGC-3’)和OB-44-full-r(5’-ACTCGAGCTACTGAGTCGGAGCT-3’)的引导下，扩增BhLeal基因的全长片段，用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后，与经相同酶双酶切的原核表达载体pGEX-4T-1(Pharmacia公司)连接，得到BhLeal基因的原核表达载体，命名为pGEX-4T-1/BhLeal，其物理图谱如图2所示，使BhLeal与GST融合基因的表达受到IPTG诱导型启动子tac的调控。将构建好的BhLeal基因的原核表达载体和pGEX-4T-1空载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，接种于含50μg/mL氨苄青霉素的2mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h(150转/min)后，按1∶100稀释，再37℃振荡培养1-2h，至OD600值为0.3-0.6后，诱导表达并检测BhLeal基因在原核细胞中过量表达对原核细胞耐旱能力(以不同浓度的PEG6000模拟干旱)的影响，具体方法为收集5mL OD600值为0.3-0.6的菌液，离心(8000转/min)1min，收集菌体，将沉淀分别重悬于分别含3.75％、7.5％、15％、30％的PEG6000及50μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养液中，同时加入终浓度为0.01mm/L IPTG开始诱导培养，37℃振荡培养(150转/min)，1小时后分别测OD600值，并收集1.5mL菌体，离心(4000转/min)收集菌体，将沉淀重悬于100μl 2×SDS凝胶加样缓冲液中，沸水10min，12000g离心10min，收集上清，每样品上样5μl，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果表明BhLeal基因在原核细胞中得到了过量表达，其蛋白质表达水平在0.01mm/L IPTG诱导下增加，同时相对于转空载体的细菌，转BhLeal基因的细菌在7.5％PEG6000存在下的存活能力具有一定程度的提高，如图3所示(以转入空载体pGEX-4T-1的细菌为对照；纵坐标为存活率，以百分数表示)，而且在蛋白质水平上，转BhLeal基因的细菌与对照相比，耐PEG的能力也得到提高。本实验在原核细胞表达体系中证明BhLeal基因可提高细胞的耐旱能力。
实施例5、BhLeal的抗盐功能验证实验以与上述相同的方法得到BhLeal基因的原核表达载体，pGEX-4T-1/BhLeal，其物理图谱如图2所示，使BhLeal与GST融合基因的表达受到IPTG诱导型启动子tac的调控。将构建好的BhLeal基因的原核表达载体和pGEX-4T-1空载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，接种于含50μg/mL氨苄青霉素的2mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h(150转/min)后，按1∶100稀释，再37℃振荡培养1-2h，至OD600值为0.3-0.6后，诱导表达并检测BhLeal基因在原核细胞中过量表达对原核细胞耐旱能力的影响，具体方法为收集5mL OD600值为0.3-0.6的菌液，离心(8000转/min)1min，收集菌体，将沉淀分别重悬于分别含0.3M、0.6M、0.9M和1.8M的NaCl及50μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养液中，同时加入终浓度为0.01mm/L IPTG开始诱导培养，在37℃振荡培养(150转/min)，1小时后分别测OD600值，并收集1.5mL菌体，离心(4000转/min)收集菌体，将沉淀重悬于100μl 2×SDS凝胶加样缓冲液中，沸水10min，12000g离心10min，收集上清，每样品上样5μl，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果表明BhLeal基因在原核细胞中得到了过量表达，其蛋白质表达水平在0.01mm/L IPTG诱导下增加，同时相对于转空载体的细菌，转BhLeal基因的细菌在0.3M、0.6M和0.9M NaCl存在下的存活能力具有一定程度的提高，如图4所示(以转入空载体pGEX-4T-1的细菌为对照；纵坐标为存活率，以百分数表示)，而且在蛋白质水平上，转BhLeal基因的细菌与对照相比，耐NaCl的能力也得到提高。本实验在原核细胞表达体系中证明BhLeal基因可提高细胞的耐盐能力。
序列表<160>2<210>1<211>588<212>DNA<213>旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)<400>1cattacaact ttatatttca tattaaataa aaccaataaa atattcatac ttctaatcaa 60aatattatct attcttcttc ttcatccaat tatctttttt atttccttaa atccaaatct120taatttaatt cttataaaac tatttcaatt tctaattaat acaaataatt ttccaattaa180cataataatt ctaaataatc ttaatccaat tttattaatc attaatataa ttcctataat240tctaccttcc attttcattc taatcatcat ttacaatttt ttcatcatta tcttcacttt300tctttttctt ctccttctac tcaattcaat cattatccct catttttatc cactcatatt360ccaccttatt aatcttcttc ccattattat cattcttcac cttttactaa cccttcatct420cctactcatt atcatcacct ctctttcctt tatttaattt ttcatctttt tattaattta480ctcttattta ttttttctat ttctttcttt cctctttcca tcttttaatt tttctttttt540atatttttta tctcttcttt tttatttttt aataaattca tttattac 588<210>2<211>129<212>PRT<213>旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)<400>2Met Gln Thr Ala Lys Gln Lys Met Ser Asp Ala Ala Ala Ser Ala Lys1 5 10 15Glu Arg Val Asp Val Leu Lys Ala Lys Ala Glu Gly Lys Ala Asp Lys20 25 30Thr Met Ala Ser Ser Lys Glu Asp Lys Glu Val Ala Lys Glu Gln Lys
35 40 45Lys Ala Lys Glu Ala Glu Ala Lys Val Arg Lys His Glu Glu Lys Ala50 55 60Asp Asn Ala Thr Gly His Leu Gln Ala Lys His Gln Gly Gln Phe Gly65 70 75 80Gln Gln Asp Leu His Gly Ala Gly Ala Ala Pro Ala Thr Gln Gly Asn85 90 95Gln Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ile Pro Pro Glu Glu Ala Ala100 105 110Ala Gln Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Gly Thr Asn Pro Ala Ala Pro Thr115 120 125Gln
权利要求
1.旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.权利要求1所述的旋蒴苣苔抗旱、耐盐相关基因的编码蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗旱、耐盐复苏能力的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的旋蒴苣苔抗旱、耐盐相关基因的编码蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
5.含有权利要求1所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
6.一种提高植物抗旱、耐盐性的方法，是将权利要求1所述的旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因导入植物组织或细胞，得到抗旱、耐盐性提高的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因通过含有所述旋蒴苣苔抗旱、耐盐相关基因的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物宿主为水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三叶草、冰草、草莓或西红柿。
全文摘要
本发明公开了旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因及其编码蛋白与其在培育抗旱性提高的植物中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的旋蒴苣苔的抗旱、耐盐相关基因BhLeal可调控植物的抗旱、耐盐能力，从而显著提高植物的抗旱、耐盐性，该基因及其编码蛋白对于培育抗旱、耐盐的作物、林草新品种具有重要的理论及实际意义。
文档编号C07K14/415GK1775797SQ20051012788
公开日2006年5月24日 申请日期2005年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者邓馨, 马克平, 王丽丽, 王智, 刘霞 申请人:中国科学院植物研究所