一种展示流感病毒非结构蛋白ns1的重组t4噬菌体及其应用的制作方法

专利名称：一种展示流感病毒非结构蛋白ns1的重组t4噬菌体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及展示流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体的构建、表达和应用。本发明还涉及该重组T4噬菌体在检测流感抗体中的应用，特别是采用该重组T4噬菌体区分病毒感染禽群和疫苗免疫禽群。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽类(家禽和野禽)的一种感染和/或疾病综合症。发生在鸡、鸭、鹅、鸽子等禽类和鸟类身上，但主要侵害火鸡和鸡，哺乳动物如猪、马、海豹、人等也可感染。根据禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)株的致病性、禽的种类、环境、饲养管理条件以及并发疾病等因素，感染后的禽只表现为无症状感染、轻度的上呼吸道症状、产蛋量下降到急性的致病性死亡等多种形式，直接影响鸡体的健康及其产品质量，是现代化养禽业难以对付的重要禽类呼吸道传染病之一，与马立克氏病、传染性法氏囊病、白血病、网状内皮增生症等一样，也是严重威胁家禽的重要免疫抑制病。被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
目前多采用“免疫”兼“扑杀”的措施来控制禽流感。中国大陆、墨西哥等国家和地区采用这一措施有效地控制了禽流感的流行。采用灭活疫苗免疫控制禽流感的方法越来越受到重视，越来越多的国家和地区采用免疫的方法。但随之而来的一个问题是，免疫造成了对疫情监测的干扰。因为传统的监测禽流感的血清学方法主要是两个一是琼脂扩散试验(AGP)，一是血凝抑制试验(HI)。这两种方法都不能区分禽流感疫苗免疫产生的抗体和禽流感病毒感染后产生的抗体。
禽流感病毒(AIV)为单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科A型流感病毒属，A型流感病毒基因由8个不连续的病毒RNA节段组成。片段8即NS基因在8个片段中最短，编码非结构蛋白，有两个读码框，可编码2种蛋白质即NS1和NS2，两者的分子量分别为25kDa和14kDa。这两种蛋白质大量存在于感染细胞中，NS1主要在核内，NS2主要在细胞浆内，在病毒粒子中存在少量的NS2蛋白成分。在感染的早期NS1被大量合成，而NS2在后期才会合成生产。在细胞感染的早期，可发现细胞核内有大量的NS1聚集，也可在细胞质内发现。作为病毒的非结构成分，这种蛋白的出现仅仅只局限在病毒感染期，而不会出现在成熟的禽流感病毒中，因而在使用灭活疫苗免疫时不会产生相应的抗体。因此，针对NS1蛋白的抗体只可能出现于野毒感染群中。从而可以将NS1及其抗体作为病毒感染机体的一个标记用以区分免疫群和感染群的鉴别诊断。
NS1的作用最近受到了研究者们极大的兴趣。许多学者试图用NS1的表达产物作为抗原来鉴别AIV感染禽群和免疫禽群。为了获得大量纯化的NS1蛋白，一般采用基因工程的方法来表达NS1基因。目前采用的方法一般是在大肠杆菌表达系统中表达NS1蛋白。本发明采用一种新的表达方法——噬菌体展示技术来获得大量的具有活性的NS1蛋白。
噬菌体表面展示技术(phage display)是80年代发展起来的一项新的生物技术(Smith，1985)，它能将外源多肽和蛋白质以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，并保持相对独立的空间构象和生物活性。T4噬菌体属于有尾噬菌体中A群A2亚群的典型成员，其基本形态结构是头长径约95nm，横径约为65nm。T4噬菌体衣壳由3种必需衣壳蛋白组成主要的衣壳蛋白gp23和2个次要衣壳蛋白gp24、gp20。其中分子量为45kDa的gp23在每个病毒颗粒中有960个拷贝，而其余2个次要衣壳蛋白拷贝数较少，gp24有55个拷贝，而gp20只有12个拷贝。此外，在衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白分子量为9kDa的SOC和分子量为40kDa的HOC，二者相距7nm，以对称的形式分布于噬菌体二十面体表面。SOC和HOC仅提供噬菌体额外的稳定能力，是在噬菌体衣壳装配完成后才组装到衣壳表面的，它们的缺失不影响T4噬菌体的繁殖和感染。将外源蛋白与T4噬菌体表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，从而可以获得具有外源蛋白的重组T4噬菌体。采用这样的方法，获得了表达爱滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰质炎病毒VP1(Ren et al，1996)、脑膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白、传染性囊病病毒VP2(曹永长等，2003)、禽流感H5亚型和H9亚型HA蛋白(吕英姿等，2002)、口蹄疫VP1蛋白(史泉城等，2002)、鸡新城疫病毒F蛋白和N蛋白(刘铀等，2004)的重组T4噬菌体。

发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是获得展示禽流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体，并采用该重组T4噬菌体作为抗原，区分禽流感灭活疫苗免疫动物和禽流感病毒感染动物的抗体，即区分疫苗免疫动物和病毒感染动物。
(二)技术方案本发明为一种展示流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体，是流感病毒非结构蛋白NS1与T4噬菌体SOC蛋白组成融合蛋白，位于重组T4噬菌体头部表面。
本发明所述的重组T4噬菌体中，流感病毒非结构蛋白NS1为具有SEQ IDNO2所示序列的蛋白质；或具有SEQ ID NO2所示序列经改变、缺失或增加一个或若干个氨基酸残基仍具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的蛋白质；或与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有80％以上的同源性且具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的蛋白质。
本发明所述的重组T4噬菌体中，编码流感病毒非结构蛋白NS1的核苷酸序列为SEQ ID NO1；或SEQ ID NO1经改变、缺失或增加一个或若干个核苷酸仍表达具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的蛋白质的序列；或与SEQID NO1所示核苷酸序列中连续200碱基以上的区段有80％以上的同源性，且其表达产物仍具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的重组T4噬菌体的应用，将重组T4噬菌体作为抗原，直接免疫或将T4噬菌体与佐剂配合后制成疫苗免疫动物，获得抗NS1的特异性抗体。
本发明的重组T4噬菌体应用，用于免疫的动物为兔、鸡、鼠、山羊。
本发明所述的重组T4噬菌体的另一种应用，是以重组T4噬菌体作为抗原检测动物血清中的禽流感特异性抗体，区分禽流感疫苗免疫动物和禽流感病毒感染动物的抗体，即区分流感病毒感染动物和流感病毒灭活疫苗免疫动物。
本发明中所述的应用，所使用的检测方法是酶联免疫吸附试验。
本发明提供的重组T4噬菌体是采用基因重组的方法获得的。其方法是(1)首先采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增NS1基因片段。提取禽流感病毒RNA，以F1(5′-ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和F2(5′-TCA AAC TTC TGA CTC-3’)为引物，在AMV反转录酶作用下合成NS1基因的cDNA，获得RT产物。RT产物用作PCR扩增NS1基因片段的模板，以P1(5′-ATG AAT TCT ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和P2(5′-ATG AATTCG TCA AAC TTC TGA CTC-3′)为引物，按常规PCR方法扩增NS1基因，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次；最后72℃延伸10min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)采用pR质粒(Ren et al，1996；任兆钧，2004，CN1523114A)构建重组质粒pR-NS1。用EcoR I在37℃消化NS1基因的PCR纯化产物，用EcoR I和CIAP在37℃消化质粒pR，接着在T4连接酶的作用之下，连接酶切回收后的NS1 PCR产物和质粒pR，连接产物转化到大肠杆菌DH5α。转化方法为常规CaCl2法。经氨苄青霉素(Amp)抗性筛选，获得了插入NS1基因的重组子。然后用两对特异性引物SOC-S(GAA TCA TAT GGC TAG TCT CGCGG)/P2和P1/P2进行PCR筛选。挑取单菌落接种于3mL LA/Amp培养液中，在37℃以200r/m振摇培养16-20小时。对PCR筛选阳性的细菌，离心收集菌体，抽提质粒，再经限制性内切酶消化鉴定和序列测定，获得重组质粒pR-NS1。
(3)将重组质粒pR-NS1和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(Ren et a1，1996；任兆钧，2004，CN1523114A)进行同源重组，获得展示NS1蛋白的重组T4噬菌体。
先用重组质粒pR-NS1转化大肠杆菌DH5α，获得的大肠杆菌记为E-NS1。然后进行以下操作在装入500μL SC培养液的器皿中加入1μL氨卞青霉素(Amp)，然后加入10μL E-NS1，在37℃培养至光密度值OD600大约为0.5时，加入50μLT4-Z1，在35℃ 200r/m振摇培养至有细菌碎片出现。
在1个经高压灭菌(15lpf/in2，20min)的试管中分别加入600μL培养超过12小时的新鲜大肠杆菌DH5α，不加溶菌酶，将在2-10℃储存的高压灭菌(15lpf/in2，20min)过的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到55℃左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌DH5α的试管中。将混合液在旋涡震荡器上混匀，立即倒在平皿上。等到琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10μL培养12小时以上的E-NS1细菌裂解液，待吸收完毕后，放在37℃培养16小时以上。
如果E-NS1中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将NS1基因转入T4噬菌体中，则在没有加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑。重新铺SC平板培养基，然后用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC板上点梅花斑。放在37℃培养12小时以上。生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6小时以上。
采用PCR筛选T4噬菌体转化子。用特异性引物P1/P2从阳性梅花斑浸泡液中扩增到特异性条带，则说明已获得了展示NS1蛋白的重组T4噬菌体。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min后4℃保存。
SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后倒平板，4℃保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，4℃保存。用时加热溶解，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后备用。
(三)有益效果本发明具有明显的优点和效果。本发明提供的重组T4噬菌体易于纯化，展示在T4噬菌体表面的NS1蛋白具有完整的空间构象。由于SOC位点在T4噬菌体头部表面具有960个拷贝，所以与SOC融合表达的NS1蛋白的拷贝数高。由于NS1蛋白分布于T4噬菌体头部表面，因而T4噬菌体本身充当了NS1蛋白的载体，当本发明提供的重组T4噬菌体作为抗原时，NS1的免疫原性比单独的NS1蛋白强。作为疫苗的抗原、或者作为免疫检测的抗原使用时，和其它的蛋白表达系统表达的NS1蛋白相比，本发明所述的重组T4噬菌体具有明显的优点。


图1为NS1基因的PCR扩增产物电泳图。M为DNA分子量标准DL2000DNA Marker；1-4为NS1基因PCR扩增产物；图2为pR-NS1重组子的筛选结果。NS1基因的PCR产物大小为678bp；SOC-NS1融合基因的PCR产物大小约900bp。M为DL2000 DNA Marker，1、5为同一转化子，2、6为同一转化子，3、7为同一转化子，4、8为同一转化子，其中1、2、3、4为P1/P2特异性引物扩增的PCR产物，5、6、7、8为SOC-S/P2特异性引物扩增的PCR产物；图3为重组整合质粒pR-NS1的构建示意图。pR表示整合质粒，pR-NS1表示插入了NS1基因的重组整合质粒。Ampr表示氨卞青霉素抗性，Kpr表示卡那霉素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌体上的基因。EcoR I、BamH I、Nde I、HindIII、Pst I、Pvu I是质粒上的限制性内切酶位点；图4为NS1蛋白在重组T4噬菌体SOC位点展示模式图。A为重组整合质粒pR-NS1；B为缺陷型T4噬菌体T4-Z1；C为重组后携带有目的基因NS1的重组T4噬菌体T4-NS1；图5为重组T4噬菌体的PCR鉴定结果图。泳道1-8是含有NS1基因的重组噬菌体的PCR产物，M为分子量标记；图6为重组噬菌体T4-NS1的免疫印迹(Western blot)检测图。M为预染色的蛋白质分子量标准；1为重组噬菌体T4-NS1。
具体实施例方式
实施例1 采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增NS1基因片段按照RizolLS Reagent说明书(GibcoBRL公司产品)提取禽流感H5N1亚型病毒的RNA，以F1(5′-ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和F2(5′-TCA AACTTC TGA CTC-3′)为引物，在AMV反转录酶(TaKaRa公司产品)作用下合成NS1基因的cDNA，获得RT产物。RT反应条件如下42℃ 60min，然后95℃ 3min。RT产物用作PCR扩增NS1基因片段的模板，以P1(5′-ATG AATTCT ATG GAT TCC AAC ACT G-3′)和P2(5′-ATG AAT TCG TCA AAC TTCTGA CTC-3′)为引物，按常规PCR方法扩增NS1基因，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次；最后72℃延伸10min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，观察到特异性条带(图1)。结果表明，成功扩增得到了NS1的基因片段。
实施例2 重组质粒pR-NS1的构建采用pR质粒(任兆钧，2004，CN1523114A)构建重组质粒pR-NS1，其构建过程如图3所示。用EcoR I在37℃消化NS1基因的PCR产物，用EcoR I和CIAP在37℃消化质粒pR，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的NS1的PCR产物和质粒pR。将连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化方法为常规CaCl2法。经Ampr抗性筛选，获得插入了NS1基因的重组子。然后用两对特异性引物SOC-S(GAATCA TATGGCTAGTCTCGCGG)/P2和P1/P2进行PCR筛选(图2)。挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16-20小时，对PCR筛选阳性的细菌，8000r/m离心收集菌体，用E.Z.N.A.Plasmid Minipreps Kit(Omega公司产品)抽提质粒，再经限制性内切酶消化鉴定和序列测定，获得重组质粒，鉴定正确的重组质粒命名为pR-NS1。
实施例3 重组噬菌体T4-NS1的获得用重组质粒pR-NS1和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(任兆钧，2004，CN1523114A)进行同源重组，获得展示NS1蛋白的重组T4噬菌体。其构建过程如图4所示。先将重组质粒pR-NS1转化到大肠杆菌DH5α，获得的大肠杆菌记为E-NS1。然后进行以下操作在装入500μL SC培养液的器皿中加入1μL氨卞青霉素(Amp)，然后加入10μL E-NS1，在37℃培养至光密度值OD600大约为0.5时，加入50μLT4-Z1，在35℃ 200r/m振摇培养至有细菌碎片出现。
在1个经高压灭菌(15lpf/in2，20min)的试管中分别加入600μL培养超过12小时的新鲜大肠杆菌DH5α，不加溶菌酶，将在2-10℃储存的高压灭菌(15lpf/in2，20min)过的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到55℃左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌DH5α的试管中。将混合液在旋涡震荡器上混匀，立即倒在已铺有SC底层培养基的平皿上。等到琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10μL培养12小时以上的E-NS1细菌裂解液，待吸收完毕后，放在37℃培养16小时。
如果E-NS1中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将NS1基因转入T4噬菌体中，则在没有加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑。重新铺SC平板培养基，然后用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC板上点梅花斑。放在37℃培养12小时以上。生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6小时。
采用PCR筛选T4噬菌体转化子。用特异性引物P1/P2从阳性梅花斑浸泡液中扩增到特异性条带(图5)，则说明已获得了展示NS1蛋白的重组T4噬菌体。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min后4℃保存。
SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后倒平板，4℃保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5gNaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，4℃保存。用时加热溶解，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后备用。
实施例4 用禽流感病毒直接感染小鼠制备小鼠抗禽流感抗体将30只小鼠分成3组，每组10只，饲养于隔离器中，每日饲喂灭菌的饮水和饲料。8周龄左右时接种病毒。其中一组用活的H5N1亚型禽流感病毒经肌肉注射感染小鼠，每只小鼠0.2ml活病毒(病毒HA滴度为1∶28)；首次感染后第9天，再用同样剂量的病毒感染一次。另一组按同样的剂量、同样的方式用活的H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠(病毒HA滴度为1∶29)。第三组按同样的剂量、同样的方式接种禽流感灭活疫苗(肇庆大华农生物科技有限公司产品)。首次接种后15天，对小鼠进行眼球采血，常规方法制备血清，采用血凝抑制实验(HI)测定其抗体水平，HI效价为8log2以上。将血清样品分装后置-20℃保存备用。
实施例5 重组噬菌体的免疫印迹(Western Blot)分析大量培养重组噬菌体T4-NS1，离心，按常规法用PEG/NaCl浓缩，当噬菌体滴度达到1011pfu/mL时，进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE方法如下取重组噬菌体T4-NS1和T4噬菌体SOC缺失株T4-Z1各100μL，然后加入2×上样缓冲液100μL，混匀后，样品在-80℃冰箱和37℃烘箱内分别冻融三次。参照汪家政等(2000)编《蛋白质手册》方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。积层胶浓度为5％，分离胶浓度为12％。将待检样品煮沸5min，取30μL加入凝胶点样孔中，在电场作用下进行电泳。电泳缓冲液为Tfis-甘氨酸。电压为80v/cm，待溴酚蓝到达积层胶底部时电压升高到160v/cm。待溴酚蓝接近凝胶底部时，停止电泳，取下凝胶。接着进行免疫印迹(WesternBlot)分析。
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE电泳结束后，不对凝胶进行染色。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜及两张滤纸，与电泳之后的凝胶一起在室温浸泡在转移缓冲液中15min，按海绵-滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序安装转印夹。将转印夹中有膜的一侧接正极，并在15V的电压下转移1.5小时。转移后的膜用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，弃去封闭液，用TBS洗膜3次。弃去TBS，加入用1％脱脂奶粉/PBS以1∶100倍稀释的禽流感病毒感染的小鼠血清(一抗)，温和振摇3小时。弃去一抗，用TBS洗膜3次，每次约10min。弃去TBS，加入用1％脱脂奶粉/PBS以1∶1000倍稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体，珠海百奥公司)，温和振摇至少1小时。弃去二抗，用TBS洗膜3次，每次约30min。弃去TBS，加入DAB溶液显色，轻摇硝酸纤维素膜，待显色达一定程度，用双蒸水洗膜终止显色反应。在39kDa位置可见一特异性条带(图6)。
实施例6 用重组噬菌体免疫小鼠制备小鼠抗NS1抗体将重组噬菌体制备成油乳剂疫苗，每ml含有1×1010pfu以上的重组噬菌体。将10只小鼠饲养于隔离器中，每日饲喂干净的饮水和饲料。8周龄左右时用重组噬菌体油乳剂疫苗免疫小鼠，每只小鼠0.2ml，首次免疫14天后，再用同样剂量的疫苗加强免疫一次。加强免疫后14天，对老鼠进行眼球采血，常规方法制备血清，获得的血清样品分装后置-20℃保存备用，并用ELISA检测小鼠血清中NS1抗体水平。
实施例7 用重组T4噬菌体作为抗原检测小鼠血清中NS1抗体以重组T4噬菌体为包被抗原，用ELISA检测NS1抗体。ELISA程序如下将重组T4噬菌体用PBST(PBS，pH7.2，含0.05％吐温20)稀释为1×108pfu/ml，每孔加入100μL稀释的重组T4噬菌体，4℃放置12小时以上。用清洗缓冲液(PBS，pH7.2，含0.05％吐温20)洗3次后，每孔加入100μL5％的脱脂奶粉/PBS，37℃放置2小时。用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100μL用1％脱脂奶粉/PBS稀释100倍的小鼠血清，37℃反应1小时。再用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100μL用1％脱脂奶粉/PBS稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(珠海百奥公司)，37℃反应1小时。用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入显色液(10mg TMB溶于10ml无水乙醇)100μL，室温观察颜色变化。在20min时达到显色高峰，每孔加入100μL终止液(1mol/L H2SO4)，终止显色反应，在酶标仪上读取OD450值。计算样品检测值(P)与阴性血清检测值(N)的比值P/N，P/N值大于2.1时，判定为阳性。
用该方法检测小鼠血清，发现禽流感病毒感染的小鼠血清和重组噬菌体油乳剂疫苗免疫的小鼠血清，其P/N值均大于2.1，判定为阳性；而禽流感灭活疫苗免疫的小鼠血清的P/N值小于2.1，判定为阴性(表1)。
表1小鼠血清ELISA检测结果

实施例8 用重组T4噬菌体作为抗原检测鸡血清中NS1抗体ELISA程序如下将重组T4噬菌体用PBST(PBS，pH7.2，含0.05％吐温20)稀释为1×108pfu/ml，每孔加入100μL稀释的重组T4噬菌体，4℃放置12小时以上。用清洗缓冲液(PBS，pH7.2，含0.05％吐温20)洗3次后，每孔加入100μL 5％的脱脂奶粉/PBS，37℃放置2小时。用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100μL用1％脱脂奶粉/PBS稀释100倍的鸡血清，37℃反应1小时。再用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100μL用1％脱脂奶粉/PBS稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG抗体(美国Sigma公司)，37℃反应1小时。用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入显色液(10mg TMB溶于10ml无水乙醇)100μL，室温观察颜色变化。在20min达到显色高峰，每孔加入100μL终止液(1mol/L H2SO4)，终止显色反应，在酶标仪上读取OD450值。计算样品检测值(P)与阴性血清检测值(N)的比值P/N，P/N值大于2.1时，判定为阳性。
该方法具有良好的特异性。用该方法检测鸡新城疫(ND)特异性血清、鸡脑脊髓炎(AE)特异性血清、鸡传染性支气管炎(IB)特异性血清、鸡传染性喉气管炎(ILT)特异性血清、鸡传染性囊病(IBD)特异性血清，无交叉反应性。对采自现场的84份鸡血清样品进行检测，检出阳性66份，阴性18份(表2)。
表2鸡血清ELISA检测结果


序列表<110>华南农业大学<120>一种展示流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体及其应用<130>SEQ ID NO1<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>654<212>DNA<213>Avian influenza virus<400>1atggattcca acactgtgtc aagtttccag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa60
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<110>华南农业大学<120>一种展示流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体及其应用<130>SEQ ID NO2<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>217<212>PRT<213>Avian influenza virus<400>1Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp1 5 10 15
His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe20 25 30Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Lys Gly Arg Gly Ser35 40 45Thr Leu Gly Leu Asp Ile Arg Thr Ala Thr Arg Glu Gly Lys His Ile50 55 60Val Glu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr65 70 75 80Thr Ala Ser Val Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu85 90 95
Glu Met Ser Lys Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr100 105 110Gly Ser Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Asn Ile115 120 125Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu130 135 140Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Asp Glu Gly Thr Ile Val Gly Glu Ile145 150 155 160His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly165 170 175Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val180 185 190
Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Asn Ser Asp Glu195 200 205Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro Lys210 21权利要求
1.一种展示流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体，其特征在于蛋白NS1与T4噬菌体SOC蛋白组成融合蛋白，位于重组T4噬菌体头部表面。
2.根据权利要求1所述的重组T4噬菌体，其特征在于流感病毒非结构蛋白NS1为1)具有SEQ ID NO2所示序列的蛋白质；2)具有SEQ ID NO2所示序列经改变、缺失或增加一个或若干个氨基酸残基仍具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的蛋白质；或3)与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列有80％以上的同源性且具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的重组T4噬菌体，其特征是编码流感病毒非结构蛋白NS1的核苷酸序列为1)SEQ ID NO1；2)SEQ ID NO1经改变、缺失或增加一个或若干个核苷酸仍表达具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的蛋白质的序列；或3)与SEQ ID NO1所示核苷酸序列中连续200碱基以上的区段有80％以上的同源性，且其表达产物仍具有流感病毒非结构蛋白NS1活性的核苷酸序列。
4.一种制备抗NS1的特异性抗体的方法，其特征在于将任意权利要求1-3的重组T4噬菌体作为抗原，直接免疫或将T4噬菌体与佐剂配合后制成疫苗免疫动物，获得抗NS1的特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是用于免疫的动物为兔、鸡、鼠、山羊。
6.一种体外检测动物血清中禽流感特异性抗体的方法，其特征在于将任意权利要求1-3的重组T4噬菌体作为抗原与动物血清反应，然后检测反应结果来评价血清中抗体是否存在。
7.根据权利要求6所述的方法，其中检测方法采用酶联免疫吸附法。
全文摘要
本发明涉及一种展示流感病毒非结构蛋白NS1的重组T4噬菌体，该重组T4噬菌体展示流感病毒非结构蛋白NS1与T4噬菌体SOC蛋白的融合蛋白。本发明进一步涉及重组T4噬菌体在检测流感抗体中的应用。本发明提供的重组T4噬菌体易于纯化，展示在T4噬菌体表面的NS1蛋白具有完整的空间构象；与SOC融合表达的NS1蛋白的拷贝数高；T4噬菌体本身充当了NS1蛋白的载体；当本发明提供的重组T4噬菌体作为抗原时，NS1的免疫原性比单独的NS1蛋白强；作为疫苗的抗原、或者作为免疫检测的抗原使用时，和其它的蛋白表达系统表达的NS1蛋白相比具有明显的优点。
文档编号C07K16/18GK1800376SQ20051012641
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者曹永长, 谢青云, 陈丽, 马静云, 毕英佐 申请人:华南农业大学