专利名称：流感病毒非结构蛋白1抑制剂的设计方法
相关申请的交叉引用本申请要求下列临时申请的优先权60/425,661，申请日为2002年11月13日；60/477,453，申请日为2003年6月10日，其内容在此作为参考。
政府资助研究资金部分由全国卫生研究所资助，合约号为Nos.GM47014和AI11772。
背景技术：
流感病毒是一种关乎人类健康的重要问题。它能够引发被称为流感的极具传染性的急性呼吸道疾病。据估计，1918-1919年“西班牙流感”的大流行在世界范围内造成5亿人发病，结果有2000万人死亡(Robbins，1986)。1918年的病毒毒力的遗传决定簇仍然没有得到鉴定，也没有专门的临床预防措施或治疗手段来有效的应对其再次发生，参见Tumpey等，PNAS USA 99(15)13849-54(2002)。1918年的或类似的流感病毒再次出现的潜在威胁引起极大的关注是毫不奇怪的，无论它是通过自然原因或由生物恐怖主义造成。甚至在非传染的年份，流感病毒传染仅在美国每年造成约2万到3万人的死亡(Wright&Webster，(2001)Orthomyxoviruses.In“Fields Virology，4th Edition”(D.M.Knipe，and P.M.Howley，Eds.)pp.1533-1579.Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。此外，尚有难以计数的由于在几天或数周中克服疾病的轻微症状而造成人们的生产力和生活质量的损失。另一个复杂的因素是流感A病毒要经历持续的抗原决定簇变化，从而造成每年都能分离新的菌株。简单的讲，就是持续需要新的种类的抗流感病毒试剂。
流感病毒是正粘病毒科的唯一成员，根据它们核蛋白(NP)和基质(M)蛋白的抗原性的不同，被分为3个不同的型(A、B和C)(Pereira，(1969)Progr.Molec.Virol.1146)。正粘病毒为直径约100纳米的有囊膜的动物病毒。流感病毒由含有单链RNA基因组的内部核蛋白核心(螺旋状的核壳体)，以及内部衬有基质蛋白(M)的外层脂蛋白囊膜。分段的流感A病毒的基因组由8个(流感C病毒是7个)分子线性的负极性的编码10个多肽的单链RNAs组成，这10个多肽包括RNA指导的RNA多聚酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核蛋白(NP)；基质蛋白(M1，M2)；两个从脂蛋白囊膜中突出的表面糖蛋白红血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)；以及非结构蛋白，其功能在下面阐述(NS1和NS2)。基因组的转录和复制在核内进行，通过在质膜上的芽生进行组装。病毒可以在混合感染期间再次分配基因。
流感病毒RNA的复制和转录需要4个病毒编码的蛋白NP和3个病毒RNA依赖的RNA多聚酶成分，PB1、PB2和PA(Huang et al.，1990，J.Virol.645669-5673)。NP是病毒体的主要结构成分，其与基因组RNA相互作用，在RNA合成期间用来抗终止(Beaton&Krug，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836282-6286)。NP在RNA链的延长过程中也是必需的(Shapiro & Krug，1988，J.Virol.622285-2290)，但不是RNA链起始所必需的(Honda，et al，1988，J.Biochem.1041021-1026)。
流感病毒通过HA吸附到细胞膜的糖蛋白和糖脂类的唾液酸寡糖上。继病毒体的内吞之后，HA分子的构象改变发生在细胞的核内体，促进膜融合，这样就引发了病毒粒子的脱壳。核壳体迁移到细胞核，其中进行的病毒mRNA转录是感染的重要起始阶段。病毒mRNA通过一个独特的机制进行转录，其中病毒核酸内切酶切割来自于细胞的异种mRNA的“带有帽子”的5’末端，然后将其作为引物通过病毒的转录酶转录病毒RNA模板。在距离模板末端的15-22碱基处终止转录，在此寡核苷酸(U)序列作为加入模板非依赖的多聚(A)尾的信号。这样制备的8个病毒mRNA分子中，有6个是单顺反子，直接转录成HA、NA、NP所代表的蛋白和病毒多聚酶蛋白，PB2、PB1和PA(流感病毒已从人、哺乳动物和鸟类中分离，根据它们的表面糖蛋白、红血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)进行分类)。
其它两个转录子经过剪切，每一个转录子都产生2个mRNA，以不同的阅读框架翻译得到M1、M2、非结构蛋白-1(NS1)和非结构蛋白-2(NS2)。真核细胞通过产生包含干扰素的一组蛋白来抵御病毒感染。NS1蛋白通过抑制宿主菌中产生的干扰素而促进流感病毒的复制和感染。流感A病毒的NS1蛋白的长度是可变的(Parvinetal.，(1983)Virology 128512-517)，并可耐受其羧基末端的大段删除而不影响其功能的完整性(Norton et al.，(1987)156(2)204-213)。NS1蛋白含有两个功能域，即结合双链RNA(dsRNA)的域和效应域。效应域位于蛋白的C末端区域。相对来说它的功能已得到很好的确定。详细来说，效应区域是通过与宿主核蛋白相互作用来实现将核RNA输出功能的(Qian et al.，(1994))J.Virol.68(4)2433-2441)。
NS1A蛋白的dsRNA结合域定位于它的氨基末端(Qian et al.，1994)。氨基末端的片段，其由起始的73个氨基末端的氨基酸组成[NS1A(1-73)]，具有全长蛋白的dsRNA结合特性(Qian et al.，(1995)RNA 1948-956)。NS1A(1-73)的NMR溶液和X-射线晶体结构显示在溶液中其以独特的六螺旋链折叠形成对称的同源二聚体(Chien et al.，(1997)Nature Struct.Biol.4891-895；Liuet al.，(1997)Nature Struct.Biol.4896-899)。NS1A(1-73)域的每一个多肽链都由3个α-螺旋组成，相应的片段为Asn4-Asp24(螺旋1)，Pro31-Leu50(螺旋2)，和Ile54-Lys70(螺旋3)。NS1A(1-73)表面特征的初步分析表明有2个可能的核酸结合位点，一个包含大部分由碱性侧链组成的螺旋2和2’的暴露于溶剂中的伸展，另一个在分子的相反位置，包括一些螺旋3和螺旋3’的赖氨酸残基(Chien etal.，1997)。随后进行的定点突变实验显示第二个α-螺旋中的两个碱性氨基酸(Arg38和Lys41)侧链是完整二聚体蛋白的dsRNA结合活性所必需的唯一氨基酸侧链(Wang et al.，1999RNA 5195-205)。这些研究也证明NS1A(1-73)域的二聚化是dsRNA结合所必需的。然而，撇开结合dsRNA不谈(例如，Hatada&Futada，(1992)J.Gen.Virol.，Vol.73(12)3325-3329；Lu et al.，(1995)Virology，214222-228；Wang et al.，(1999))，dsRNA的结合域的精确功能还没有被确定。
本发明概述本发明应用了申请人关于NS1蛋白，特别是蛋白N-末端部分的dsRNA结合域是怎样参与流感病毒的感染过程的发现。申请人发现NS1A蛋白的RNA结合域对流感A病毒的复制和致病性是至关重要的。申请人发现当NS1A的结合域在宿主细胞中与dsRNA结合时，宿主细胞无法激活它的病毒防御系统来抑制病毒蛋白的产生。NS1A结合dsRNA造成酶、双链RNA激活蛋白激酶(“PKR”)保持无活性状态，以至于它不能催化翻译起始因子eIF2α磷酸化，否则此因子会抑制病毒蛋白的合成和复制。他人以前的报道显示参与抑制PKR的氨基酸不包含结合dsRNA所必需的氨基酸。与这些报道相反的是，申请人还发现流感A和B病毒的NS1蛋白中的两个氨基酸残基(也就是，NS1A精氨酸38(R38)和赖氨酸41(K41)；NS1B精氨酸50(R50)和精氨酸53(R53))是RNA结合中的关键残基，也以所述方式与dsRNA结合域的解除宿主细胞防御的能力有关。申请人发现根据上述，NS1A或NS1B与dsRNA有一个结构分界面，并限定了界面的结构性特征，它是药物设计的靶点。申请人发明了一系列确定NS1A或NS1B与dsRNA之间相互作用的特征的检测方法，可用于在小范围和/或高通量筛选这种相互作用的抑制剂。申请人还发现一种氨基末端的片段，其由氨基端的初始93个氨基酸组成[NS1B(1-93)]，具有流感B病毒的全长NS1蛋白的dsRNA结合特性。
本发明的一个方面涉及具有抑制流感病毒活性的化合物的鉴定方法，其包含a)制备一个反应体系，其包括流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合域，与上述蛋白结合的dsRNA或其结合域，和候选化合物，和；b)检测NS1蛋白和dsRNA间的结合程度，其在该化合物的存在下，与对照相比，NS1蛋白和dsRNA间的结合能力降低预示化合物对流感病毒有抑制活性。对鉴定的对流感具有抑制活性的化合物进行进一步实验以确定它们是否适合作为药物。通过这种方式，对流感病毒复制最有效的抑制剂可以在随后的动物实验中来确定，也可以用来治疗(预防疾病或其它)包括人的动物的流感病毒感染。
相应的，本发明的另一个方面涉及具有抑制流感病毒活性的化合物的鉴定方法，包含a)制备一个反应体系，其包括一种流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合域，与上述蛋白结合的dsRNA或其的结合域，和候选化合物，和；
b)检测NS1蛋白和dsRNA间的结合程度，其中在此化合物的存在下，与对照相比，NS1蛋白和dsRNA间的结合能力降低预示化合物对流感病毒有抑制活性；和c)检测b)中鉴定的具有抑制活性的化合物在体外对流感病毒生长的抑制程度。
在一些实施方案中，此方法进一步需要d)确定c)中鉴定的具有在体外抑制流感病毒生长的化合物对非人动物中的流感病毒复制的抑制程度。
此外，本发明的另一个方面涉及一种在体内外抑制流感病毒复制的组合物的制备方法，其包括a)制备一个反应体系，其包括流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合域，与上述蛋白结合的dsRNA或其结合域，和候选化合物；b)检测NS1蛋白和dsRNA间的结合程度，其中在此化合物的存在下，与对照相比，NS1蛋白和dsRNA间的结合能力降低预示化合物对流感病毒有抑制活性；c)检测b)中鉴定的具有抑制活性的化合物在体外对流感病毒生长的抑制程度；d)检测c)中鉴定的在体外抑制流感病毒生长的化合物在非人动物中抑制流感病毒的复制程度；e)将d)中鉴定的在非人类的动物中抑制病毒复制的化合物以抑制有效剂量与载体一起配制以制备组合物。
在上述本发明的每一个方面中，一些实施方案需要用荧光分子标记NS1蛋白或dsRNA，然后通过荧光共振能量转移或荧光偏振确定结合的程度。在其它实施方案中，对照是dsRNA和NS1蛋白或缺少R38和/或R41氨基酸残基的dsRNA结合域之间的结合程度。其它实施方案需要流感病毒NS1蛋白/dsRNA复合物形成的鉴定方法。然而，仍有其它的实施方案需要利用流感病毒NS1蛋白/dsRNA复合物形成的方法筛选或优化抑制剂。这些实施方案包括NS1蛋白NMR化学位移扰动或RNA凝胶过滤沉降平衡，以及利用NS1蛋白的结构和NS1-RNA复合物模型进行的有效筛选。
本发明的另一个方面涉及含有反应混合物的组合物，其包括流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合片段，与上述蛋白结合的dsRNA。在一些具体的实施方案中，NS1蛋白是NS1A蛋白，或其dsRNA结合片段，蛋白N端的73个氨基酸残基。在另一些实施方案中，NS1蛋白是NS1B蛋白或其dsRNA结合片段，蛋白N端的93个氨基酸残基。在另外一些实施方案中，组合物进一步含有被检测对流感病毒的抑制活性的候选物被检化合物。
本发明的另一个方面涉及鉴定能用来治疗流感病毒感染的化合物的方法，其包括在药物筛选实验中利用NS1蛋白或其dsRNA结合域、NS1A(1-73)或NS1B(1-93)的结构，以及NS1-RNA复合物模型的三维等同物。
本发明的这些和其它方面将参考下图和详细说明来得到更好的阐述。
本专利的文件含有至少一幅彩色图。本专利的带彩图的复制件将经要求和支付必要的费用后由专利和商标局提供。
附图简述
图1不同的双链体结合NS1A(1-73)能力的凝胶位移分析。该实验是在标准的条件下利用指定的32P-标记的双链核苷酸(1.0nM)和有(+)、没有(-)0.4μM的NS1A(1-73)下进行的。
图2在NS1A(1-73)存在下不同的双链体的凝胶过滤色谱图(A)dsRNA；(B)RNA-DNA杂交体；(C)DNA-RNA杂交体；(D)dsDNA。除了(A)中的第一个峰来源于NS1A(1-73)-dsRNA复合物以外，20分钟到30分钟间的主峰都对应于双链体。
图3纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物的凝胶过滤色谱(A)4μM，100μl新鲜的复合物样品；(B)4μM，100μl制备一个月后的复合物样品。
图4(A)根据16000转/分钟时的沉降平衡确定3个样品的化学计量，载样浓度为0.6(□)、0.3(△)和0.5(没有显示以避免数据点重叠)个吸收单位。实线是假设dsRNA∶NS1复合物是1∶1化学计量时，三组数据的联合拟合；插图显示拟合的随机残留图。带点的线是假设dsRNA∶NS1复合物是1∶2化学计量而画的。(2∶1复合物具有与带点的线所显示的几乎相同的浓度分布图，这是因为dsRNA和NS1蛋白的几乎相同的降低的分子量(参见infra))。(B)3个样品(见上)在16000(□)，22000(○)和38000(△)转每分钟的速度时估计的沉降平衡的解离常数。在此只显示出了载样浓度为0.5个吸收单位时的数据。实线是利用一个理想的NONLIN单-二聚体模型的整体拟合，利用Eq.7根据拟合结果计算解离常数。插图显示拟合的残留图。
图5(A)2.0mM均一的15N-富集的NS1A(1-73)在20℃，pH6.0的含有50mM醋酸铵和1mM叠氮化钠的95％H2O/5％D2O的溶液中的二维1H-15N的HSQC图谱。交叉的峰用各自的共振定位来标出，其中显示氨基酸的一个字母的代码和序列号。同时也显示出色氨酸侧链NH共振和谷氨酰胺及天冬酰胺侧链的NH2的共振。定位的精氨酸的Nε-Hε共振峰从高磁场中的位置在F1(15N)维经过了折叠。(B)以1HN-15N的HSQC谱表示的15N-富集的NS1A(1-73)和16-bp dsRNA在pH6.0，20℃条件下不形成复合物(红色)和形成复合物(蓝色)的覆盖图。标记相应于游离蛋白质的良好分辨的交叉峰的酰胺骨架定位。
图6(A)NS1A(1-73)的带状图表显示化学位移扰动测量的结果。在NS1A(1-73)-dsRNA复合物的NMR谱中，产生位移扰动的NS1A(1-73)残基用蓝绿色标出，对其酰胺基的15N和1H的化学位移没有改变的残基用粉红色标出，白色代表由于互相重叠的交叉峰造成的二维HSQC谱中无法鉴别的残基的化学位移定位。(B)图6B中显示的侧链在此也用所有标记的碱性残基列出。注意NS1A(1-73)和dsRNA的结合抗原决定簇似乎在结构的底部。
图7纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物(A)，双链体和NS1A(1-73)的混合物RNA-DNA杂交体(B)，以及DNA-RNA杂交体(C)的CD谱。橙色混合物(双链体和蛋白二聚体摩尔比率为1∶1)的实验CD光谱。红色双链体自身。蓝色NS1A(1-73)自身。绿色计算的双链体和NS1A(1-73)的总光谱。
图8NS1A(1-73)的dsRNA结合特性的模型。此模型对验证暗示假设而设计的实验是有用的。磷酸盐骨架和dsRNA的碱基对分别以橙色和黄色显示。所有的精氨酸和赖氨酸侧链都以绿色标出。
实施本发明的最好方式本发明提供设计来自流感A和B病毒NS1蛋白的dsRNA结合域的特异抑制剂的方法。流感A病毒NS1蛋白的dsRNA结合域的氨基酸序列，特别是R38和K41残基实质上是保守的。流感A病毒的各种株的NS1蛋白的多序列比对在表1中描述。
此外，示例性的，流感A病毒的各种株的NS1蛋白的氨基酸序列在下面列出。
流感A病毒A/Udorn/72的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDPNTVSSFQ VDCFLWHVRK RVADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLDIETATRA61 GKQIVERILK EESDEALKMT MASVPASRYL TDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMD121 QAIMDKNIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLPSLPGHTAEDVKNAVGV181 LIGGLEWNDN TVRVSETLQR FAWRSSNENG RPPLTPKQKR EMAGTIRSEV流感A病毒A/鹅/广东/3/1997(H5N1)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTITSFQ VDCYLWHIRK LLSMSDMCDA PFDDRLRRDQ KALKGRGSTL GLDLRVATME61 GKKIVEDILK SETNENLKIA IASSPAPRYV TDMSIEEMSREWYMLMPRQKITGGLMVKMD121 QAIMDKRIIL KANFSVLFDQ LETLVSLRAF TESGAIVAEI SPIPSVPGHSTEDVKNAIGI181 LIGGLEWNDN SIRASENIQR FAWGIRDENG GPSLPPKQKR YMAKRVESEV流感A病毒A/QUAIL/NANCHANG/12-340/2000(H1N1)的NS1蛋白的氨基酸序列1 ELGDAPFLDR LRRDQKSLKG RGSTLGLNIE TATCVGKQIV ERILKEESDE AFKMTMASAL61 ASRYLTDMTI EEMSRDWFML MPKQKVAGPLCVRMDQAIMD KNIILKANFSVIFDRLETLT121 LLRAFTEEGA IVGEISPLPS LPGHTNEDVK NAIGVLIGGL EWNDNTVRVS ETL流感A病毒gi|577477|gb|AAA56812.1|[577477]的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVRK RFADQEMGDA PFLDRLRRDQ KSLGGRGSTL GLDIETATRA61 GKQIVEPILE EESDEALKMT IASAPVSRYL PDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD121 QAIMDKNITL KANFSIIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEISPVPSLPGHTDEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRDSETLQR FAWRSSNEDR RPPLPPKQKR KMARTIESEV流感A病毒gi|413859|gb|AAA43491.1|[413859]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVRK RFADQERGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLDIETATCA61 GKQIVERILK EESDEALKMT IASVPASRYL TDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD121 QAIMDKNIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLPSLPGHTDEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSETLQR FAWRSSNEDG RPPFPPKQKR KMARTIESEV流感A病毒gi|325085|gb|AAA43684.1|[325085]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVPK RFADQKLGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRASTL GLDIETATRA61 GKQIVERILE EESNEALKMT IASVPASRYL TDMTLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMD121 QAIMEKSIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLHSLPGHTDEDVKNAVGV181 LIGGLEWNGN TVRVSENLQR FAWRSRNENE RPSLPPKQKR EVAGTIRSEV流感A病毒gi|324876|gb|AAA43572.1|[324862]的NS1蛋白的氨基酸序列1 NTVSSFQVDC FLWHVRKRFA DQELGDAPFL DRLRRDQKSL RGRGSTLGLD IETATRAGKQ61 IVERILVEES DEALKMTIVS MPASRYLTDM TLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMDQAI121 MDKNIILKAN FSVISDRLET LILLRAFTEE GAIVGEISPL PSLPGHTDEDVKNAIGDLIG181 GLEWNDNTVR VSETLQRFAW RSSNEDGRPL LPPKQKRKMA RTIESEV
流感A病毒gi|324862|gb|AAA43553.1|[324862]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDPNTVSSFQ VDCFLWHVRK QVADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLNIETATRV61 GKQIVERILK EESDEALKMT MASAPASRYL TDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCIRMD121 QAIMDKNIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEAGAIVGEI SPLPSLPGHTNEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSKTLQR FAWRSSDENG RPPLTPK流感A病毒gi|324855|gb|AAA43548.1|[324855]的NS1蛋白的氨基酸序列1 NTVSSFQVDC FLWHVLKRFA DQELGDAPFL DRLRRDQKSL RGRGSTLGLD IETATRAGKQ61 IVERILEEES DEALKMNIAS VPASRYLTDM TLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMDQAI121 MDKNIILKAN FSVIFDRLET LILLRAFTEE GAIVGEISPL PSLPGHTDEDVKNAIGILIG181 GLEWNDNTVR VSETLQRFAW RSSNEDGRPP LPPKQKWKMA RTIEPEV流感A病毒gi|324778|gb|AAA43504.1|[324778]的NS1蛋白的氨基酸序列1 NTVSSFQVDC FLWHVRKRFA DLELGDAPFL DRLCRDQKSL RGRSSTLGLD IETATRAGKQ61 IVERILEEES DETLKMTIAS APAFRYPTDM TLEEMSRDWFMLMPKQKVAGSLCIRMDQAI121 MDKNIILKAN FSVIFDRLET LILLRAFTEE GAIVGEISPL PSLPGHTNEDVKNAIGDLIG181 GLEWNDNTVR VSETLQRFAW RSSNEGGRPP LPPKQKRKMA RTIESEV流感A病毒A/PR/8/34的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTITSFQ VDCYLWHIRK LLSMRDMCDA PFDDRLRRDQ KALKGRGSTL GLDLRVATME61 GKKIVEDILK SETDENLKIA IASSPAPRYI TDMSIEEISREWYMLMPRQKITGGLMVKMD121 QAIMDKRITL KANFSVLFDQ LETLVSLRAF TDDGAIVAEI SPIPSMPGHSTEDVKNAIGI181 LIGGLEWNDN SIRASENIQR FAWGIRDENG GPPLPPKQKR YMARRVESEV
流感A病毒A/火鸡/俄勒冈州/71(H7N5)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTITSFQ VDCYLWHIRK LLSMRDMCDA PFDDRLRRDQ KALKGRGSTL GLDLRVATME61 GKKIVEDILK SETDENLKIA IASSPAPRYI TDMSIEEISREWYMLMPRQKITGGLMVRPL121 WTRG流感A病毒A/香港/1073/99(H9N2)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDSNTVSSFQ VDCFLWHVRK RFADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLRGRGSTL GLDIRTATRE61 GKHIVERILE EESDEALKMT IASVPASRYL TEMTLEEMSRDWLMLIPKQKVTGPLCIRMD121 QAVMGKTIIL KANFSVIFNR LEALILLRAF TDEGAIVGEI SPLPSLPGHTDEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSETLQR FTWRSSDENG RSPLPPKQKR KVERTIEPEV流感A病毒A/Fort Monmouth/1/47-MA(H1N1)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MDPNTVSSFQ VDCFLWHVRK RVADQELGDA PFLDRLRRDQ KSLKGRGSTL GLNIETATRV61 GKQIVERILK EESDEALKMT MASAPASRYL TDMTIEEMSRDWFMLMPKQKVAGPLCIRMD121 QAIMDKSIIL KANFSVIFDR LETLILLRAF TEEGAIVGEI SPLPSLPGHTNEDVKNAIGV181 LIGGLEWNDN TVRVSKTLQR FA流感B病毒的变株也具有相似的dsRNA的结合域。流感B病毒的各种各样的变株的NS1蛋白的多序列比对在表2中描述。
此外，仅通过例子，流感B病毒的各种各样的变株的NS1蛋白的氨基酸序列在下面列出。
流感B病毒(B/Lee/40)的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERFSWQRAL DYPGQDRLHR LKRKLESRIK61 THNKSEPENK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGPEPYCVKNPSTSKCPNYDWTD121 YPPTPGKYLD DIEEEPENVD HPIEVVLRDM NNKDARQKIK DEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGD KSLSTLHRLN AYDQNGGLVA KLVATDDRTVEDEKDGHRIL241 NSLFERFDEG HSKRIRAAET AVGVLSQFGQ ERRLSPEEGD N流感B病毒B/Memphis/296的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEEPEDVD GPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRIN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒gi|325264|gb|AAA43761.1|[325264]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MNPSAGIEGFEPYCMKNSSNSNCPNCNWTD121 YPPTSGKCLD DIEEEPENVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERFNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒B/Ann Arbor/1/66[gi|325261|gb|AAA43579.1|[325261]]的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSSQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MNPSAGIEGFEPYCMKNSSNSNCPNCNWTD121 YPPTPGKCLD DIEEEPENVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERFNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒gi|325256|gb|AAA43756.1|[325256]的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERFSWQRAL DYPGQDRLHR LKRKLESRIK61 THNKSEPENK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCVKNPSTSKCPNYDWTD121 YPPTPGKYLD DIEEEPENVD HPIEVVLRDM NNKDARQKIK DEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGD KSLSTLHRLN AYDQNGGLVA KLVATDDRTVEDEKDGHRIL241 NSLFERFDEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Shangdong/7/97)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNYPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEETEDVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Nagoya/20/99)的NS1蛋白的氨基酸序列
1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNYPKYNWTN121 YPSTPGRCLD DIEEETEDVD DPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HPKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Saga/S172/99)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEEPEDVD GPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVL8LRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AVGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N流感B病毒(B/Kouchi/193/99)的NS1蛋白的氨基酸序列1 MADNMTTTQI EVGPGATNAT INFEAGILEC YERLSWQRAL DYPGQDRLNR LKRKLESRIK61 THNKSEPESK RMSLEERKAI GVKMMKVLLF MDPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCPKYNWTD121 YPSTPGRCLD DIEEEPEDVD GPTEIVLRDM NNKDARQKIK EEVNTQKEGKFRLTIKRDIR181 NVLSLRVLVN GTFLKHPNGY KSLSTLHRLN AYDQSGRLVA KLVATDDLTVEDEEDGHRIL241 NSLFERLNEG HSKPIRAAET AMGVLSQFGQ EHRLSPEEGD N这样，利用发明中公开的任何一种NS1蛋白或它的与dsRNA结合的片段(有完整NS1A的R38、K41残基，有完整NS1B的R50、R53残基)可以鉴定对流感A病毒和流感B病毒株有抑制活性的化合物。
本发明不需要蛋白质是自然界存在的。也可以使用NS1蛋白的类似物，只要它具有与自然界存在的蛋白相当功能的dsRNA结合特异性。代表性的类似物包括蛋白的片段，例如，dsRNA的结合域。除了NS1蛋白的片段，类似物还可以通过替换，删去或增加一个或更多氨基酸而与天然存在的蛋白有所区别。例如，功能相当的氨基酸残基可以通过替换序列中的残基来改变序列。这样的替换可以选自属于同类的其它的氨基酸；例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。可以改变NS1A的R38和K41残基，但有一定限制。例如，申请人确定用赖氨酸残基置换R38，没有观察到对RNA的结合有影响，然而，用丙氨酸替换时就破坏了这种结合活性，表明在这个位置正电荷的碱性氨基酸侧链(例如，赖氨酸或精氨酸)是这些dsRNA-蛋白相互作用所必需的；用剩余的17个天然的常见氨基酸的任何一个替换，象丙氨酸一样，都能预见到活性被破坏。然而在优选的实施方案中，R38和K41残基是完整的。上述说明对NS1B的R50和R53残基同样是适用的。对于本发明的目的，术语“dsRNA结合域”是指包括与自然界存在的蛋白在结合dsRNA方面有相当功能的NS1蛋白的类似物。
本发明的NS1蛋白可根据现有的手册进行制备。流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域可从天然来源获得，例如，利用本领域已知的蛋白分离技术，分别从流感病毒感染的细胞和病毒中纯化；通过本领域已知的重组DNA技术生产(见例如，Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；和/或利用本领域已知技术全部或部分化学合成；例如，多肽可以通过固相技术合成，从树脂上切割，利用制备性高效液相纯化(见例如，Creighton，1983，ProteinStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，pp.50-60)。在Qian et al.，RNA1(9)948-56(1995)和Chien et al.，(1997)中已报道NS1A1-73氨基酸限定的多肽的生物合成实验方法，其带有或不带有适合NMR分析的同位素标记。合成的多肽的组成可以通过氨基酸分析或测序得以确定；例如，利用Edman降解法(见例如，Creighton，1983，supra atpp.34-49)。
申请人的另一个发现是流感病毒非结构蛋白1的NS1A(1-73)dsRNA结合域与在大多数真核和原核蛋白中发现的dsRNA结合域的主要类别，即dsRBMs是不同的。含有dsRBM域的蛋白包括真核蛋白激酶R(PKR)(Nanduri et al.，1998)，该激酶在细胞抗病毒反应中起关键作用，Drosophila melonogaster Staufen(Ramos et al.，2000)，和Escherichia coli RnaseIII(Kharrat et al.，1995)。dsRBM域包含一个单体的α-β-β-β-α折叠。结构分析已确定这个域跨越靶dsRNA的两个小沟和介于其间的大沟(Ryter&Schultz，1998)。dsRBM域的几个氨基酸参与直接的以水作为媒介的磷酸二酯骨架、核糖2’-OH基团以及少量的碱基之间的相互作用。这种结合的结果是，典型的A-型dsRNA双链体在复合物形成时扭曲。这种结合相对来说是较强的，Kd约1纳摩尔。这样，本发明的方法利用了存在于感染的真核细胞中的病毒蛋白和dsRNA之间专门发生的现象。因此，根据本发明的方法鉴定的化合物或许并不影响正常的细胞功能。
申请人还发现NS1A蛋白的RNA结合域的细胞内的功能之一是通过结合dsRNA阻止PKR的活化。申请人生产编码NS1A蛋白的重组A/Udorn/72病毒，其仅缺失了RNA结合功能。由于38位R(R38)和41位K(K41)是唯一的RNA结合所必需的氨基酸，我们用A替换其中一个或两个氨基酸。这3个突变的病毒都大大消弱了毒力R38和K41突变病毒形成针状噬菌斑，双重突变(R38/K41)不能形成可见的噬菌斑。用任何一个突变病毒对A549细胞的高复数感染期间，PKR被活化，eIF2a被磷酸化，病毒蛋白合成被抑制。令人意外的是，在PKR被激活后，PKR被降解。R38/K41双重突变在诱导PKR活化方面是最有效的。
NS1A(1-73)结合dsRNA，但不结合dsDNA或RNA/DNA杂交体。NS1A(1-73)和全长的NS1A蛋白已显示与双链RNAs(dsRNAs)非序列特异性结合(Lu et al.，(1995)Virology 214，222-228，Qianet al.，(1995)RNA 1，948-956，wang et al.，1999)，但直到本发明，一直没有确定NS1A(1-73)或NS1A蛋白能否与RNA-DNA杂交体或双链DNA结合。申请人将NS1A(1-73)和四个32P-标记的双链体一起孵育16-bp的dsRNA(RR)，dsDNA(DD)和两个RNA-DNA杂交双链体(RD和DR)。然后将这些混合物在一个自制的15％聚丙烯酰胺凝胶(图1)上分析。和其他人报道的一样(Roberts and Crothers(1992)Science 258，1463-1466；Ratmeyer et al.，(1994)Biochemistry33，5298-5304；Lesnik and Preier(1995)Biochemistry 34，10807-10815)，申请人观察了游离的双链体在自制的凝胶上的迁移方式(最快-最慢)DD＞DR/RD＞RR(泳道分别是1，3，5和7)。更重要的是，发现仅dsRNA和NS1A(1-73)形成复合物，产生一个30％凝胶位移(泳道2)，然而，所有其它的双链都不能和蛋白结合(泳道4，6和8)。这些数据表明在这样的条件下，NS1A(1-73)能特异性的识别dsRNA(A型构象)的有别于dsDNA(B型构象)或RNA/DNA杂交体(介于A/B构象之间)的构象和/或结构特征。
dsRNA的长度和核苷酸序列不是关键的。在此所述的一些工作例子中，本发明的方法可利用一个短的合成的16-碱基对(bp)的dsRNA进行操作，来鉴定蛋白质RNA相互作用的方式的关键特征。这个dsRNA分子有一个来自于通常使用的29bp的dsRNA结合底物的序列，可以将质粒pGEM1的多接头的有义和反义转录子退火而少量制备(Qian etal.，1995)。根据沉降平衡的测量手段，NS1A(1-73)与这个合成的16-bp的dsRNA双链在溶液中的结合化学计量大约为1∶1(1个蛋白质二聚物和一个dsRNA双链分子)，其双分子解离常数(Kd)在微摩尔范围内。申请人建议其作为适合的dsRNA底物分子可在高通量结合分析中使用。NMR化学位移扰动实验显示NS1A(1-73)的dsRNA-结合抗原决定簇是与反向平行螺旋2和2’相关的，和前面的通过定点突变研究中所示一样(Wang et al.，1999)。纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物的圆形二色性(CD)光谱和游离的dsRNA和NS1A(1-73)的总的CD光谱是相似的，说明作为结合的结果，蛋白或它的A-型靶dsRNA很少发生或没有发生变化。此外，由于已表明NS1A(1-73)既不与相应的DNA-DNA双链体也不与DNA-RNA杂交双链体结合，NS1A(1-73)似乎识别特定的规范的A-型RNA的构象特征，这样，另一个重要的方式，本发明的方法精确的模仿流感病毒NS1蛋白和它的宿主间的相互作用。
本发明的方法有利于在体外的高通量分析的情况下应用。在本发明的这个实施方案中，分析体系可以使用一个或同时使用标准的荧光共振能量转移或荧光偏振方法以及标记的dsRNA分子，或者NS1A或NS1A(1-73)，或NS1B或NS1B(1-93)分子，来检测这些靶蛋白和各种dsRNA双链间的相互作用，测量结合亲和性。根据上面揭示的NS1蛋白的结构，这些分析将用来筛选化合物以鉴定抑制靶NS1和RNA底物间的相互作用的分子。
根据本发明，可检验各种各样的对流感病毒有抑制活性的化合物，包括随机的和偏向的化合物库。偏向的化合物库是利用靶NS1-RNA底物相互作用的位点，例如，根据已发表的结果推论的特殊的结构特征而设计。见例如，Chien et al.，Nature Struct.Biol.4891-95(1997)；Liu et al.，Nature Struct.Biol.4896-899(1997)；和Wang et al.，RNA 5195-205(1999)。
干扰NS1A蛋白和病毒复制所需要的dsRNA间的相互作用的化合物的筛选方法流感病毒的NS1蛋白或其dsRNA结合域，与它相互作用和结合的dsRNA在本文中有时候称为“结合伴侣”。许多分析体系中的任何一种都可用来检验化合物干扰结合伴侣间的相互作用的能力。然而筛选大量化合物的快速高通量分析，包括但不仅限于配基(天然的或合成的)，也优选多肽或小的有机分子。通过此方法鉴定的干扰结合伴侣间的相互作用的化合物应通过基于细胞水平的实验，动物模型的体系和在本文中描述的病人来进一步评价其抗病毒活性。用来鉴定干扰流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，与dsRNA间相互作用的化合物的分析体系的基本的原理包括在一定条件下制备含有流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域与dsRNA的反应混合物，反应进行足够的时间来允许两个结合伴侣相互作用和结合，从而形成一个复合物。为了检验化合物的抑制活性，反应在有和没有被检验的化合物的存在的条件下进行，例如，被检测的化合物可以在一开始加入到反应混合物中，或在加入流感病毒NS1蛋白，或它的dsRNA结合域，和dsRNA之后一段时间后加入；对照是在没有被检测的化合物或有安慰剂的条件下孵育的。然后检测流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，与dsRNA间形成的复合物。在对照反应中形成复合物，但在含有被检测化合物的反应混合物中没有形成复合物表明化合物干扰流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域与dsRNA间的相互作用。
本发明的另一个方面包括有效筛选可用来治疗流感病毒感染的化合物的方法，包括在药物筛选分析中利用流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域NS1A(1-73)或NS1B(1-93)的结构和NS1-RNA复合物模型的三维同等物。
本发明的另一方面包括利用复合物模型的三维同等物设计化合物库用以筛选的方法。
相应的，本发明提供鉴定可用来治疗流感病毒感染的化合物和药物的方法。这样一个实施方案包含鉴定用作流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域的抑制剂的化合物的方法，以及含有来自于流感A或B病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域的三维同等物的数据库。优选与计算机模拟联用而进行的筛选。
在一个实施方案中，潜在的化合物是通过根据流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域的三维同等物进行合理药物设计而筛选的。如上所述，优选和计算机模拟联用而进行的筛选。然后潜在的化合物与流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，及dsRNA接触，干扰它们之间的结合，然后确定化合物抑制结合的能力(例如测量)。当流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域与dsRNA结合能力降低时，潜在的化合物被鉴定为抑制结合的化合物。或者，潜在的化合物接触和/或加到流感病毒感染的细胞培养液，测定了病毒培养物的生长。当病毒培养物的生长降低时，潜在的化合物被鉴定为有抑制病毒生长能力的化合物。
在一个优选的实施方案中，方法进一步包括分子置换分析和二代候选药物的设计，此药物是通过利用药物的三维同等物的合理药物设计进行筛选的。优选与计算机模型联用进行的筛选。然后利用本文中举例的标准的生化方法在大量的药物筛选分析中检验候选药物。本发明的这些例子中NS1A蛋白的三维同等物和NS1A-dsRNA复合物模型或NS1B-dsRNA复合物模型为(a)设计用来筛选的抑制剂库，(b)先导化合物的合理优化，和(c)潜在抑制剂的虚拟筛选提供了方法。
有可能应用的本发明的方法中的其它分析组成和各种形式在下面的部分中描述。
分析组成可以将分析体系中使用的结合伴侣之一直接的或间接的标记，来测定NS1蛋白或dsRNA结合部分与dsRNA间的结合程度。根据以下详细描述的分析形式，结合程度可以以流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，与dsRNA间的络合作用的形式，或在候选化合物存在下，事先形成的复合物的解离程度来测定。可以使用适合标记体系的任意一种包括但不限定于如125I的放射性同位素；暴露于底物时，产生可检测的比色信号或光的酶标体系；和荧光标记。
利用重组DNA技术来产生流感病毒的NS1蛋白或它的dsRNA结合域与分析中的dsRNA结合伴侣有利于工程化融合蛋白，所述融合蛋白能促进标记、固定和/或检测。例如，流感病毒的NS1蛋白或它的dsRNA结合域的编码序列能与具有酶活性或作为酶底物的异源蛋白融合，以促进标记和检测。融合构建物应该设计成使融合产物的异源组分不干扰流感病毒的NS1蛋白或它的dsRNA结合域与dsRNA结合。
间接标记包括使用第三个蛋白，例如标记的抗体，其与流感病毒的NS1蛋白，或它的dsRNA结合域特异结合。这种抗体包括但不限定于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达库产生的片段。
为了生产抗体，用流感病毒的NS1蛋白，或它的dsRNA结合域注射免疫各种宿主动物。这样的宿主动物可包括但不限定于兔，小鼠和大鼠，仅指出一些。根据宿主的种，可使用各种佐剂来增加免疫反应，包括但不限定于Freund’s(完全和不完全)，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂，复合多元醇，聚阴离子，肽，油乳，锁眼形血蓝蛋白，二硝基酚和潜在的有使用价值的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌菌苗。
可以利用任何连续培养细胞生产抗体分子的技术制备单克隆抗体。这些技术包括但不限定于由Kohler和Milstein首次描述的杂交瘤技术(Nature，1975，256495-497)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosboret al.，1983，Immunology Today，472，Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.，802026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。此外，发展的生产“嵌和抗体”的技术也可以使用(Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger et al.，1984，Nature，312604-608；Takeda et al.，1985，Nature，314452-454)，即通过将来自于鼠的适合的抗原特异性的抗体分子的基因和来自于人的适合的生物活性抗体分子的基因拼接在一起。或者，可以采用生产单链抗体(U.S.Pat.No.4,946,778)的技术来产生特异性的针对流感病毒的NS1蛋白，或它的dsRNA结合域的单链抗体。
可识别特定抗原决定簇的抗体片段可以通过已知技术生产。例如，这样的片段包括但不仅限于通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab’)2片段和通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达库(Huse et al.，1989，Science，2461275-1281)来对带有预期的特异性的单克隆Fab片段进行快速的容易的检测。
分析形式可以以多相或均相的形式进行分析。多相分析包括将结合伴侣之一锚定在固相上，检测反应末锚定在固相上的复合物。均相分析中，整个反应在液相中进行。在任何一个方法中，可以改变加入反应物的顺序来获得被检化合物的不同信息。例如，检验干扰结合伴侣间相互作用的化合物，例如通过竞争，可以在被检测底物的存在下进行反应而鉴定；也就是提前或同时将被检测底物和流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，和dsRNA加入到反应混合物中。另一方面，破坏预先形成的复合物的化合物，例如化合物有更高的结合常数从复合物置换其中一个结合伴侣，可以通过在已形成复合物以后的反应混合物中加入检测化合物而鉴定。以下将简单描述各种形式。
在多相分析体系中，结合伴侣之一，例如，流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，或dsRNA被锚定在固相表面，用直接或间接方法标记没有被锚定的结合伴侣。实际上，使用微孔板更方便。锚定的部分可以通过非共价或共价附着以固定。或者，可以使用对流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域特异的已固定的抗体来将流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域锚定在固相表面上。可以事先制备和贮藏此表面。
为了进行分析，将固定的部分的结合伴侣加入到用或不用检测化合物覆盖的表面。反应完成后，移去没有反应的组分(例如通过漂洗)，任何形成的复合物仍将固定在固相表面。可以使用许多方法检测锚定在固相表面的复合物。当结合伴侣被事先标记时，检测固定在表面的标志显示形成了复合物。当结合伴侣没有被事先标记时，可以使用间接标记来检测锚定在固相表面的复合物；例如，使用对结合伴侣特异的标记抗体(反过来，可以直接标记抗体或用标记的抗Ig的抗体间接标记抗体)。根据反应组分的加入顺序，可以检测抑制复合物形成或破坏事先形成的复合物的被检化合物。
备选地，可以在液相中在被检化合物存在或不在的条件下进行反应，将反应产物从未反应的组分中分离并检测复合物；例如，使用对流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域特异的固定的抗体，来锚定溶液中形成的任何复合物。再次的，根据液相中反应组分的加入顺序，可以检测抑制复合物形成或破坏事先形成的复合物的被检化合物。
本发明的其它实施方案可以使用均相分析。在此方法中，制备事先形成的流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域与dsRNA的复合物，其中结合伴侣之一被标记，但标记产生的信号因复合物的形成而淬灭(见例如，Rubenstein的U.S.Pa t.No.4,109,496,利用这种方法进行免疫分析)。和事先形成的复合物竞争并置换结合伴侣之一的检测物质的加入会造成背景之上的信号的产生。以这种方法，可以鉴定破坏流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域与dsRNA的相互作用的被检物质。
例如，一个特定的例子是使用之前描述的重组DNA技术制备流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域用来固定化。利用融合载体pGEX-5X-1，它的编码域可以融合到谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因中，以这种方式在产生的融合蛋白中保留它的结合活性。可以通过上述的和本领域常规的方法纯化流感病毒NS1蛋白或它的dsRNA结合域，用来产生对NS1或NS1片段特异的单克隆抗体。这种抗体可以用放射同位素125I标记，例如，通过本领域常规的方法。在多相分析中，例如可以将GST-NS1融合蛋白锚定在谷胱甘肽-琼脂糖珠上。然后在被检化合物存在或不在的条件下加入dsRNA以使dsRNA与融合蛋白的NS1部分相互作用而结合。在被检化合物加入后，可以洗去未结合的物质，在体系中加入标记的NS1特异的单克隆抗体以使其结合到复合的结合伴侣上。通过测量谷胱甘肽-琼脂糖珠上残留的放射活性的量检测NS1和dsRNA间的相互作用。被检化合物对相互作用的成功抑制会引起测量到的放射活性降低。
或者在液相中没有固体谷胱甘肽-琼脂糖珠时，将GST-NS1融合蛋白和dsRNA混合起来。被检化合物可以在结合伴侣相互作用期间或之后加入。然后将混合物加至谷胱甘肽-琼脂糖珠并洗去未结合的物质。通过测量谷胱甘肽-琼脂糖珠上残留的放射活性的量检测NS1和dsRNA间的相互作用的抑制程度。
根据本发明，抑制一种病毒的给定化合物可以用来检测对大范围不同的流感病毒的全面的抗病毒活性。例如，不限定于此方法，根据下文所说的分析，可以检测通过和NS1结合位点结合而抑制流感A病毒NS1和dsRNA间相互作用的化合物对流感A病毒和流感B病毒的不同的变株。
为了筛选药物研发中潜在的先导化合物，已鉴定的对靶NS1和RNA底物间的相互作用的抑制剂可首先在组织培养，然后在动物模型实验中进一步验证它们对流感病毒复制的抑制能力。利用高和低的感染复数确定每个抑制剂的有效抑制流感病毒复制的最低浓度。
病毒生长实验前述的分析体系中确定的抑制剂的阻止病毒生长的能力可以通过噬菌斑形成或其它的病毒生长的指数分析，例如TCID50或在鸡胚尿囊中的生长。这些实验中，用野生型的流感病毒感染合适的细胞系或含胚卵，在感染时或感染后将被检化合物加入到组织培养基中。被检化合物的效果通过病毒颗粒形成定量进行评价，由感染细胞或感染的鸡胚尿囊液上清测定的红血球凝集素(HA)滴定量；通过病毒噬菌斑的呈现；或不呈现噬菌斑表型的情况下，通过TCID50或在鸡胚尿囊中的生长指数，或红血球凝集素分析而评价。抑制剂可以通过被检化合物抑制HA滴定量或噬菌斑形成，或降低病毒感染的细胞或鸡胚尿囊的细胞病变效果的能力，或降低在红血球凝集素分析中测定的病毒颗粒形成的能力而评价。
动物模型实验通过本发明的方法鉴定的对病毒复制最有效果的抑制剂可以用来进行后续的动物实验。抑制剂阻止流感病毒复制的能力可以在天然的或改造的流感宿主的动物模型中分析。这些动物可以包括如猪，雪貂，小鼠，猴，马和灵长类的哺乳动物，或鸟类。和在此详述的一样，这些动物模型可用来确定动物中的LD50和ED50，这些数据可用来获得NS1A(1-73)或NS1B(1-93)和dsRNA相互作用的抑制剂的治疗指数。
经高通量筛选确定的抑制剂表征的NS1蛋白或它的dsRNA结合域表面的结合位点有助于优化设计先导化合物。这些表征可以利用核磁共振化学位移扰动NMR和NMR共振定位而进行。NMR可以确定小分子抑制剂对RNA的结合位点。对这些结合位点的定位可以为联合多起始抑制剂先导物和先导物设计的优化提供数据。
药物制备和给药方法已鉴定的抑制病毒复制的化合物可以在治疗有效的剂量下让病人服用来治疗病毒感染。治疗有效剂量是指足够导致病毒感染症状缓解的化合物的量。
这类化合物的治疗效率和毒性可通过细胞培养或实验动物中标准的药学程序来确定，例如，确定LD50(使50％动物死亡的剂量)和ED50(使50％动物有效治疗的剂量)。毒性和治疗有效的剂量比值是治疗指数，可表示成比例LD50/ED50。优选显示大的治疗指数的化合物。使用表现有毒副作用的化合物的同时，要小心设计一个将此化合物靶向定位到感染部位的输送体系，来最大限度减少药物对不感染的细胞的损伤并减少副作用。
从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可以用来计算在人身上使用的剂量范围。优选包括有很少或没有毒性的ED50的循环浓度范围内的化合物剂量。剂量可根据使用的剂型和给药方式在此范围内变动。本发明的方法中使用的任一种化合物，可以从最初的细胞培养实验中估计有效剂量。在动物模型中计算剂量以实现包括在细胞培养中确定的IC50(也就是，获得半数最大感染，或半数最大抑制的被检化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可用来更精确的确定人类中的使用剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相层析。
根据本发明使用的药物组合物可以用传统的方式用一个或更多的生理可接受的载体或赋形剂配制。
这样，化合物和它们的生理可接受的盐和溶剂化盐可配制成通过吸入或吹入(或通过口或鼻)或口服、口腔、非肠道或直肠的给药方式用药。
对于通过吸入的给药方式，本发明使用的化合物可便利的以气雾喷射呈现的形式，用适合的推进剂例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体，从压力器或喷射式雾化器中输送。在使用压力气雾剂的情况下，可通过提供一个阀门输送一定数量的气体而确定剂量单位。在吸入或吹入的给药方式中使用的例如明胶的胶囊和药桶可制成含有化合物和如乳糖或淀粉的合适的粉末基的粉末混合物。
对于口服的给药方式，药物组合物通过常规的方法用制药上可接受的赋形剂如粘结剂(例如，预糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙甲纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)制备成如片剂或胶囊的形式。可用本领域已知的方法给片剂包衣。口服药物的液体制剂可采用，如溶液，糖浆或悬浮液的形式，或它们以干产品的形式出现但在使用前用水或其它适当的介质配成。可通过常规方式加入制药上可接受的添加剂，例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆，纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水媒介(例如，杏仁油，油酯，酒精或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)制备液体制剂。制剂中也可以含有适量的缓冲盐，调味品，色素和甜味剂。
口服给药的制剂可以适当的配制成活性化合物的可控制释放形式。
口腔给药的组合物可采用常规方式配制成片剂或止咳糖浆的形式。
化合物可以配制成通过注射的非肠道给药形式，例如，通过大丸药注射或连续灌输。用来注射的制剂可以以单位剂量形式呈现，例如，在加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可采用悬浮液，溶液，或油介质或水介质的乳状液的形式，可含有赋形剂例如，悬浮，稳定和/或分散剂。或者，活性的组分以粉状的形式与适合的介质例如，无热源的无菌水在使用前配成。
化合物也可制成直肠给药的组合物如栓剂或滞留型灌肠剂，例如，含有传统的如可可油或其它的甘油酯的栓剂基。
除了前述的制剂以外，化合物也可以制成储存剂型。这种长效制剂可通过移植(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉注射给药。这样，例如，化合物可与适当的聚合或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或以惰性的(Sparingly)可溶衍生物，例如，惰性的可溶盐的形式进行配制。
如果希望的话，组合物可存在于包装或分配器中，其可包含含有活性组分的一个或多个单位剂量形式。例如此包装可包括金属或塑料薄片，例如硬质泡沫塑料衬垫包装。此包装或分配器和用药说明书放在一起。
本发明并不限定于在本文中所述的实施方案，只要不脱离本发明的范围都可以修饰或改变。
实施例1蛋白样品的制备用编码NS1A(1-73)的表达载体pET11a转化E.coli BL21(DE3)细胞培养物，在37℃的条件下培养，然后在菌体密度OD600＝0.6时，用1mM IPTG在含有均一富集的15NH4Cl和13C6-葡萄糖分别作为唯一的氮源和碳源的MJ最小培养基(Janssonet al.，(1996)J.Biomol.NMR 7，131-141.)中诱导5个小时。细胞经超声破碎，接着在4℃，100,000×g的条件下离心1个小时。然后根据别处描述的方法，使用Pharmacia FPLC系统的离子交换和凝胶过滤层析方法从上清中纯化蛋白(Qian et al.，(1995)RNA 1，948-956.)。纯化的NS1A(1-73)的总产量每升培养液约5毫克。蛋白的浓度是利用5750M-1Gm-1单体摩尔消光系数(ξ280)在280nm的吸光度(A280)而确定。
实施例2RNA寡聚体的合成和纯化利用标准的亚磷酰胺化学(Wincott et al.，(1995)Nucleic Acids Res.23，2677-2684)在一个DNA/RNA合成仪Model 392(Applied Biosystem，InC.)化学合成两个单链(ss)的16-核苷酸(16-nt)RNA，CCAUCCUCUACAGGCG(有义)和CGCCUGUAGAGGAUGG(反义)。然后将这两个RNA寡聚体通过Bio-Rad Econo-Pac 10DG柱脱盐，通过20％(w/v)聚丙烯酰胺，7M尿素变性胶的制备凝胶电泳纯化。将通过UV影像观察的适当的产物条带切去，压碎，在温和的摇动过夜的条件下将产物提取到90mM Tris-硼酸，2mM EDTA，pH8.0的缓冲液中。将得到的溶液通过冻干而浓缩并使用Econo-Pac 10DG柱再次脱盐。然后将纯化的RNA寡聚物再次冻干，在-20℃保存。含有同样序列的类似的16-nt有义和反义DNA链可以从Genosys Biotechnologies，Inc购买。根据260nm处的吸收(A260)利用下面的摩尔消光系数(□260，在20℃的M-1cm-1)(+)RNA，151 530；(-)RNA，165 530；(+)DNA，147 300；(-)DNA，161 440；dsRNA，262 580；RNA/DNA，260 060；DNA/RNA，273 330；dsRNA，275 080计算核酸样品浓度。单链的消光系数是由20℃单体和二聚体的消光系数计算的(Cantor et al.，(1965)J.Mol.Bio.13，65-77)，假定摩尔吸收率是最近邻域特性和寡核苷酸在20℃是单链(Hung et al.，(1994)，Nucleic Acids Res.22，4326-4334)。双链的摩尔消光系数从20和90℃的A260值利用下列表达式计算ε(260，20°)＝[A，260，20°)/A，260， 90°)]×ε(260，90°，calc)，在此，ε(260，90°，calc)是假定双链在90℃的温度下完全溶解时从单链的总和而获得的摩尔消光系数。
实施例3聚丙烯酰胺凝胶移位结合分析合成的单链16-nt的RNA和DNA寡核苷酸在其5’端利用T4多核苷酸激酶用[γ32P]ATP标记并用变性尿素-PAGE纯化。将摩尔比约1∶1单链(ss)有义RNA(或DNA)和反义RNA(或DNA)在50mM Tris，100mM NaCl，pH8.0的缓冲液中。将溶液在90℃加热2分钟然后缓慢冷却到室温将双链退火。将最终浓度为0.4μM NS1A(1-73)分别加入到20μl的结合缓冲液(50mM Tris-甘氨酸，8％的甘油，1mM二硫苏糖醇，50纳克/微升的tRNA，40单位的RNasin，pH8.0)中的四个双链(ds)核酸中(dsRNA(RR)，RNA-DNA(RD)和DNA-RNA(DR)杂交体，和dsDNA(DD)，10,000cpm，终浓度约等于1纳摩尔)。将反应混合物冰浴30分钟。蛋白-核酸复合物在4℃，15％非变性PAGE在150伏电压电泳6个小时，在50mM Tris-硼酸，1mMEDTA，pH8.0的缓冲液中从游离的双链或单链寡聚体中溶解。
实施例4凝胶过滤层析分析4个16-nt的双链体(RR，RD，DR和DD)的微摩尔溶液用10mM磷酸钾，100mM KCl，50μM EDTA，pH7.0缓冲液制备并如上述方法退火。然后利用Superdex-75HR 10/30凝胶过滤柱(Pharmacia)从没有退火的或过剩的单链中纯化这些双链，然后将双链调节浓度至4μM。然后将每一种双链核酸加入到1.5mMNS1A(1-73)(单体的浓度)中使双链和蛋白摩尔比例为1∶1。在Superdex-75HR 10/30柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤层析。用四个标准蛋白校准此柱白蛋白(67kDa)，卵清蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)。在10mM磷酸钾，100mM KCl，50μM EDTA，pH7.0缓冲液中在20℃进行层析，流速为0.5毫升每分钟。将1∶1摩尔比的蛋白-双链样品上柱，通过它们的A260检测流出部分的核酸的存在；由于与核酸双链相比NS1A(1-73)的ε260相对小，可以忽略它对UV吸收的贡献。
实施例5NS1A(1-73)-DSRNA复合物的纯化收集相应于凝胶过滤层析中的第一个峰的摩尔比为1∶1的NS1A(1-73)二聚体和dsRNA混合物部分，用Centricon浓缩器(Amicon，Inc.)浓缩到1毫升以下。然后将这个浓缩样品再次上到同样的凝胶过滤柱上再次收集主要的流出部分。纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物的浓度通过测量260nm处的UV吸收而确定。通过将4μM样品加样100μl，利用分析型凝胶过滤对立即制备的和制备一个月以后的样品检测复合物的纯度和稳定性。
实施例6沉降平衡利用一个Beckman XL-I仪器在25℃进行沉降平衡实验。为独立评价这些自由组分的行为，利用Beckman 8-道12毫米路径的charcoal-Epon室在30K至48K转每分钟的速度下进行NS1A(1-73)和dsRNA的短柱层析，上样浓度分别为0.2-2毫克每毫升和0.2-0.6毫克每毫升。利用雷利干扰光学系统获得数据。为了研究NS1A(1-73)二聚体和dsRNA的结合行为，利用Beckman 6-道(1.2厘米路径)的charcoal-Epon室在16K至38K转每分钟的速度下对用凝胶过滤层析纯化的复合物的样品进行长柱层析。利用UV吸收光学系统在260nm，上样浓度为0.3，0.5和0.6吸收单位时获得这些数据。为确保样品平衡，短柱每隔0.5小时共4小时，长柱每隔1-6个小时共28小时进行测量。利用WINMACH(由Yphantis，D.A.和Larry，J开发，由National Analytical Ultracentrifugation Facility at TheUniversity of Connecticut供销)程序计算，当分开一个小时的两次扫描间的区别对于雷利干扰光学在0.005-0.008的范围内，或对于吸光度在0.005OD之时，确定已建立了平衡。
利用WINNL106程序，根据原始的非线性最小平方程序NONLIN(Johnson et al.，1981)的Windows95版本进行数据分析。这些数据要么是每一个数据集中针对特定上样浓度和速度的分别的拟合，要么是几个数据集的组合中针对不同的上样浓度和/或速度联合的拟合。整体拟合是指通过利用所有的数据集和作为普通参数处理的结合常数InK一起进行得到。为了避免偏离Beer’s定律而造成的复杂化，除非标明，吸收数据用与基线区不同的OD≤1.0截断值编辑。
NS1A(1-73)的偏微比体积vNS1和溶剂密度ρ，在25℃利用sednterp程序(Laue et al.，1992)经计算分别为0.7356和1.01156。dsRNA的微比体积vRNA，通过dsRNA样品的沉降平衡实验确定为0.5716(详见结论)。NS1A(1-73)-dsRNA复合物微比体积v复合物，假定1∶1化学计量利用Cohn和Edsall(Cohn&Edsall，1943)方法计算为0.672。
实施例7解离常数的计算1∶1的NS1A(1-73)-dsRNA复合物解离常数是根据原始溶液中游离NS1A(1-73)蛋白和游离dsRNA的量是等摩尔的假设计算的。如果在这些测定中使用的经凝胶过滤纯化的复合物样品实际上是1∶1化学计量时，该假设是有效的。在这种情况下，游离的dsRNA和游离的NS1A(1-73)的量对应从1∶1复合物中解离的量。此外，由于NS1A(1-73)二聚体和dsRNA的分子量降低(在下面Eq.2中定义)的差别仅是3％，将两个自由的大分子当作在沉降期间具有同样的流体动力类型处理。沉降平衡时理想系统的ith类型的浓度分配可以表示成Ci(r)=Ci(r1)eσi(r2/2-r2/2)----(Eq.1)]]>(Johnson et al.，1981)其中C(r)i是在半径为r时ith组分的重量浓度，r’是柱溶液中的一个参考位置。上述等式中的□i是降低的分子量(Yphantis&Waugh，1956)σi＝Mi(1-viρ)ω2/RT. (Eq.2)Eq.2中的Mi和vi是ith种类的分子量和偏微比体积，R是气体常数，T是绝对温度，ω是角速度。浓度通常用重量浓度标度(毫克每毫升)表示，然而，在本例中用摩尔浓度m，mi＝CI/Mi更方便。
基于质量守恒原理(Van Holde&Baldwin，1958)，dsRNA可由下式表示 质量mo是指原始溶液的浓度，m(r)指沉降平衡时半径为r的浓度。下标“RNA，t”，“RNA，游离”和“RNA，x”是分别指dsRNA，游离的dsRNA和NS1A(1-73)-dsRNA复合物中的dsRNA的总量；Tm和rb分别是指溶液柱中半月板和底部的半径值。为了简化以下结果，r’被设定为在rm的位置。综合等式3然后得到
其中m(rb)RNA，游离和m(rb)RNA，x分别指在溶液柱底部的游离的dsRNA和NS1A(1-73)-dsRNA复合物中的dsRNA的浓度。同样的等式也可以表示NS1A(1-73)蛋白。在moRNA等于moNS1时得到等式 利用对于特定蛋白RNA复合物σRNA≈σNS1的事实，Eq.5显示在参考位置m(r’)RNA，游离＝m(r’)NS1，游离，这样，在任何半径r时m(r)RNA，游离＝m(r)NS1，游离。
最终，沉降平衡时半径r的吸收可表示成A260(r)=Exm(r1)RNAeσRNA(r2/2-r2/2)+(1/Ex)Ka[Exm(r1)RNAeσRNA(r2/2-r2/2)]2----(Eq.6)]]>在上面的等式中，Ex＝(εRNA+εNS1)l，其中ε是消光系数，l是光学距离。Ka是摩尔浓度标度表示的结合常数，在mRNA＝mNS1的条件下以函数mx和mRNA袁示(Eq.7)。
Ka＝mx/mRNA2(Eq.7)这样，在沉降期间NS1A(1-73)和dsRNA的结合体系被简化为一个两个组分的简单体系。它易于用拟合参数K2＝Ka/Ex和理想的单体-二聚体自我结合的NONLIN模型进行拟合，NS1A(1-73)和dsRNA复合物的解离常数，Kd从下面的等式中计算KD＝1/(ExE2). (Eq.8)实施例8NMR光谱学所有的NMR数据都是在20℃在4道的Varian INOVA500和600NMR分光计体系中收集的。使用程序VNMR(Varian Associates)，NMRCompass(Molecular Simulations，Inc.)，和AUTOASSIGN(Zimmerman et al.，(1997)J.Mol.Biol.269，592-610)进行数据的处理和分析。质子化学位移参考内2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸；13C和15N的化学位移间接参考使用各自的磁旋比，13C∶15N(0.251449530)和13N∶15H(0.101329118)(Wishart et al.，(1995)J.Biomol.NMR 6，135-140)。
实施例9NS1A(1-73)序列特异性定位用于定位的游离的13C，15N-NS1A(1-73)NMR样品在Shigemi易感性相配的NMR试管中制备，其中有270μl含有50mM醋酸铵和1mM叠氮化钠，pH 6.0的95％H2O/5％D2O溶液中二聚体蛋白浓度为1.0-1.25mM。通过13C，15N-富集的蛋白的三共振NMR光谱自动分析，利用计算机程序AUTOASSIGN(Zimmerman etal.，(1997)J.Mol.Biol.269，592-610)确定骨架1H，13C，15N和13C□共振定位。AUTOASSIGN的输入包括来自于二维1H-15N HSQC和三维HNCO光谱的峰值列表，同时还有来自于3个内部残基[HNCA，CBCANH，和HA(CA)NH]和3个相互残基[CA(CO)NH，CBCA(CO)NH和HA(CA)(CO)NH]实验的峰值列表。这些脉冲序列和优化参数的详细情况在别处已评述(Montelione et al.，(1999)，Berliner，L.J.，和Krishna，N.R.，Eds，Vol.17，pp 81-130，Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York)。AUTOASSIGN所用的峰值列表是利用NMRCompass通过自动峰值采集而产生，然后手工编辑以移去明显的噪音峰和人为的光谱。然后通过手工分析三维HCC(CO)NH TOCSY(Montelione et al.，(1992)J.Am.Chem.Soc.114，10974-10975)，HCCH-COSY(Ikruaet al.，(1991)J.Biomol.NMR 1，299-304)和15N-编辑的TOCSY(Fesik et al.，(1988)J.Magn.Reson.78，588-593)实验和二维TOCSY光谱，记录的混合时间为32，53和75ms(Celda和Montelione(1993)J.Magn.Reson.Ser.B 101，189-193)获得侧链共振定位(除了芳香环侧链的13C定位以外)。
实施例10NMR化学位移扰动实验如上所述纯化和制备15N-富集的NS1A(1-73)。先使用250μl15N-富集的NS1A(1-73)，0.1mM二聚体，在50mM醋酸铵中，1mM叠氮化钠，5％D2O，pH6.0溶液来收集游离蛋白的1HN-15N HSQC光谱。16-nt的有义和反义RNA链以1∶1摩尔比例在200mM醋酸铵，pH7.0的溶液中退火，冻干3次，以同样的NMR样品缓冲液溶解，最终的RNA双链浓度为10mM。然后用这个高度浓缩的dsRNA溶液来滴定游离15N-富集的NS1A(1-73)NMR样品，制备比例为(二聚体蛋白)比(dsRNA)为2∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2的蛋白-dsRNA样品。为了预防NS1A(1-73)的沉淀，样品溶液是通过将游离的蛋白溶液缓慢加入到浓缩的dsRNA中而制备。游离的15N-富集的NS1A(1-73)的HSQC光谱用每增量为80次扫描和200×2048复合物数据点获得，在t1维的调零之后转入1024×2048点。利用每增量320次扫描以同样的数字分析收集dsRNA滴定法测量实验的HSQC光谱。
实施例11CD测量利用配备有1厘米路径长度的小室的Aviv模型62-DS分光偏振计在20℃，200-350纳米区记录CD光谱。从1.1毫升，4μM上述磷酸盐缓冲液中的样品获得四个核酸双链(RR，RD，DR，DD)的CD光谱。然后每一个双链和1.5mM NS1A(1-73)(单体浓度)结合形成蛋白和双链1∶1的摩尔比。在同样的条件下收集这些蛋白-双链混合物的CD光谱，假定每个样品的总双链浓度仍然是4μM。也获得了在相同的磷酸盐缓冲液中4μM浓度的1.1毫升的游离NS1A(1-73)和柱纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物的CD光谱。利用来自于游离NS1A(1-73)和每一个双链核酸各自的CD数据的总和获得计算的蛋白-双链混合物的CD光谱。CD光谱叙述为εL-εR，单位为M-1cm-1每摩尔核苷酸。
实施例12通过凝胶过滤层析对NS1A(1-73)-DSRNA复合物的纯化和表征上述的四个NS1A(1-73)-核酸双链混合物进一步利用分析型凝胶过滤层析分析复合物的形成。NS1A(1-73)-dsRNA混合物在260纳米检测(图2A)的层析图中显示两个主要的峰，而含有dsDNA和RNA/DNA的混合物只被洗脱为一个峰(图2B，C，D)。由于层析洗脱液检测在260纳米处的吸收，这些层析图反映核酸在这些样品中的状态。在dsRNA的例子中(图2A)，快一点和慢一点的洗脱峰分别相应于NS1A(1-73)-dsRNA复合物和未结合的dsRNA双链。对于更快的洗脱峰的洗脱时间和相应的分子量(～26kDa)与1∶1化学计量(蛋白二聚体对dsRNA)的复合物是一致的。在层析条件下使用了复合物组分中约70％的RNA和蛋白werte。其它样品中没有观察到相应于复合物形成的峰。这些结果进一步为NS1A(1-73)与dsRNA，而不是与在此研究中的dsDNA或RNA/DNA杂交体特异性结合提供了证据。在后续的实验(例如，沉降平衡和CD)和评价复合物的长期稳定性(图3)之前也使用制备型凝胶过滤层析纯化NS1A(1-73)-dsRNA复合物。新鲜纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物再次用色谱法分析产生一个相应于相对稳定和纯的复合物的单峰(图3A)。然而，在4℃存放一个月后观察到游离dsRNA的增加(图3B)，表明复合物在长时间时会缓慢的不可逆的分解。
实施例13沉降平衡游离NS1A(1-73)和DSRNA使用沉降平衡来确定NS1A(1-73)和16-bp dsRNA双链间复合物形成的化学计量和解离常数。首先，利用多个加样浓度和多转速将纯化的NS1A(1-73)蛋白和纯化的dsRNA样品进行短柱平衡层析。在溶液中NS1A(1-73)蛋白以二聚体形式存在，分子量为16,851克每摩尔，没有明显的解离信号(无数据)。在一些例子中，用于这些沉降平衡实验的NS1A(1-73)样品包括大的非特异聚集体的存在。每一个样品聚集体形式的总量有所变化，而在高速度下从二聚体种类中分离。这预示聚集是一个缓慢的样品依赖的聚集过程。接着，和dsRNA复合的蛋白样品通过凝胶过滤纯化，之后进行沉降平衡检测(见图3)。纯化的dsRNA样品在沉降期间表现为一种理想的单一组分溶液。将数据和NONLIN模型的单一组分的拟合而得到的估计的降低的分子量不随载样浓度和/或速度的改变而改变。这样利用Eqn.2(见上)，根据估计的减少的分子量能够计算dsRNA的微比体积。获得的值，vRNA＝0.57单位，与典型的DNA(0.55-0.59单位)和RNA(0.47-0.55单位)的偏微比体积有很好的一致性(Ralston，1993)。vRNA的值离dsRNA比离典型的RNA样品要更接近的事实的可能归因于它的双链构型。在减少的分子量中，据保守估计，大约有7％的误差翻译成微比体积中大约相同的误差。在此分析中，假设复合物的形成对dsRNA和NS1A(1-73)蛋白的微比体积没有显著影响。
实施例14根据沉降平衡而得的复合物形成的化学计量和热力学利用上述中制备的纯化的并经分析型的凝胶过滤确定是均一的NS1A(1-73)-dsRNA复合物样品研究NS1A(1-73)蛋白和dsRNA的结合(图3A)。根据16000转每分收集的数据确定复合物的化学计量(图4A)。在这样低的速度下，游离的dsRNA和NS1A(1-73)蛋白有一个小于0.5的σi值(Eqn.2)。在这样低速度的条件下，两个更低的分子量的种类(也就是，游离的NS1A(1-73)和游离的dsRNA)不再进行显著的重新分配，这样对吸收曲线有一个基线的贡献。相应的，利用NONLIN(图4A和表3)将这些数据拟合成一个理想的单组分模型。估计的表观分子量(Mapp)约等于24.4kDa，与从相应的氨基酸和核苷酸序列计算的1∶1NS1A(1-73)-dsRNA复合物的分子量非常接近。相对低的RMS值和随机的残基图(图4A的插图)显示与1∶1化学计量很好的拟合。当数据用截去溶液柱的基底的OD260为0.8编辑时，这种拟合的质量得到进一步改善(表3)。估计的平均分子量26,100克每摩尔，在1∶1NS1A(1-73)-dsRNA复合物的公式分子量的约3％之内。这表明该纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物具有1∶1的化学计量。为了估计解离常数Kd，根据1∶1的化学计量，3个不同载样浓度和3个速度的数据然后拟合成NONLIN的平衡单体-二聚体NONLIN模型(图4B)。利用这个模型，当用小RMS值和随机残留曲线做判断时，数据获得了很好的拟合。为了确认这个拟合模型是正确的，单独的数据集也分别或联合应用不同的组合例如单个载样浓度在3个不同的速度的数据，或不同的载样浓度但在一个速度的数据，等等来拟合。对于每一个拟合，比较了不同的模型。在所有的例子中，单体-二聚体模型是最好的。一个例外是在16,000转每分钟得到的数据，其对于单组分体系和单体-二聚体模型同样很好的拟合。也可能在室的底部用不同的截留值来编辑数据；这就导致了最终的拟合结果在0.8-1.5吸收单位的截去范围彼此独立。根据进行的特定的拟合，利用Eq.8计算的Kd值落在相对窄的范围内，Kd＝0.4-1.4μM。
表3NS1A(1-73)-dsRNA复合物的表观分子量
a通过260纳米的吸收测定的初始的溶液的浓度。
b大于截留值的OD260数据没有包括在拟合中。
c以吸收单位拟合的均方根值。
d表观分子量，单位是千克每摩尔，是通过将数据与单组分的理想溶液拟合而估计的(图4A)。数据或在每个载样浓度单独拟合或联合拟合所有3个数据集。
e根据沉降平衡数据的表观分子量(Mapp)与由相应的氨基酸和核酸序列计算的1∶1NS1A(1-73)-dsRNA复合物的分子量的比例(Mx)。
实施例15游离NS1A(1-73)的1H、15N和13C的共振定位确定游离的NS1A(1-73)蛋白的基本上完整的NMR共振定位，这是通过NMR分析它和dsRNA的复合物所需要的。总之，总共65/71(92％)的指定的15N-1HN位点利用AUTOASSIGN(Zimmerman et al.，(1997)J.Mol.Biol.269，592-610)自动定位。这种自动分析通过内部残基和/或序列连通性提供71/78Hα、68/73Cα、64/71C’和44/68Cβ共振定位。接着进行的同样的三共振数据的手工分析证实了这些AUTOASSIGN的结果，也完成了剩余的骨架原子和60/68Cβ的共振定位。定位了除Met1NH2、Pro31N和C末端残基Ser73的C’以及Pro之前的残基Ala30以外的所有骨架共振。然后获得了所有残基的完整的非-交换质子和质子化碳的完整侧链定位(不包括芳香碳)。关于可交换侧链基团，还定位了所有的ArgNεH、GlnNε2H、AspNδ2H和TrpNε1H共振，但在这些光谱中没有观察到ArgNηH或Ser和Thr的羟基质子。在20℃pH6.0的条件下，这些NS1A(1-73)的1H、13C和15N的化学位移数据已在BioMagResBank(http//www.bmrb.wisc.edu；登录号4317)存放。
在图5中显示了20℃pH6.0时15N富集的NS1A(1-73)1H-15N HSQC光谱。所有骨架酰胺峰(除了Pro31和Met1的N末端)都标记了，如同ArgNεH、GlnNε2H、AspNδ2H和TrpNε1H的侧链共振。总之，光谱展示了合理的好的化学位移分布，即使有一些简并的15N-1HN交叉峰。例如，Arg37和Arg38残基对HN、N、C’、Cα、Hα和Cβ几乎有相同的化学位移。
实施例16利用化学位移扰动的抗原决定簇作图通过收集一系列的1HN-15N HSQC光谱，和16bp的dsRNA一起完成了15N富集的NS1A(1-73)的滴定检测。1H和15N核的化学位移对它们的局部的电子环境是敏感的，因此被用作标记蛋白和未标记RNA间相互作用的探针。观察到和RNA直接接触或参与结合RNA后主要的构象改变的残基在电子环境中有最强的扰动。
记录含有0.1mM NS1A(1-73)二聚体浓度的样品，二聚体蛋白和dsRNA的依次降低的摩尔比例是2∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2时的四个HSQC光谱。当这个比例达到5∶1以上时诱导蛋白质沉淀。在2∶1比例的样品的HSQC光谱中，1HN-15N交叉峰非常宽，难以分析，表明蛋白有可能和dsRNA形成更大分子量的复合物。尽管引入更多的dsRNA以改善敏感度，等于或小于1∶1化学计量的光谱显示仅有一组峰。由于NS1A(1-73)-dsRNA复合物的大分子量，新的复合物中的NS1A(1-73)的骨架定位未能完成。然而，通过比较游离的和dsRNA结合的NS1A(1-73)的HSQC光谱(图5B，上述的滴定实验中产生的数据)，尽管观察到复合物的形成没有影响螺旋3和3’中的骨架酰胺化学位移，但是几乎所有的螺旋2和2’中的残基显示复合物形成时15N和1H位移扰动。另外，螺旋1和1’在复合物形成时也显示化学位移扰动。结合时的15N-1H化学位移的变化由图6中的游离NS1A(1-73)的三维结构中描述。在复合物形成(以蓝绿色表示)时观察到所有显著的相应于NS1A(1-73)骨架原子的化学位移扰动，或在含有许多的精氨酸和赖氨酸的螺旋2和2’中，或在和螺旋2和2’有密切接触的螺旋1和1’中(图7B)。然而，骨架NHs残基没有经历明显的化学位移变化，显示很少或没有结构改变(以粉色表示)，趋向于远离明显的结合抗原决定簇。这些结果确定了dsRNA结合的抗原决定簇的区域在反向平行-螺旋2和2’中或周围的鉴定，与前面的定点突变的研究是一致的(Wanget al.，(1999)RNA，5195-205)。进一步表明，由于远离结合抗原决定簇的酰胺基的化学位移没有被复合物的形成所扰动，所有的NS1A(1-73)的结构没有因dsRNA的结合而严重破坏。
实施例17圆形二色性(CD)光谱圆形二色性为核酸和蛋白质的二级结构元件和完全的构象特征提供了有用的探针。对于蛋白质，CD光谱的180-240纳米的区域主要反映骨架构象的种类(Johnson，W.C.，Jr.(1990)Proteins 7205-214)。一旦形成蛋白-核酸复合物在250纳米以上观察到CD光谱的变化主要是由于核酸二级结构的变化(Gray，D.M.(1996)Circular Dichroism and the ConformationAnalysis of Biomolecules，Plenum Press，New York，469-501)。四个16bp的双链(RR、RD、DR和DD)的CD谱和它们各自的双链类型(图7，红色的痕迹)是截然不同的并且是特有的(Gray and Ratliff(1975)Biopolymers 14487-498；Wells and Yang(1974)Biochemistry 131317-1321；Gray et al.，(1978)Nucleic AcidsRes.53679-3695)。RR双链的特征是在295纳米处有轻微的负方向带，在210纳米处有一个强的负带，在260纳米附近有一个正方向带，是A-型dsRNA构象特有的特征(图7A)(Huang et al.，(1994)NucleicAcids Res.254098-4105)。DD双链在220纳米以上有大致相同的正向和反向的带，交叉的结果是在260纳米处有一个典型的B-DNA(图7D)的正向带(Id.，Gray et al.，(1992)MethodsEnzymol.211389-406)。两个杂交体RD和DR，显示显著的彼此不同的特点，然而这两者都大致介于A-型dsRNA和B-型dsDNA结构之间(图7B，7C)((Hung et al.，(1994)，Nucleic Acids Res.224326-4334)；Roberts和Crothers(1992)Science 2581463-1466；Ratmeyer et al.，(1994)Biochemistry 335298-5304；Lesnik和Freier(1995)Biochemistry 3410807-10815)；Clark et al.，(1997)Nucleic Acids Res.254098-4105。此外，在260纳米的正向带的强度看起来对有A特征的杂交双链最敏感(Clark et al.，(1997)Nucleic Acids Res.254098-4105)。在图7中显示了在等摩尔量的RR、RD、DR或DD双链存在时NS1A(1-73)的CD光谱(橙色痕迹)。
在dsRNA(图7A)的例子中，使用凝胶过滤纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物用来避免游离dsRNA存在的干扰(见图2和3)。也显示了每一种情况中的游离的NS1A(1-73)的光谱(蓝色痕迹)。NS1A(1-73)主要占据了CD光谱的200-240纳米区(Qian et al.，(1995)RNA 1948-956)，而核酸双链的结构信息主要占据250-320纳米的区域。上述的凝胶位移分析和凝胶过滤数据显示只有dsRNA底物和NS1A(1-73)形成复合物。然而，和图8A所示的一样，形成的复合物(黄色痕迹)没能引起250-320纳米区对核苷酸双链构象最敏感的显著的CD光谱变化。这些数据证明RNA双链在蛋白-dsRNA复合物中主要保持它的A-型构象。此外，dsRNA-NS1A(1-73)的CD光谱(黄色)和简单的加入游离的NS1A(1-73)和游离的dsRNA用计算机计算的光谱(绿色)在200-240纳米区也非常相似，显示NS1A(1-73)骨架结构也没有因复合物的形成而广泛的改变。尽管NS1A(1-73)没有和其它双链结合，也将每一个RD、DR和DD与等摩尔量的NS1A(1-73)混合而获得的CD光谱作为对照(图7B、C、D)。这些数据证实当这些分子的结构没有改变时检测到的混合物的CD光谱是与单独的双链和蛋白的光谱的总和是一致的。
由流感A病毒的NS1蛋白的N末端和两个合成的寡核苷酸形成的16bp的dsRNA间的相互作用，已确定i)NS1A(1-73)和dsRNA结合，而不和dsDNA或相应的异种双链结合；ii)NS1A(1-73)-dsRNA复合物显示1∶1的化学计量和约等于1μ摩尔的的解离常数；iii)对称相关的反向平行螺旋2和2’在结合靶dsRNA中起到重要的作用；iv)dsRNA的结构和NS1A(1-73)的骨架结构在它们复合物形成中比它们在相应的未结合分子中没有显著的改变。全面来说，这个信息为建立这个新的dsRNA结合基序和双链RNA间的复合物的假设的模型提供了重要的生物物理证据。此外，这个信息确定了NS1A(1-73)和16bp dsRNA间的复合物是未来进行三维结构分析的一个适合的试剂，也就是说，它是一个均一的1∶1复合物。
实施例18NS1A(1-73)DSRNA复合物的生物物理特征凝胶位移聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶过滤层析和CD旋光分光学都显示NS1A(1-73)特异性的与dsRNA结合，对同序列的dsRAN和杂交双链没有可检测的亲和性。文献中的大量的光谱证据包括核磁共振、X射线、CD和Raman光谱研究已确定dsDNA是C2’-内部糖折叠的B-型构象特征，dsRNA采用一个以C3’-内部糖为特征的A-型结构，以及DNA/RNA杂交体显示介于A-和B-型构象之间的中间构象(Huang.et al.，(1994)Nucleic Acids Res.224326-4334；Lesnik和Freier(1995)Biochemistry 3410807-10815；Dickerson et al.，(1982)Science 21675-85；Chou et al.，(1989)Biochemistry282435-2443；Lane et al.，(1991)Biochem.J.279269-81；Arnottet al.，(1968)Nature 220561-564；Egli et al.，(1993)Biochemistry 2541-50；Gyi et al.，(1996)，Biochemistry3512538-12548；Nishizaki et al.，(1996)Biochemistry354016-4025；Salazar et al.，(1996)Biochemistry358126-8135；Rice和Gao(1997)Biochemistry 36399-411；Hashem等，(1998)Biochemistry 3761-72；Gray et al.，(1995)MethodsEnzymol.24619-34)。
此外，规范的双链的拓扑化是不同的，A-型以一个宽的，浅的小沟为特征，而B-型以一个窄的，深的大沟为特征。由于NS1A(1-73)仅明确与dsRNA结合，而没有序列特异性，很明显这个蛋白很大程度上是根据双链构象区别这些核酸螺旋(也就是，A-型构象)。然而，不排除分子也根据双链的每一个链的2’-OH基的存在而进行识别过程。这些结果为全长的NS1A蛋白和NS1A(1-73)和另一个靶RNA，在一个剪接体小核RNAs中的特定茎-突，U6 snRNA的结合提供了解释(Qianet al.，(1994)J.Virol.682433-2441；Wang和Krug，(1996)Virology 22341-50)。假定这个U6 snRNA的茎突在溶液中形成了一个象dsRNA的A-型结构，允许NS1A(1-73)和U6 snRNA以本文中NS1A(1-73)和16-bp dsRNA片段为特征的类似方式形成复合物。
如上所述的沉降平衡实验证实NS1A(1-73)二聚体和dsRNA双链以1∶1的方式结合，解离常数Kd约为1μM。有趣的是，约30％的dsRNA在二聚体和双链的摩尔比是1∶1的分子筛实验中是未形成复合物的(图2A)，在凝胶移位分析中检测到更多的游离dsRNA(图1)。发现未结合的dsRNA的部分从一个NS1A(1-73)制备物变化为另一个制备物，新鲜纯化的复合物样品的凝胶过滤层析中没有观测到未结合dsRNA(图3A)。此外，观察到复合在长期存放时会缓慢解离(图3B)。因此，推测在这些研究中使用的条件下NS1A(1-73)显示了缓慢的不可逆的自我聚合。这个假设也通过利用激光散射作为检测方法观察沉降平衡实验中的大分子而获得支持。此外，在一些游离NS1A(1-73)样品的凝胶过滤层析中，在NS1A(1-73)二聚体洗脱之前观察到一个前导峰，显示有可能是聚合物的峰。然而，将纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物再次上样到凝胶过滤柱时，没有观察到过量的游离dsRNA。样品以μM范围的Kd值表现为紧密复合物，和沉降平衡实验中估计的是一致的。形成的复合物本身，在某种程度上，提供了从样品中存在的“非活性物质”分离活性的NS1A(1-73)二聚体-活性dsRNA复合物的纯化机制。因此，不管污染物、聚集物和/或不合格的样品的性质，这些因素都不影响基于利用纯化的NS1A(1-73)-dsRNA复合物的沉降平衡实验对化学计量和解离常数的估计。此外，凝胶纯化的复合物表现为紧密的，均一的复合物的实证显示这些复合物应符合X-射线结晶学或核磁共振的结构分析。
实施例19NS1A(1-73)DSRNA亲和性和化学计量的交替估计比较前面的利用凝胶移位测量的NS1A(1-73)dsRNA亲和性的估计已报告了表观解离常数(KD)值的范围为20-200nM(Qian et al.，1995；Wang et al.，1999)。这些研究都是用小量的比上述生物物理测量中更长的具有不同的序列的dsRNA底物进行的。在早期的工作中，观察到NS1A(1-73)dsRNA结合(根据凝胶移位值)的化学计量依赖于dsRNA底物的长度，并且结合是半合作的(Wang et al.，1999)。已报道了类似的全长的NS 1A的半合作结合结果(Lu et al.，(1995)Virology214，222-228)。本申请中描述的NS1A(1-73)和16-bp dsRNA双链分子间的复合物是当多个NS1A的RNA-结合域沿着较长的dsRNA结合时发生的完全的相互作用的部分的模型，认为和体内发生的一样。申请人在本发明中观察到的1∶1化学计量排除了可能的蛋白-蛋白间的相互作用和其它的在一个更大的体系的多重结合的模式中可能出现的合作影响。在NS1A蛋白结合到更大的dsRNAs时，有许多可能的非特异结合位点的情况下，通过位形熵效应而调整表观亲和性(Wang et al.，(1999)RNA5，195-205)。例如，Wang et al.(1999)已报道NS1A(1-73)对140-bp的dsRNA底物的亲和性要比类似的55-bp的dsRNA底物的亲和性高10倍。因为这几个原因，本申请中报道的简单的1∶1的NS1A(1-73)二聚体和16-bp dsRNA片段的亲和常数比之前报道的更大的合作体系的表观亲和性要低。然而，本工作中描述的复合物模型仅捕获了完整的多个结合合作体系的全部结构信息的一部分，本工作中描述的复合物被很好的表征，易于生产，更适合下面NS1A-RNA分子识别过程的蛋白质-dsRNA相互作用的详细的结构研究。
实施例20NS1A(1-73)中的RNA结合位点最近在NS1A中进行的丙氨酸扫描突变研究(Wang et al.，1999)揭示对较大的dsRNA片段和U6snRNA的结合已确定i)为了结合靶标，蛋白必需是二聚体，和ii)仅R38是结合RNA所绝对必需的，即使K41也起一个显著的作用。通过上述15N-1H HSQC共振的化学位移扰动确定的NS1A(1-73)的RNA结合抗原决定簇支持和扩充了这些突变数据。在螺旋2和2’中的所有骨架酰胺基共振的化学位移一旦与dsRNA结合就会发生改变。这和螺旋2和2’中残基的一个或更多的暴露于溶剂的碱性侧链，包括Arg38和Lys41(图6B)参与dsRNA的直接接触的模型是一致的。也可能暴露于溶剂的碱性侧链Arg37和Arg44，还有部分包埋的Arg35和Arg46侧链(参与分子内和分子间盐桥(Chien et al.，(1997)，NatureStruct.Biol.4891-895；Liu et al.，(1997)NatureStruct.Biol.4896-89917)也直接和dsRNA相互作用。此外，化学位移扰动数据排除了假设的在螺旋3和3’上的潜在的RNA结合位点的参与(Chien et al.，(1997))，由于第三个螺旋上残基的大部分骨架1HN、15N原子在复合物形成时没有显示任何的化学位移，显示结合抗原决定簇远离螺旋3和3’，并且NS1A(1-73)的所有骨架构造都不受RNA结合的影响。蛋白核心区的螺旋1和1’上的一些残基的化学位移的差别归因于RNA相互作用诱导的自身环境的变化。总的说来，这些核磁共振数据显示NS1A(1-73)的六螺旋链的折叠构象与dsRNA结合时是完整的。这个结论和从CD研究中得到的复合物形成时NS1A(1-73)和dsRNA均未显示出大量的骨架结构改变的结论有很好的一致性。
实施例21NS1A(1-73)-DSRNA复合物的三维模型在此展示的NS1A(1-73)-dsRNA复合物的所有数据的分析揭示了编码非特定dsRNA结合功能的新的结构特征。NS1A(1-73)的结合位点由反向平行的富含精氨酸表面的螺旋2和2’组成。假设的模型与我们累积的NS1A(1-73)对dsRNA的结合特性的知识是一致的，蛋白的对称型的结构的结合表面横越规范的A-型RNA的小沟(图8)。在这个假设的模型中，反向平行的螺旋2和2’的向外的精氨酸和赖氨酸的侧链和反向平行的形成大沟边缘的磷酸酯骨架以一种对称的模式相互作用，同时螺旋2和2’间的表面离子对与小沟中的碱基形成氢键。NS1A(1-73)螺旋2和2’轴之间的显著相似的空间(约16.5)和越过小沟的磷酸酯间的距离(约16.8)给NS1A(1-73)‘坐在’A-型RNA的小沟上的模型增加了凭证，需要A-型以进行正确的停靠。此外，这些蛋白-RNA的相互作用很少或不需要特定的序列，这一点也和NS1A和dsRNA的相互作用缺乏特征性的特定序列是一致的(Hatada和Fukuda(1992)J.Gen.Virol.73，3325-3329；Lu et al.，(1995)Virology 214，222-228；Qian et al.，(1995)RNA 1，948-956)。
实施例22与其它蛋白DSRNA复合物的比较当将其放入已知的RNA-蛋白相互作用的背景中，本申请主张的假定的NS1A(1-73)dsRNA模型构成了一个新的蛋白-dsRNA复合物形成的模型。精氨酸富集的α-螺旋肽，例如来自于HIV-1 Rev蛋白已知通过特定的大沟间的相互作用而结合到ds RNA(Battiste et al.，(1996)，Science2731547-1551.)。然而，规范的A-型双链中的大沟太窄太深甚至不能容纳一个单α-螺旋。结果，Rev-蛋白-RNA复合物结合精氨酸富集的螺旋造成严重的核酸Id结构的扭曲。因此，NS1A(1-73)螺旋2/2’和它的靶dsRNA的大沟间的类似的相互作用可以排除，原因为复合物形成时蛋白和核酸保留它们的游离态的构象。大多数结合dsRNA的蛋白典型地含有超过一个拷贝的普遍存在的ca.70氨基酸，α1-β1-β2-β3-α2模块，被称为dsRNA结合域(dsRBD)(Fierro-Monti&Matthews，2000)。来自于非洲爪蟾RNA-结合蛋白A的dsRBD和dsRNA的复合物的X-射线晶体结构，揭示两个链间的两个α-螺旋加上一个环形成集体的跨越一个16bpwindow-两个小沟和介于其间的大沟-双链的一个面的相互作用(Ryter&Schultz，1998)。事实上所有这些蛋白-RNA间的接触都包括小沟中的2’羟基部分和磷酸二酯骨架中的非桥氧。最近也报道了果蝇staufen蛋白的dsRBD和dsRNA间的复合物的核磁共振结构中的一个类似的观点(Ramos et al.，2000)。对于NS1A(1-73)，在两个体系中蛋白dsRNA间的相互作用大部分是非序列特异的，造成相对小的双链和游离的蛋白结构的扰动(Kharrat et al.，1995；Bycroft et al.，1995；Nanduri et al.，1998)。然而，和本模型不同的是，dsRDB的非螺旋区和核苷酸形成了关键的接触。除了包括对核苷酸识别至关重要的，在NS1A(1-73)中没有出现并且形成复合物后似乎也不形成的非螺旋构象以外，这些dsRBM模块缺少NS1A(1-73)的很有可能在分子识别过程中使用的对称特征。
工业适用性本发明已申请在控制流感病毒生长、流感病毒化学和抗病毒治疗方面的应用。
虽然在本文中通过参考特定的例子来描述本发明，要理解这些例子只是对本发明的原理和应用的说明。因此，要理解可以进行许多修改来说明情况，并且可以设计其它的安排而不离开通过附加的权利要求所限定本发明的精神和范围。
说明书中引用的所有出版物都表明了本发明所属的技术领域的技术人员的技术水平。所有这些出版物被本文应用作为参考，其程度就如同每一个单独出版物被特定的单独的指明被引用作为参考。
表1流感A病毒NS1蛋白序列 NS1A-I1
NS1A-I2
NS1A-I3
NS1A-I4
NS1A-I5
NS1A-II1
NS1A-II2
NS1A-II3
NS1A-II4
NS1A-II5
表2流感B病毒NS2蛋白序列 NS1B I-all
NS1B II-1
NS1B II-权利要求
1.一种包含反应混合物的组合物，该混合物含有流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合片段以及结合所述蛋白的dsRNA的复合物。
2.权利要求1所述的组合物，其中NS1蛋白是流感A的NS1蛋白(NS1A)。
3.权利要求2所述的组合物，其含有所述NS1A蛋白的dsRNA结合域。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述dsRNA结合片段包括NS1A的1-73氨基酸残基。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述NS1蛋白是流感B的NS1蛋白(NS1B)。
6.权利要求5所述的组合物，其包含所述NS1B蛋白的dsRNA结合域。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述dsRNA结合片段包括NS1B的1-93氨基酸残基。
8.权利要求1所述的组合物，其中所述dsRNA的长度为约16个碱基对。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述dsRNA结合部分包含NS1A的1-73氨基酸残基，并且其中所述dsRNA的长度为约16个碱基对。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述dsRNA结合部分包含NS1B的1-93氨基酸残基，并且其中所述dsRNA的长度为约16个碱基对。
11.权利要求1所述的组合物，其进一步包含一种被检测抗流感病毒抑制活性的化合物。
12.权利要求1所述的组合物，其中NS1蛋白或dsRNA被可检测地标记。
13.一种鉴定具有抗流感病毒抑制活性的化合物的方法，其包括a)制备包含流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合域，种结合所述蛋白的dsRNA或其结合域，以及候选化合物的反应体系；和b)检测NS1蛋白和dsRNA间的结合程度，其中在化合物存在时，相对于对照，NS1蛋白和dsRNA间的结合降低表明化合物对流感病毒有抑制活性。
14.权利要求13所述的方法，其中NS1蛋白或其dsRNA结合域被固定在固相支持物上。
15.权利要求13所述的方法，其中候选化合物先于或与NS1蛋白和dsRNA同时加入到反应体系中。
16.权利要求13所述的方法，其中候选化合物在加入NS1蛋白和dsRNA之后加入到反应体系中。
17.权利要求13所述的方法，其进一步包括在所述检测之前，用可检测的标记物标记dsRNA、NS1蛋白或其dsRNA结合域。
18.权利要求17所述的方法，其中可检测的标记包括与NS1蛋白或其dsRNA结合域结合的抗体或其片段。
19.权利要求17所述的方法，其中可检测的标记包括一种酶，并且反应体系中进一步包含该酶的底物。
20.权利要求17所述的方法，其中可检测的标记包括放射性同位素。
21.权利要求17所述的方法，其中可检测的标记包括荧光标记。
22.权利要求13所述的方法，其中所述检测是通过荧光共振能量转移进行的。
23.权利要求13所述的方法，其中所述检测是通过荧光偏振各向异性测量进行的。
24.权利要求13所述的方法，其中NS1蛋白或其dsRNA结合片段在反应体系中是以与谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的形式存在的。
25.权利要求13所述的方法，其中所述NS1蛋白是NS1A蛋白。
26.权利要求13所述的方法，其中所述NS1蛋白是NS1B蛋白。
27.权利要求13所述的方法，其中反应体系包括NS1蛋白的片段，该片段包含所述NS1蛋白的dsRNA结合域。
28.权利要求27所述的方法，其中dsRNA结合域包含NS1A(1-73).
29.权利要求27所述的方法，其中dsRNA结合域包含NS1B(1-93).
30.权利要求13所述的方法，其中dsRNA的长度为约16个碱基对。
31.权利要求13所述的方法，其中鉴定方法包括高通量筛选方法。
32.一种鉴定对流感病毒具有抑制活性的化合物的方法，其包含a)制备包含流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合域、结合所述蛋白的dsRNA或其结合域以及候选化合物的反应体系；和b)检测NS1蛋白和dsRNA间的结合程度，其中在化合物存在时，相对于对照，NS1蛋白和dsRNA间的结合降低表明化合物对流感病毒有抑制活性；和c)确定b)中鉴定的具有抑制活性的化合物在体外抑制流感病毒生长的程度。
33.权利要求32所述的方法，其中鉴定具有抑制活性的化合物的方法选自a)核磁共振化学位移扰动，b)凝胶过滤层析，或(c)利用分析型的超速离心机的沉降平衡测量。
34.权利要求32所述的方法，进一步包括d)确定c)中鉴定的在体外抑制流感病毒生长的化合物在非人类的动物中抑制流感病毒复制的程度。
35.一种制备用于体内或体外抑制流感病毒复制的组合物的方法，其包含a)制备包含流感病毒NS1蛋白或其dsRNA结合域、结合所述蛋白的dsRNA或其结合域，以及候选化合物的反应体系；b)检测NS1蛋白和dsRNA间的结合程度，其中在化合物存在时，相对于对照，NS1蛋白和dsRNA间的结合降低表明化合物对流感病毒有抑制活性；c)确定b)中鉴定具有抑制活性的化合物体外抑制流感病毒生长的程度；d)确定c)中鉴定的在体外抑制流感病毒生长的化合物在非人类的动物中抑制流感病毒复制的程度；和e)通过将d)中鉴定的在非人类的动物中抑制流感病毒复制的化合物以有效抑制剂量和载体配制以制备组合物。
36.权利要求35所述的方法，其进一步包含f)根据c)和d)中获得的结果确定化合物的有效抑制剂量。
37.权利要求35所述的方法，其中载体适合通过吸入或吹入法给动物施用。
38.一种鉴定用作流感病毒的抑制剂的化合物的方法，其包含a)获得流感病毒NS1蛋白三维结构的同等物；b)根据用步骤a)中获得的所述三维结构的同等物进行合理的药物设计选择潜在的化合物，其中所述的选择是与NS1-dsRNA复合物的计算机模拟联合进行的；c)将潜在的化合物与流感病毒接触；和d)测定流感病毒的活性，其中当化合物存在时，流感病毒活性比没有化合物时降低，就鉴定潜在的化合物是抑制流感病毒的化合物。
39.权利要求38所述的方法，其中NS1蛋白是NS1A蛋白或其dsRNA结合域。
40.权利要求39所述的方法，其中dsRNA结合域是NS1A(1-73)。
41.权利要求38所述的方法，其中NS1蛋白是NS1B蛋白或其dsRNA结合域。
42.权利要求41所述的方法，其中dsRNA结合域是NS1B(1-93)。
全文摘要
本发明公开了用于鉴定流感病毒如流感A和B病毒的抑制剂的方法和组合物。还公开了用于制备组合物的方法，所述组合物施用于流感病毒感染的动物，包括人，或者保护动物，包括人抗流感病毒感染。
文档编号C07K14/00GK1738831SQ200380108643
公开日2006年2月22日 申请日期2003年11月13日 优先权日2002年11月13日
发明者G·T·蒙特利奥内, R·M·克鲁格 申请人:拉特格斯州立大学