专利名称：用于治疗流感的重组人cc10蛋白的制作方法
技术领域：
本发明的实施方式涉及降低体内病毒滴度和治疗患者的病毒性呼吸道感染的方法。本发明的实施方式还涉及治疗包括A型流感病毒在内的流感病毒感染的方法，特别是HlNl流感病毒。此外，本发明的实施方式还涉及利用重组人CClO的鼻内给药和/或静脉内给药、和/或吸入来治疗上述的方法。
背景技术：
克拉拉细胞(clara cell) “lOkDa”蛋白(CClO)或子宫球蛋白(UG)是一种上皮起源的多种粘膜上皮和其他器官产生的小的同型二聚体分泌蛋白(Mukherjee，1999)。CClO由两种相同的70个氨基酸残基的亚单位构成，每个亚单位具有“四螺旋束”二级结构基序，通过Cys 3和69’、3’和69之间的两个二硫键在反平行取向上连接(Matthews，1994 ;Morize, 1997)。CClO是共有相同的二级、三级和四级结构并且认为是介导类似功能的小球蛋白的新兴家族的第一成员。含有两个二硫键的同型二聚体看起来是其初级形式。在人中，肺是CClO产生的主要部位，同时多种其他器官合成较少量的编码这种蛋白的mRNA(Singh，1987 ;Sandmoller，1994)。CClO是一种抗炎和免疫调节蛋白，其具有与其他蛋白、受体和细胞类型各种相互作用的特征(在Mukherjee, 1999and Pilon, 2000中进行了综述)。已在具有某些程度的包括肺炎在内的炎症的特征的大量临床条件的各种组织和流体样品中发现较低水平的CClO蛋白或mRNA (Nomori，1995)。CClO蛋白在不同类型的肺部感染中的生理学已在一株CClO敲除小鼠中进行了研究。在其中CCio敲除和野生型小鼠各自用绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)或腺病毒(两种常见的人呼吸道病原体)感染的两个研究中，野生型小鼠经历更快速的病原体清除，具有更大的通过天然免疫系统的病原体杀死，表明在病毒和细菌感染期间缺失CClO的益处(Hayashida，1999 ；Harrod, 1998)。这与其中将CClO报道为免疫抑制剂的早期观察结果一致(Dierynck，1995 ;1996)，表明CClO将抑制对感染的天然免疫应答，不管是细菌或病毒感染，包括流感。因此，不能预期在病毒或细菌呼吸道感染存在下给予CClO有益于患者。随后，报道了在用呼吸道融合病毒(RSV)感染之前，利用重组人CClO蛋白(rhCCIO)恢复CClO功能，与未处理的敲除小鼠相比，能够更快速清除所述感染(Wang，2003)。然而，近期的研究显示，当与树突状细胞暴露于抗原同时存在时，rhCCIO能够阻止获得性免疫(特别是抗原特异性T细胞)的发展(Johansson，2007)，这再次表明施用rhCCIO不会有益于患有感染的患者。因此，关于在呼吸道感染期间rhCCIO治疗的潜在危害或益处的知识的当前状态是矛盾的，并且关于CClO治疗不同类型呼吸道感染的安全和/或效用不能得出结论。不能获得关于CClO对于流感病毒感染的作用的信息。在本文中我们报道了，rhCCIO在体内对于A型流感的效カ的直接验证、细胞水平CClO的抗病毒作用的直接验证、其作用机制、以及其治疗和/或预防病毒感染(并且尤其是流感病毒感染)的潜在用途。在过去的120年中，流感引起了四次大爆发(1889，1918，1957和1968年)，导致世界范围大概5000-10，000万人死亡。流 感病毒是ー种正粘病毒，ー种通过气溶胶以及通过污染表面与鼻粘膜的直接接触传播并靶向呼吸道上皮细胞的RNA病毒。流感病毒感染可以引起严重症状，包括发烧、咽喉痛和肌肉痛、身体不适、体重減少、呼吸道阻塞、以及有时的呼吸衰竭和死亡。流感病毒激发获得性免疫应答(细胞毒性T细胞和抗体)，其在正常健康个体中通常在1-2周消除该感染。感染人类的多种流感病毒亚型，包括禽流感病毒(H5N1)、季节性流感病毒(H3N2)和猪流感病毒(HlNl)，可以用抗病毒剂如神经氨酸酶抑制剂来治疗。然而，流感病毒的快速突变已导致药物抗性株的形成(Moscona，2009)，用于预防和/或治疗的抗病毒剂的大量使用将导致对这些药物的抗性的加速形成。因此需要新的治疗剂以治疗、治愈和预防流感病毒感染。同样，没有用于呼吸道和其他身体系统中大量病毒感染的批准疗法。
发明内容
发明目的上述提供了通过本发明实施方式所实现的目的的非排他性列举本发明实施方式的目的是降低肺部病毒滴度并由此治疗、治愈或预防流感病毒感染，特别是A型流感病毒感染，并且更特别是流感病毒HlNl株感染。本发明实施方式进ー步的目的是降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染，其通过静脉内途径、吸入途径、或鼻内途径(根据PCT 2009)、或通过这些途径的组合施用CC10。本发明实施方式的另ー个目的是降低病毒滴度并治疗、治愈或预防病毒感染，其中通过静脉内途径、吸入途径、或鼻内途径、口腔途径、阴道内途径、或通过这些途径的组合施用CC10。本发明的又ー个目的是利用CClO或分泌球蛋白家族的其他成员在细胞水平抑制病毒复制。发明概要这些和其他目的、特性和优点通过本发明实施方式实现，其中通过在恰当间隔时间以给定剂量范围、或以某ー剂量施用rhCCIO以降低病毒滴度并治疗、治愈或预防病毒感染。这些和其他目的、特性和优点也通过本发明实施方式在恰当间隔时间以给定剂量范围或以某ー剂量施用CClO来实现，其中通过特定病毒的症状特征和/或通过检测患者样本中的病毒诊断患者患有病毒感染，所述检测是利用标准方法通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或病毒核酸检测。这些和其他目的、特性和优点也通过本发明实施方式在恰当间隔时间以给定剂量范围或某一剂量施用CClO来实现，其中通过发烧、肌痛和堵塞症状，和/或通过检测患者样本(鼻灌洗液、血液或唾液样本)中的流感病毒诊断患者患有流感病毒感染，所述检测是利用标准方法通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或检测病毒核酸。
在本发明的某些方面，以I. 5微克至I. 5毫克/千克体重/天范围每个鼻孔等分的剂量、或采用合在一起达到该每天剂量范围的多个剂量通过鼻内施用CC10，以降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染。在另一方面，以高达10毫克/千克体重/天的剂量、或以合在一起达到该每天剂量范围的多个剂量通过静脉内施用CC10，以治疗、治愈或预防流感病毒感染。在另一方面，在恰当间隔时间以给定剂量范围或以某一剂量施用非人CClO蛋白，其中通过特定病毒的症状特征，和/或通过检测患者样本中的病毒诊断患者患有病毒感染，所述检测是利用标准方法，通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或检测病毒核酸。在又一方面，在恰当间隔时间以给定剂量范围或以某一剂量施用统称为分泌型球蛋白的CClO蛋白家族的另一个成员，其中通过特定病毒的症状特征，和/或通过检测患者样本中的病毒诊断患者患有病毒感染，所述检测是利用标准方法，通过病毒培养、病毒免疫学检测、和/或检测病毒核酸。
图I是柱形图，示出了在用鼻内rhCCIO治疗的感染棉鼠的肺中2天的HlNl病毒负荷。病毒滴度表示为(X 107)TCID50/克组织。图2是柱形图，示出了在用腹膜内注射rhCCIO治疗的棉鼠的肺中2天的HlNl病毒负荷。病毒滴度表示为(X 107)TCID50/克组织。图3是柱形图，示出了通过rhCCIO对培养细胞中的病毒复制的抑制作用。以100微克/ml、300微克/ml和I毫克/ml将RhCClO加入到HEp2细胞的培养基中并留置4小时。然后移除该培养基并替换，并且细胞用RSV感染I小时。然后清洗细胞以除去过量病毒并回加rhCCIO并再孵育一小时。然后清洗细胞以除去过量CC10。在注射后4天检测培养基中的病毒滴度。每个CClO浓度重复三次。图4是比较注射前和注射后给予时rhCCIO的抗病毒效果的柱形图。HEp2细胞用lmg/ml rhCCIO处理并如图3所示的用RSV感染。另外，在感染后I小时(治疗D0)、感染后24小时(治疗Dl)以及感染后48小时(治疗D2)提供lmg/ml的rhCCIO。培养基中的病毒滴度在感染后第4天进行检测。
具体实施例方式本发明的实施方式涉及利用CClO来降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染。CClO优选是通过分别在本文A和B展示部分所附的美国专利申请公开No.20030207795和PCT/US09/43613(以引用的方式将其全部公开内容并入本文中。)中所描述的方法、或经由产生药品级rhCCIO的任何其他方法所获得的重组人CClO (rhCCIO)。本发明实施方式的rhCCIO可以在有或没有其他鼻内、肺部或全身治疗的情况下、在它们之前或之后施用。剂量优选地，在治疗或预防流感病毒感染中，rhCCIO以每天每个鼻孔1_3次鼻内施用，达7-14天，并且每隔一天之后进行另外的14天，以及之后根据需要进行。更优选地，在患者一开始经历发烧、肌痛和阻塞或者被诊断患有流感时就施用rhCCIO。
为了实现以下进ー步描述的期望成果，參考以下实施方式中描述的给药方法在一个实施方式中，鼻内rhCCIO施用的一个或多个剂量可以等同于约I. 5微克至约5毫克/千克体重/天的剂量范围。在另ー个实施方式中，rhCCIO可以每天以该剂量范围施用。在又一个实施方式中，rhCCIO可以姆天以该剂量范围连续施用至少7天。在又一个实施方式中，rhCCIO可以姆天以该剂量范围连续施用至少14天。在又一个实施方式中，rhCCIO可以每隔一天以该剂量范围连续施用30天。在又一个实施方式中，rhCCIO可以以逐日递减剂量连续施用10天，所述递减剂量包括在第一个三天毎次施用高剂量、在第二个三天毎次施用中间剂量，以及在后四天毎次施用低剂量。在又一个实施方式中，rhCCIO可以以该剂量范围或以递减剂量施用每天三次，大约每8小时一次。在另ー个实施方式中，rhCCIO的上述剂量可以作为气溶胶通过鼻内喷雾或灌洗、或通过凝胶或霜剂的沉积、或在鼻道中滴注的其他方法，鼻内施用于患者。在另ー个实施方式中，rhCCIO的上述剂量可以作为气溶胶通过雾化器或计量剂量 吸入器、或直接用于肺和气管的其他方法，通过吸入而给予患者。在另ー个实施方式中，在治疗或预防流感病毒感染中，rhCCIO以15微克至20毫克/千克体重的剂量，每天1-3次，静脉内施用7-14天，并且之后每隔一天进行另外的14天，以及之后根据需要进行。在又一个实施方式中，rhCCIO可以以每日递减剂量连续施用10天，所述递减剂量包括在第一个三天毎次施用高剂量、在第二个三天毎次施用中间剂量、以及后四天毎次施用低剂量。在又一个实施方式中，rhCCIO可以以该剂量范围或以递减剂量每天施用三次，大约每8小时一次。在另ー个实施方式中，rhCCIO的上述剂量可以利用鼻内、吸入、以及静脉内途径的组合施用于患者。在进ー步的实施方式中，依照上述方法，rhCCIO可以在抗病毒疗法、抗生素疗法、解充血剂、抗组织胺药、粘液溶解药、祛痰药、粘液抑制剂、表面活性剤、支气管扩张药、血管收缩药、窦痛止痛药、或其他典型疗法之前、期间或之后给予。在又一个实施方式中，依照上述方法，可以施用rhCCIO以降低肺部病毒滴度并治疗、治愈或预防流感病毒感染。上述rhCCIO的剂量和应用方法可以每天、每天一次以上、每天三次、每隔一天或以递减模式进行施用，这取决于治疗的流感病毒感染的严重程度、患者总体健康状况、以及是否存在潜在病症。例如，感染越严重，有效治疗所需的rhCCIO的剂量将越高。应理解，基于患者的症状和对疗法的反应并且在本发明实施方式中描述的參数和剂量范围内，医生将能够根据需要监控和调整剂量、制剂、以及施加方法。制剂rhCCIO鼻内给药的鼻内制剂、装置和方法已在PCT/US09/43613中有描述，以引用的方式将其全部公开内容并入本文中并且在展示部分B中重现。rhCCIO的静脉内制剂由在0. 9%盐水中的5. 5mg/ml溶液构成并且已描述在美国专利申请公开No. 20030207795中，以引用的方式将其全部公开内容并入本文中并且在展示部分A中重现。实施例I流感病毒的增殖和滴度确定制备A/PR/8/34A型流感病毒株(HlNl)，购自美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。以0.01的感染复数(MOI)采用流感病毒感染60%铺满的单层细胞(150cm2培养瓶)，使流感病毒在MDCK细胞(ATCC登记#CCL_34)中增殖。三至四天后，当细胞病变效应泛发并且大多数细胞脱离培养皿时，收获细胞和上清。通过离心除去细胞(800g)并在4°C下对上清过滤(O. 45μπι)和离心(18000g) 2小时以粒化病毒。将该病毒粒重悬于DMEM培养基，等分并在-150°C下储存。通过向在O. 1%牛血清白蛋白和胰蛋白酶存在下在96孔板中所培养的MDCK单层细胞施加O. ImL系列稀释的病毒原液，来确定流感病毒滴度。三天后，对细胞病变效应进行计分并利用Kaerber方法来确定半数组织培养物感染量(TCID5tl)。
用于病毒负荷分析的肺组织的处理。无菌地取出来自被感染小鼠和棉鼠的肺的左右叶片的切片，称重并在设置5下利用组织剪切设备(型号#985-370，Biopspec ProductsInc.)在Iml的DMEM培养基中均化45秒钟。匀浆物以3000g离心20分钟。收集清澈上清，并在_150°C下冷冻储存直至使用。病毒滴度的确定。通过系列稀释，接着空斑形成试验(PFA)或病灶形成试验(FFA)，来确定扩增的病毒原液中和肺匀浆物中的病毒滴度。每毫升初始样品的空斑形成单位(PFU)和病灶形成单位(FFU)在研究开始之前进行计算。储存足以实施PFA和FFA的一组流感病毒样品并且在完成研究之后确定PFU和FFU。采用特定培养基(具有I % BSA的DMEM)制备所培养病毒的系列稀释液，其稀释范围横跨IO1至108。每个稀释液通过空斑形成试验(PFA)和病灶形成试验(FFA)进行评价。对于流感病毒培养物滴度通常产生107-109pfu/ml。实施例2rhCCIO鼻内施用以降低肺部流感病毒滴度棉鼠(粗毛棉田鼠(S.hispidus))，一种田鼠，是流感病毒复制并产生中度呼吸道感染的动物模型(0ttolini，2005)。这些动物通过用流感病毒鼻内接种进行感染并且肺部病毒滴度在接种后两天(约48小时)出现峰值。这种模型被用来筛选体内抑制流感病毒复制的化合物。无病原体棉鼠购自Virion Systems, Inc. (Rockville,MD)。共18只棉鼠(粗毛棉田鼠，6-8周龄)，通过每只鼠鼻内接种O. Iml体积的IO7TCID5tl的A型流感病毒(A/PR/8/34)株HlNl进行感染。六只动物接受安慰剂(O. 9% NaCl)，六只动物接受O. 5mg/kg的rhCCIO以及六只动物接受5. Omg/kg的rhCC10(在病毒接种前2小时通过鼻内滴注)。在感染后第2天病毒滴度通常最高时处死动物并且在肺组织中确定病毒负荷时。图I示出了在两个rhCCIO剂量组中观察到肺组织中病毒滴度的降低。肺中的病毒滴度表示为(XlO7)TCID5ci/克组织。实施例3rhCCIO全身施用以降低肺部流感病毒滴度共18只棉鼠(粗毛棉田鼠，6-8周龄)，通过每只鼠鼻内接种0. Iml体积的IO7TCID5tl的A型流感病毒(A/PR/8/34)株HlNl进行感染。六只动物接受盐水安慰剂(0. 9%NaCl)，六只动物接受0. 5mg/kg的rhCCIO以及六只动物接受5. 0mg/kg的rhCCIO (通过腹膜内注射(IP))。IP途径产生大量的循环rhCCIO并刺激人静脉内给药途径。每只动物接受总共六个剂量的安慰剂或rhCC10(大约每12小时)，包括在感染前一天的两个剂量(早晨和下午)、感染当天的两个剂量、以及感染后一天的两个剂量(感染前三个剂量，感染后3个剂量)。在感染后第2天当病毒滴度通常为最高时处死动物并且在肺组织中确定病毒负荷。图2示出了在5mg/kg rhCCIO剂量组中观察到的肺组织中病毒滴度的统计学显著降低(P <0.01)，并且在O. 5mg/kg剂量组中趋势朝向较低病毒滴度。肺中的病毒滴度表示为(XlO7)TCID50/ 克组织。基于前述，已发现rhCCIO降低呼吸道感染中的病毒滴度，表明rhCCIO用来治疗、治愈和/或预防流感病毒感染的用途。因此，本发明的实施方式提供有效治疗、治愈或预防流感病毒感染的鼻内、和静脉内、或其组合的基于rhCCIO的疗法。实施例4细胞水平CClO介导的病毒复制的抑制作用利用HEp2细胞(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)来增殖RSV株A_2 (AdvancedBiotechnologies, Inc.，Columbia, MD)并产生病毒原液。在48孔板中以50, 000个细胞/孔将细胞进行铺板并在具有10% FB S的MEM中生长至 80%铺满。细胞用在0. 5mL MEM 中的CClO预处理4小吋。然后更换培养基并利用Ix 106TCID50/100mm TC皿进行RSV感染I小吋。通过清洗除去未吸附的病毒，并加入0.5ml具有2% FBS的MEM、4mM L-谷氨酰胺以及rhCCIO。在感染后第4天收集上清并滴定病毒。图3示出了 lmg/ml CClO的浓度可视地消除RSV生产，而100和300微克/ml显示约3倍降低。当在感染后1、24和48小时提供吋，CClO还抑制细胞中的病毒复制。图4显示了不仅在感染之前加入，而且在感染后加入吋，rhCCIO都有效降低病毒滴度。这是在细胞水平下CClO的直接抗病毒活性的第一次报道并且说明了 rhCCIO作为暴露后治疗的抗病毒疗法的潜在应用。实施例5CClO抗病毒的作用机制在CClO敲除小鼠中气管上皮细胞的表型说明，在没有CClO下，细胞内细胞器分布异常，存在异常堆叠的膜结构，以及通过细胞进行的其他蛋白的分泌被破坏。我们假定，这种表型意味着，CClO在从高尔基体(Golgi apparatus)至细胞的质膜的分泌小泡运输中起着积极的作用。CClO还调节抗原递呈细胞中抗原的摄取和处理。我们解释这些观察结果意味着，CClO是在进出许多细胞类型的物质运输中的ー个重要因子。因此我们推断，CClO通过干扰细胞中的病毒运输而抑制病毒复制。由于所有病毒均依赖于细胞运输过程以侵入细胞并复制，所以能够预期CClO抑制所有病毒的复制。同样，也能够预期其他分泌型球蛋白(它们与CClO共有类似的结构)在细胞水平抑制病毒复制。类似地，也能够预期源于CClO的多肽以及调节细胞运输过程的其他分泌型球蛋白能够抑制病毒复制。展示部分A (EXHIBIT A)US 20030207795
权利要求
1.一种降低患者肺组织中流感病毒滴度的方法，包括将人CCio或rhCCIO施用给所述患者。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述rhCCIO治疗、治愈或预防患者流感病毒感染。
3.根据权利要求I所述的方法，其中，所述流感病毒是A型流感病毒。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，所述流感病毒是流感病毒HlNl株。
5.根据权利要求I所述的方法，其中，所述人CClO或rhCCIO通过鼻内给药。
6.根据权利要求I所述的方法，其中，所述人CClO或rhCCIO通过鼻内给药。
7.根据权利要求I所述的方法，其中，所述人CClO或rhCCIO通过鼻内和静脉内组合给药。
8.降低患者组织中病毒滴度的方法，包括将人CClO或rhCCIO施用给所述患者。
9.降低患者组织中病毒滴度的方法，包括将重组分泌型球蛋白施用给所述患者。
10.在细胞水平抑制病毒复制的方法，包括将人CClO或rhCCIO施用给受感染患者。
11.在细胞水平抑制病毒复制的方法，包括将CClO或重组CClO施用给受感染动物。
12.在细胞水平抑制病毒复制的方法，包括将CClO或重组CClO施用给受感染的细胞。
全文摘要
本发明提供了利用重组人CC10(rhCC10)(也称为重组人子宫球蛋白)来降低患者组织中病毒滴度，特别是肺组织中流感病毒滴度的方法。RhCC10可以用作治疗、治愈或预防病毒感染，特别是流感病毒感染的治疗剂。更具体地，本发明提供了宽泛地包括可以施用以治疗、治愈或预防流感病毒感染的rhCC10的临界剂量范围、静脉内和鼻内给药在内的方法。本发明还提供了在前述方法和将rhCC10施用于人中有用的组合物。
文档编号A61K45/00GK102834115SQ201080046571
公开日2012年12月19日 申请日期2010年10月13日 优先权日2009年10月15日
发明者爱普瑞·L·皮隆, 皮埃尔·波吉特, 路易斯·费拉蒙 申请人:克拉莱森公司