含有天然提取物的组合物的制作方法

专利名称：含有天然提取物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，该组合物含有作为活性成分的、选自黄芪、三白草、甘草、 蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物。
背景技术：
痤疮通常是由雄性激素生成的增加使皮脂生成增加而引起的。具体地，雄性激素产生的皮脂和毛囊的角化过度会导致毛囊变窄或严重时会阻塞毛囊。当毛囊变窄或阻塞时，毛囊不能分泌皮脂，产生微粉刺。在这种条件下，毛囊中生长的厌氧细菌痤疮丙酸杆菌可能引起炎症。炎症的结果会导致红斑、瘙痒和肿胀，严重时会发生色素沉着过度。如果用力挤压或按压痤疮，炎症可能会恶化成粉刺破裂。同时，痤疮疤痕很可能发展成为组织损伤。各种原因都可以导致炎症性痤疮。例如，当化妆品的各种添加剂残留在皮肤上时， 可以引起炎症性痤疮。同时，身体分泌的皮脂、汗液和紫外线等也可以引起皮肤炎症。目前，研究人员的研究仅集中在炎症性痤疮引起的炎症的治疗方面。然而，即使炎症得到治疗，红斑或疤痕仍会存在并在外观上起到消极作用。因此，本发明的发明人进行了抑制和防止炎症性痤疮引起的色素沉着和疤痕的研究。

发明内容
[技术问题]
本发明旨在提供一种用于抑制痤疮导致的色素沉着的组合物。本发明还旨在提供一种用于抑制痤疮疤痕的组合物。本发明还旨在提供一种用于痤疮后效的调养组合物。[技术方案]
一方面，本发明提供含有作为活性成分的、选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物的组合物。[有益效果]
本发明组合物对抑制痤疮导致的色素沉着和/或疤痕有效。


图1-4展示了黄芪提取物对GM_CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，图1)、IL_1 α (白细胞介素Ια，图2)、IL_8 (白细胞介素8图3)和TNF-α (肿瘤坏死因子-α，图4) 的炎症细胞因子的抑制效果；
图5-8展示了三白草提取物对GM-CSF (图5)、IL-I α (图6)、IL_8 (图7)和TNF-a (图8)的炎症细胞因子的抑制效果；
图9-12展示了甘草提取物对GM-CSF (图9)、IL-I α (图10)、IL_8 (图11)和TNF-a (图12)的炎症细胞因子的抑制效果；图 13-16 展示了蔷薇提取物对 GM-CSF(图 13)、IL_1 α (图 14)、IL_8(图 15)和 TNF-a (图16)的炎症细胞因子的抑制效果；
图 17-20 展示了大黄提取物对 GM-CSF(图 17)、IL_1 α (图 18)、IL_8(图 19)和 TNF-a (图20)的炎症细胞因子的抑制效果；
图21- 展示了刺五加提取物对GM-CSF (，图21)、IL-I α (图22)、IL_8 (图23)和 TNF-a (图Μ)的炎症细胞因子的抑制效果；
图25- 是黄柏提取物对GM-CSF (图25)、IL-I α (图洸)、IL-8 (图27)和TNF-a (图观)的炎症细胞因子的抑制效果；
图四展示了黄芪提取物对皮脂生成的抑制效果； 图30展示了三白草提取物对皮脂生成的抑制效果； 图31展示了甘草提取物对皮脂生成的抑制效果； 图32展示了蔷薇提取物对皮脂生成的抑制效果； 图33展示了大黄提取物对皮脂生成的抑制效果； 图34展示了刺五加提取物对皮脂生成的抑制效果； 图35展示了黄柏提取物对皮脂生成的抑制效果； 图36展示了黄芪提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图37展示了三白草提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图38展示了甘草提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图39展示了蔷薇提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图40展示了大黄提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图41展示了刺五加提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图42展示了黄柏提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果； 图43-45展示了黄芪提取物对痤疮疤痕的抑制效果； 图46-48展示了三白草提取物对痤疮疤痕的抑制效果； 图49-51展示了甘草提取物对痤疮疤痕的抑制效果。
具体实施例方式本发明的组合物包含作为活性成分的、选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物。含有选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物的组合物具有抑制和阻止痤疮导致的色素沉着和/或痤疮疤痕的效果。在一个典型实施例中，本发明的组合物是用于抑制痤疮导致的色素沉着的组合物，其包含作为活性成分的、选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物。在另一个典型实施例中，本发明组合物是用于抑制痤疮疤痕的组合物，其包含作为活性成分的、选自黄芪、三白草和甘草中的一种或多种提取物。黄芪是一种属于壳斗目、蝶形花科的双子叶多年生的草。它生长于大山的岩石中， 约40-70厘米高，分布在韩国、日本、中国东北部和西伯利亚东部等地。在东方医学中，这种植物是在秋季收获的，去掉头和根须在太阳下晒干后即可使用。三白草是一种属于胡椒目、三白草科的双子叶多年生的草。白色根茎横向生长在泥中。三白草有50-100厘米高，6-8月间开花。这种植物主要生长在潮湿的土壤中，因其根、叶和花均为白色而得中文名“三白草”。已知它可有效防止脚气、黄疸病和肝炎等，分布在韩国、日本和中国。甘草 rah/^is)是一种属于蝶形花科的双子叶草本植物，广泛用作药用植物。除了韩国，它还分布在中国东北部、西伯利亚和蒙古。其有角的茎直，高约1 米。叶子是互生且成奇数羽状复叶。7-8月间开紫花，长1.4-2. 5厘米。红棕色根深深扎进土壤中，根味甜，用作甜味剂或药用植物。蔷薇(蔷薇属)统指蔷薇目、蔷薇科的野生和培育的双子叶植物。蔷薇是一种开花灌木，因它的美丽香气而被培育。各种品种从北极到亚北极、北半球的温带和亚热带被广泛培育。大黄(波叶大黄)指石竹目、蓼科的多年生的草。大黄主要生长在山谷潮湿的土壤中，原产于中国。大黄有厚厚的黄根，直的柄高度达1米。它的主根主要用作药品。将主根切开并干燥用于药用，或者去除树皮和细根后用于药用，或者直接用于药用。它可被用作消炎泻剂和许多其它用途。刺五加是一种五加科的落叶灌木，高约2-3米。刺五加具有长的、细的刺和掌形的互生复叶。在刺五加的通用名称中，前缀荆指‘有刺的’和五加指‘万灵草药’。也就是说， 通用名称指‘万灵草药有刺植物’。很早以前，这种植物已被广泛用作治疗神经痛、关节炎、 高血压、神经衰弱和糖尿病，并作为一种补品。黄柏指入药的黄柏树皮。黄柏是一种芸香科的落叶阔叶树，高约10米。树皮中富含软木，树皮内层是黄色的。夏至前后剥下的树皮，切碎并在阳光下干燥后即可得到黄柏。 已知黄柏可降低血糖，抑制肺炎球菌、结核杆菌和金黄色葡萄糖球菌等的生长，抑制肿瘤细胞的增殖，并具有杀菌作用。已知黄柏可通过腭反射促进胃液分泌从而增进食欲。可根据常用的方法获得提取物，没有特别地限制。在一个典型实施例中，可用蒸馏水或C1-C5的无水或含水低级醇等有机溶剂提取选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种的提取物。在另一个典型.实施例中，可用热水提取得到提取物。 可通过设定真空和高压条件改善热水提取的提取效率。在另一个典型实施例中，选自黄芪、三白草和甘草中的一种或多种的提取物具有抑制明胶酶的作用。明胶酶是在各种霉菌和酵母菌中表达的蛋白水解酶，允许明胶液化。明胶酶的种类没有特别限制。在人体中表达的明胶酶包括基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(MMP_2)。在另一个典型实施例中，选自黄芪、三白草和甘草中的一种或多种的提取物具有抑制MMP-9和/或MMP-2的效果。本发明组合物可通过抑制明胶酶特别是 MMP-9和/或MMP-2，来抑制和预防痤疮疤痕。本发明组合物可用于各种不同的应用，而没有特别的限制。例如，可将所述组合物制成用于外部皮肤涂敷的剂型，特别是化妆品或药物组合物。本发明的用于外部皮肤涂敷的组合物可以是油性或水性介质中的溶液剂型、混悬剂、乳液剂型或使用前可溶解于无菌水的干粉剂型。可使用大豆卵磷脂等天然产生的磷脂、失水山梨醇单油酸酯等无水己糖醇、脂肪酸衍生酯、或聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯等无水己糖醇与具有环氧乙烷的脂肪酸衍生酯的缩合产物作为乳化剂，将活性成分乳化于油相，如橄榄油等植物油、液体石蜡等矿物油中，制得油包水型乳液。在另一个典型实施例中，本发明的用于外部皮肤涂敷的组合物可含有占组合物总质量为0. l_20wt%，具体为0. 5-20wt%的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏的提取物。提取物含量过小，控制和改善皮肤状况的效果很轻微。提取物含量过大，会降低添加提取物的效率且可能发生稳定性问题。本发明还提供含有所述组合物的化妆品组合物。当将所述组合物制成化妆用组合物时，其可以用于抑制或改善痤疮导致的色素沉着。同时，其也可用于抑制或改善痤疮疤痕。所述化妆品组合物可以是任何剂型，没有特殊限制。例如，所述化妆品组合物可以是润肤乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、面膜、凝胶或皮肤粘合型化妆品的剂型。所述化妆用组合物还可以是经皮给药的剂型，如乳液、软膏、凝胶、霜、贴剂和喷雾。本领域的技术人员可容易地根据每种剂型或化妆用组合物的类型或用途添加其它成分。本发明还提供含有所述组合物的药物组合物。含有本发明所述组合物的药物组合物可以是用于改善和抑制痤疮导致的色素沉着和/或痤疮疤痕的组合物。当本发明的组合物用于药品时，可向组合物中添加有机或无机载体作为活性成分，以制备用于口服或肠胃外给药的固体、半固体或液体剂型。用于口服给药的剂型可以是片剂、丸剂、颗粒剂、硬或软胶囊、粉剂、细粉剂、粉末、 乳液、糖浆、丹剂等。用于肠胃外给药的剂型可以是注射、滴剂、软膏、洗剂、喷雾、混悬剂、乳剂、栓剂等。根据常用方法，适当地使用表面活性剂、赋形剂、着色剂、香精、防腐剂、稳定剂、 缓冲剂、悬浮剂或其它常用的佐剂，可容易地制备这些剂型。本发明的药物组合物可以口服给药、直肠给药、局部给药、经皮给药、静脉注射、肌肉注射、腹腔给药或皮下给药。所述活性成分的给药剂量会因治疗对象的年龄、性别和体重，治疗的特定疾病或生理条件，疾病或生理条件的严重程度，给药途径和诊断的识别而不同。基于以上因素，给药剂量的确定在本领域的技术人员水平范围内。普通剂量为0.001-2000 mg/kg/天，更具体地为 0. 5-1500 mg/kg/ 天。本发明还提供调养组合物，该调养组合物含有活性成分或成分，其中含有选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种的提取物。更具体地，本发明还提供用于有计划地治疗痤疮后效，如色素沉着和/或疤痕，并控制和改善皮肤状况的调养组合物。在一个典型实施例中，本发明调养组合物可含有占所述组合物总质量为0. 1-20 wt%，更具体为0. 5-20 wt%的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏的提取物。提取物含量过小，控制和改善皮肤状况的效果很微弱。提取物含量过大，会降低添加的提取物的效率，也可能会发生稳定性问题。这里使用的术语‘调养’指用于控制和改善皮肤状况的有计划地后期处理。例如， 在河边、海边或山谷度假后或长时间晒黑后，由于皮肤过度暴露于紫外线下皮肤可能发生炎症。当防晒霜或防晒油等中的含有各种添加剂残留在皮肤上时，可能会诱导炎症性痤疮。 此外，日常生活中的各种原因均可引起包括炎症性痤疮在内的皮肤问题。调养总体上是指用于控制和改善皮肤状况，以抵抗包括炎症性痤疮在内的皮肤问题的后期处理。并且所述调养组合物可以是一种用于调养的、粘附、沉积或涂敷在皮肤上的组合物。本发明还提供含有所述组合物的食品添加剂、功能性食品或保健食品组合物。具体地，所述组合物可以是用于改善和抑制痤疮导致的色素沉着和/或疤痕的组合物。
本发明组合物可以是各种形式的食品添加剂或功能性食品组合物。可将其制成发酵牛奶、奶酪、酸奶、果汁、益生菌、膳食补充剂和各种食品添加剂。在一个典型实施例中，所述组合物中可含有其它成分，这些成分不会消极地影响本发明所需的效果，且可提供协同效果。例如，组合物中还可以含有用于改善物理性质的香精、色素、消毒剂、抗氧化剂、防腐剂、保湿剂、增稠剂、矿物质、乳化剂和合成高分子材料等。 此外，还可以含有水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多糖和海藻提取物等辅助成分。本领域的技术人员选择这些成分毫无困难，添加量应在对本发明所要达到的作用产生副作用的范围内。本发明组合物可以是各种剂型，包括溶液、乳液、粘稠的混合物、片剂和粉体等，也可以通过各种方式给药，包括简单的饮用、注射、喷涂和挤压等。
实施例下面将描述实施例和实验。以下实施例和实验仅用作说明用途，并非为了限制本发明的范围。[实施例1]黄芪提取物的制备
收获8年生的黄芪，洗净和干燥后粉碎。将黄芪与水混合，在真空高压陶瓷设备中80°C 下提取6-8小时。离心和过滤产生的提取物，以去除杂质。接着，加入1，3-丁二醇制备黄芪提取物。[实施例2]三白草提取物的制备
将三白草的根洗净、晾干，接着在室温下用10倍体积的乙醇提取7天。用250目 (3-μπι)的过滤器过滤提取物，再在60°C浓缩。将浓缩物溶解于水中，加入乙酸乙酯。相分离后，分离乙酸乙酯层，并在60°C浓缩。向浓缩物中加入二氯甲烷后，将生成的溶液在乙酸乙酯和正己烷的混合物中沉淀两次，去除杂质。柱分馏后，生成的馏分再在60°C反复浓缩， 接着在30°C的减压条件下完全去除残留的溶剂。接着，将产物溶解在丁二醇中使其浓度为 H进一步过滤和沉淀产生的溶液，以制备三白草提取物。[实施例3]甘草提取物的制备
将甘草的根洗净，用乙醇浸泡提取。过滤提取物，并减压浓缩。用乙酸乙酯对浓缩提取物再次提取。用树脂柱分离乙酸乙酯馏分，并对其进行过滤、浓缩和干燥，以制备甘草提取物。[实施例4]蔷薇提取物的制备
将蔷薇花瓣洗净，干燥，接着用热水、丙二醇或它们的混合物提取。将产生的提取物在减压条件下反复浓缩和喷雾干燥，直到完全去除残留的溶剂，即可得到粉状的蔷薇提取物。[实施例5]大黄提取物的制备
将Ikg的大黄加入到20kg的纯净水中，并在25°C下提取M小时。将提取物在0-4°C 沉淀M小时后，用250目过滤器过滤提取物，并用活性炭对滤液进行脱色和去味，进一步反复过滤滤液，以制备大黄提取物。[实施例6]刺五加提取物的制备
将Ikg的刺五加加入到20kg的纯净水中，在25°C下提取M小时。将提取物在0-4°C 沉淀M小时后，用250目过滤器过滤提取物，并用活性炭对滤液进行脱色和去味，进一步反复过滤滤液，以制备刺五加提取物。[实施例7]黄柏提取物的制备
将Ikg的黄柏加入到20kg的纯净水中，在25°C下提取M小时。将提取物在0-4°C沉淀对小时后，用250目过滤器过滤提取物，并用活性炭对滤液进行脱色和去味，进一步反复过滤滤液，以制备黄柏提取物。[测试实施例1]细胞的培养
按照&ito等的方法(/ Invest Dermatol 2001, 117: 965-70)从5周大的雄性金仓鼠的耳朵的皮脂腺中得到皮脂腺细胞。接着在培养皿中将皮脂腺细胞培养至2. 35xl04个细胞/cm2。向 DMEM/Ham，s F12 培养基(DMEM/F12) (1:1, Invitrogen, Carlsbad, CA)中加入10%的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)，接着加入0. 68mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen)和 IOnM 重组人表皮生长因子(rhEGF; Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany)来制备培养基。将100 mg/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素(均来自Gibco，Milan, Italy)用作抗生素。仓鼠皮脂腺细胞与培养皿完全粘合需要M小时。接着在37°C和5%的CO2条件下培养细胞。在DMEM 培养基anvitrogen, Carlsbad, CA)中，在 37°C和 5%C02 条件下，培养人角质形成细胞株HaCaT。其中，DMEM培养基添加了 10%的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)、100 mg/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素(两者均来自Gibco, Milan, Italy)。在RPMI-1640 培养基anvitrogen, Carlsbad, CA)中，在 37°C禾Π 10% 的(X)2 条件下，培养C57BL/6J小鼠产生的黑素细胞Melan-a细胞。其中，RPMI-1640培养基中添加了 10% 的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)、200nM 的十四酰佛波乙酯(ΤΡΑ)、100 mg/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素(所有均来自Gibco, Milan, Italy)。[测试实施例2]体外炎症性痤疮的抑制
将类似于人体痤疮环境的体外炎症模型与皮脂腺细胞和角质形成细胞一起用于有效测试黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏提取物对炎症性痤疮的抑制效果。将 HaCaT角质形成细胞和金仓鼠皮脂腺细胞种在24-孔培养板上，细胞数分别为3. 75xl04和 6. OxlO40允许所述细胞粘附在培养板的底部一天。通过向DMEM/Ham’ s F12培养基(1:1， Invitrogen, Carlsbad, CA)中添力口 10% 的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)，接着添加100 mg/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素(两者均来自Gibco公司，米兰，意大利) 来制备培养基。一天后，用50 μ M的亚油酸、50 μ M的花生四烯酸、IOnM的双氢睾酮和0. 5%的痤疮丙酸杆菌座麽)作为刺激剂诱导炎症性痤疮。同时，用黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物处理细胞，并研究它们对炎症性痤疮的抑制效果。将二甲基亚砜(DMSO) 用作阴性对照，将IOOnM用于治疗痤疮的处方药异维甲酸用作阳性对照。用刺激剂和提取物处理一天后，在50 培养基中通过多重基于微珠的细胞因子分析测定培养基中释放的炎症性细胞因子(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、白细胞介素-la (IL-Ia 白细胞介素-8 (IL-8)和肿瘤坏死因子-a (TNF-a)的浓度。
具体地，步骤如下。用洗涤缓冲液润湿96-孔滤板后，用真空泵完全去除溶液。接着，细胞培养基与抗体-偶联微珠反应30min。反应完成后，加入检测抗体，继续反应30min。 然后，向每个孔中加入链霉亲和素-藻红蛋白(PE)。30分钟后，用洗涤缓冲液去除残留未附着的链霉亲和素-藻红蛋白，用Bio-Plex 200测定附着在微珠上的细胞因子的数量。黄芪提取物的结果如图1 (GM-CSF)、图2 (IL-1 α )、图3 (IL-8)和图4 (TNF-α ) 所示。参考图1-4，黄芪提取物以浓度-依赖性方式抑制炎症性细胞因子。具体地，由图1 可知，黄芪提取物与处方药-异维甲酸对GM-SCF具有同等的抑制效果。三白草提取物的结果如图5(GM_CSF)、图6(IL_1 α )、图7(IL_8)和图8(TNF-α ) 所示。参考图5-8，三白草提取物以浓度-依赖性方式抑制炎症性细胞因子。由图6可知， 三百草提取物对IL-I α的抑制效果仅在50ppm以下比较高。甘草提取物的结果如图9 (GM-CSF)、图10 (IL-1 α )、图11 (IL-8)和图12 (TNF-α )所示。参考图9-12，甘草提取物在25ppm时对展示了最好的炎症性细胞因子的抑制效果。因此，可知即使在相对较低的浓度下，甘草提取物仍能有效地抑制炎症性细胞因子。蔷薇提取物的结果如图13 (GM-CSF)、图14 (IL-1 α )、图15 (IL-8)和图16 (TNF-α )所示。参考图13-16，蔷薇提取物以浓度-依赖性方式抑制炎症性细胞因子。大黄提取物的结果如图17 (GM-CSF)、图18 (IL-1 α )、图19 (IL-8)和图20 (TNF-α )所示。参考图17-20，大黄提取物以浓度-依赖性方式抑制炎症性细胞因子。刺五加提取物的结果如图21 (GM-CSF)、图22 (IL-1 α)、图23 (IL-8)和图24 (TNF-α )所示。参考图21-24，刺五加提取物以浓度-依赖性方式抑制炎症性细胞因子。黄柏提取物的结果如图25 (GM-CSF)、图洸(IL-1 α )、图27 (IL-8)和图28 (TNF-α )所示。参考图25-28，黄柏提取物以浓度-依赖性方式抑制炎症性细胞因子。[测试实施例3]体外皮脂生成的抑制
将类似于人体痤疮环境的体外炎症模型与皮脂腺细胞和角质形成细胞一起用于有效测试黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏提取物对皮脂生成的抑制效果。将 HaCaT角质形成细胞和金仓鼠皮脂腺细胞种在24-孔培养板上，细胞数分别为3. 75xl04和 6. OxlO40允许细胞粘附在所述培养板的底部一天。通过向DMEM/Ham’ s F12培养基(1:1， Invitrogen, Carlsbad, CA)中添力口 10% 的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)，接着添加100 mg/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素(两者均来自Gibco，Milan, Italy)来制备培养基。一天后，用50 μ M的亚油酸、50 μ M的花生四烯酸、IOnM的双氢睾酮和0. 5%的痤疮丙酸杆菌0°.座麽)作为刺激剂诱导炎症性痤疮。同时，分别用黄芪、三白草、甘草、蔷薇、 大黄、刺五加或黄柏提取物处理细胞，并研究它们对皮脂生成的抑制效果。将二甲基亚砜 (DMSO)用作阴性对照，将IOOnM的用于治疗痤疮的处方药异维甲酸用作阳性对照。用刺激剂和提取物处理一天后，通过油红0染色法测定细胞中产生的中性脂质的数量。具体地，步骤如下。用PBS洗涤细胞，并将细胞在3. 7%的甲醛溶液中固着30min。 固着的细胞经PBS洗涤3次和70%的乙醇洗涤1次，接着用油红0溶液染色30min。将染色后的细胞再用70%的乙醇洗涤1次，用PBS洗涤3次。接着，用异丙醇溶解油红0溶液，用分光光度计测定520nm处的吸光度。
黄芪提取物的结果如图四所示。参考图四，黄芪提取物可有效抑制皮脂生成。具体地，黄芪提取物在5ppm及以上浓度时，表现出了优越的皮脂生成的抑制效果。三白草提取物的结果如图30所示。参考图30，三白草提取物以浓度-依赖性方式抑制皮脂生成。三白草提取物在50ppm及以上浓度表现出了对皮脂生成的明显的抑制效果。甘草提取物的结果如图31所示。参考图31，即使在相对较低浓度，甘草提取物仍表现出了对皮脂生成的抑制效果。蔷薇提取物的结果如图32所示。参考图32，蔷薇提取物以浓度-依赖性方式抑制皮脂生成。大黄提取物的结果如图33所示。参考图33，大黄提取物以浓度-依赖性方式抑制皮脂生成。刺五加提取物的结果如图34所示。参考图34，刺五加提取物以浓度-依赖性方式抑制皮脂生成。黄柏提取物的结果如图35所示。参考图35，黄柏提取物以浓度-依赖性方式抑制皮脂生成。具体地，黄柏提取物在250ppm时表现出了对皮脂生成的明显的抑制效果。[测试实施例4]体外痤疮导致的色素沉着的抑制
将类似于人体炎症性痤疮诱导的色素沉着环境的体外模型与黑素细胞一起用于有效测试黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏提取物对痤疮导致的色素沉着的抑制效果。在24-孔培养板上培养5.0X10%elan-a黑素细胞。允许细胞粘附在培养板底部一天。 通过向 RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中添加 10% 的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)，接着添加200nM的十四酰佛波乙酯(ΤΡΑ)、100 mg/mL的青霉素和100 mg/ mL的链霉素(所有均来自Gibco Gibco，Milan, Italy)来制备培养基。一天后，用50 μ M的亚油酸、50 μ M的花生四烯酸、IOnM的双氢睾酮和0. 5%的痤疮丙酸杆菌座麽)作为刺激剂诱导痤疮导致的色素沉着，培养5天。接着，分别用黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物处理细胞，并研究它们对痤疮导致的色素沉着的抑制效果。将二甲基亚砜(DMSO)用作阴性对照，将1 μ M对苯二酚和200 ppm曲酸用作阳性对照。对苯二酚是一种处方药，用作黑色素抑制剂。曲酸具有美白效果，常用作化妆用组合物。然而，曲酸可对皮肤产生强烈刺激，且据最近报道其有导致各种癌症的可能性。用提取物处理5天后，用IN NaOH处理来溶解黑色素，并用分光光度计测定405nm处的吸光度。黄芪提取物的结果如图36所示。参考图36，黄芪提取物以浓度-依赖性方式抑制色素沉着。5ppm时，其色素沉着的程度甚至低于用作处方药的对苯二酚。特别是，25ppm 时，其色素沉着的程度甚至低于未用任何刺激剂处理的对照组。因此，可以看出黄芪提取物具有优越的色素沉着抑制效果和皮肤美白效果。三白草提取物的结果如图37所示。参考图37，三白草提取物以浓度_依赖性方式抑制色素沉着。特别是5ppm时，其色素沉着抑制效果非常优越，色素沉着程度甚至低于未用任何刺激剂处理的对照组。因此，可以看出三白草提取物具有优越的色素沉着抑制效果和皮肤美白效果。甘草提取物的结果如图38所示。参考图38，甘草提取物以浓度-依赖性方式抑制色素沉着。特别是250ppm时，其色素沉着抑制效果非常优越，色素沉着程度甚至低于未用任何刺激剂处理的对照组。因此，可以看出三白草提取物具有优越的色素沉着抑制效果和皮肤美白效果。蔷薇提取物的结果如图39所示。参考图39，蔷薇提取物以浓度依赖性方式抑制色素沉着。特别是250ppm时，其色素沉着抑制效果非常优越，色素沉着程度甚至低于未用任何刺激剂处理的对照组。因此，可以看出蔷薇提取物具有优越的色素沉着抑制效果和皮肤美白效果。大黄提取物的结果如图40所示。参考图40，大黄提取物以浓度-依赖性方式广泛抑制色素沉着。50ppm时，其色素沉着抑制效果最好。因此，可以看出，即使在相对低浓度时，大黄提取物仍具有优越的色素沉着抑制效果和明显的皮肤美白效果。刺五加提取物的结果如图41所示。参考图41，刺五加提取物以浓度-依赖性方式广泛抑制色素沉着。250ppm时，其色素沉着抑制效果最好。因此，可以看出刺五加提取物具有优越的色素沉着抑制效果和皮肤美白效果。黄柏提取物的结果如图42所示。参考图42，黄柏以浓度-依赖性方式广泛抑制色素沉着。250ppm时，其色素沉着抑制效果最好。因此，可以看出黄柏提取物具有优越的色素沉着抑制效果和皮肤美白效果。[测试实施例5]体外痤疮疤痕的抑制
将类似于人体痤疮环境的体外痤疮疤痕模型用于测试黄芪、三白草和甘草提取物对痤疮疤痕的抑制效果。在24-孔培养板上培养6. OxlO4金仓鼠皮脂腺细胞。允许细胞粘附在培养板底部一天。通过向DMEM/Ham，s F12培养基(1 :1，hvitrogen，Carlsbad，CA)中添加10%的胎牛血清(JRH Bioscience, Tokyo, Japan)，接着添加100 mg/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素(两者均来自Gibco，Milan, Italy)来制备培养基。一天后，用50 μ M的亚油酸、50 μ M的花生四烯酸、IOnM的双氢睾酮和0. 5%的痤疮丙酸杆菌0°.座麽)作为刺激剂诱导炎症性痤疮。同时，用黄芪、三白草或甘草提取物处理细胞，并研究它们对痤疮疤痕的抑制效果。将二甲基亚砜(DMSO)用作阴性对照，将IOOnM的用于治疗痤疮的处方药异维甲酸用作阳性对照。用刺激剂和提取物处理一天后，用明胶酶谱法测定溶解在培养基中的基质金属蛋白酶(MMP)的明胶的降解活性。具体地，步骤如下。将5 μ L的细胞培养基与5 μ L的三甘氨酸样品缓冲液 (Invitrogen, Carlsbad, CA)混合，并在150V，含有ang/mL明胶的10%的丙烯酰胺凝胶中电泳分离2小时。凝胶从框架(frame)中分离出后，使其与洗脱液反应30min，接着室温下与孵育液反应30min，进一步在37° C下，孵育液中孵化8小时。去除孵育液后，用PBS洗涤 3次，用SimplyBlue (Invitrogen，Carlsbad, CA)将凝胶染色1小时。用蒸馏水洗涤染色的凝胶，直到能从背景充分识别光谱带(band)，并观察。黄芪提取物的结果如图43-45所示。从图43可知，可识别出用电泳分离法分离的 MMP-9和MMP-2。从图44可知，黄芪提取物具有MMP-9的抑制效果。从图45可知，黄芪提取物比广泛用于治疗痤疮的处方药异维甲酸具有更好的MMP-2的抑制效果。三白草提取物的结果如图46-48所示。从图46可知，可识别出用电泳分离法分离的MMP-9和MMP-2。从图47和48可知，三白草提取物具有MMP_9、MMP-2的抑制效果。其抑制效果可与广泛用于治疗痤疮的处方药异维甲酸的抑制效果相媲美。甘草提取物的结果如图49-51所示。从图49可知，可识别出用电泳分离法分离的MMP-9和MMP-2。从图50和51展示了甘草提取物对MMP_9、MMP_2的抑制效果。具体地，甘草提取物具有优越的MMP-2抑制效果。下面描述了所述组合物的剂型实施例，这些实施例仅用作说明用途，并非为了限制本发明。[剂型实施例1]软胶囊的制备
将80mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，9mg的维生素E，9mg的维生素C，2mg的棕榈油，8mg的氢化植物油，^ig的黄蜂蜡和9mg的卵磷脂混合，按照常用的方法制成软胶囊的填充溶液。向每个胶囊中装填400mg填充溶液制备软胶囊。单独地，用质量分数为66wt%的明胶、的甘油和10wt%的山梨醇制备软胶囊的包衣。然后，将填充溶液填充入所述软胶囊包衣中，以制备含有400mg的本发明的组合物的软胶囊。[剂型实施例2]片剂的制备
将80mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，9mg的维生素E，9mg的维生素C，200mg的寡聚半乳糖，60mg的乳糖和140mg的麦芽糖混合。使用硫化床干燥机造粒后，加入6mg的糖酯。按照常用的方法将得到的5(Mmg组合物制成片剂。[剂型实施例3]饮剂的制备
将80mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，9mg的维生素E，9mg的维生素C，IOg的葡萄糖，0. 6g的柠檬酸和25g的寡聚糖糖浆混合。向每个瓶子中装入300ml 的纯净水和200ml产物。接着，通过在130°C消毒4_5秒制备饮剂。[剂型实施例4]颗粒剂的制备
将80mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，9mg的维生素E，9mg的维生素C，250mg的无水结晶葡萄糖和550mg的淀粉混合，用流化床干燥机造粒，并装入在小袋中。[剂型实施例5]软胶囊的制备
将40mg的黄芪提取物、40mg的三白草提取物、9mg的维生素E、9mg的维生素CJmg的棕榈油、8mg的氢化植物油、％ig的黄蜂蜡和9mg的卵磷脂混合，按照常用的方法制成软胶囊的填充溶液。向每个胶囊中装入400mg填充溶液以制备软胶囊。单独地，用质量分数为66wt% 的明胶、2#1%的甘油和10wt%的山梨醇制备软胶囊包衣。然后，将填充溶液装入所述软胶囊包衣，以制备含有400mg本发明的组合物的软胶囊。[剂型实施例6]片剂的制备
将各20mg的黄芪、三白草、甘草和蔷薇提取物与9mg的维生素E、9mg的维生素C、200mg 的寡聚半乳糖、60mg的乳糖和140mg的麦芽糖混合。使用硫化床干燥机造粒后，加入6mg的糖酯。按照常用的方法将得到的5(Mmg组合物制成片剂。[剂型实施例7]饮剂的制备
将等质量的黄芪、三白草和甘草提取物混合，制成80mg的混合物。将该混合物与9mg 的维生素E、9mg的维生素C、IOg的葡萄糖、0. 6g的柠檬酸和25g的寡聚糖糖浆混合，并加入 300mL纯净水，然后向每个瓶子中装入200mL所得产物。然后，在130°C消毒4_5秒，以制备饮剂。[剂型实施例8]颗粒剂的制备
将各20mg的蔷薇、大黄、刺五加和黄柏提取物与9mg的维生素E、9mg的维生素C、250mg的无水结晶葡萄糖和^Omg的淀粉混合，用流化床造粒机造粒，并装入小袋中。[剂型实施例9]润肤乳液(润肤乳液)的制备
将0. 3mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，6. Omg的丁二醇， 6. Omg的丙二醇，0. 3mg的聚羧乙烯，0. 6mg的PEG-12壬基苯基醚，1. 2mg的吐温80，30. Omg 的乙醇，0. 3mg的三乙醇胺和255mg的纯净水与防腐剂、色素和香精(少量)混合，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合制成润肤乳液。[剂型实施例10]滋养乳液(牛奶乳液)的制备
将0. 3mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，12. Omg的蜂蜡， 4. 5mg的吐温60，4. 5mg的脱水山梨醇倍半油酸酯，1. 5mg的液体石蜡，15mg的蒙大纳202 (Seppic), 9. Omg的甘油，9. Omg的丁二醇，9. Omg的丙二醇，0. 3mg的聚羧乙烯，0. 6mg的三乙醇胺和23%ig的纯净水与防腐剂、色素和香精(少量)混合，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成滋养乳液。[剂型实施例11]按摩霜的制备
将0. 3mg的黄I三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，30. Omg的蜂蜡， 4. 5mg的吐温60，6. Omg的PEG 60氢化蓖麻油，2. 4mg的脱水山梨醇倍半油酸酯，120. Omg的液体石蜡，15. Omg的异十三烷，12. Omg的蒙大纳202(kppic)，15. Omg的甘油，12. Omg的丁二醇，12. Omg的丙二醇，0. 6mg的三乙醇胺和70mg的纯净水与防腐剂、色素和香精(少量) 混合，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成按摩霜。[剂型实施例12]面膜的制备
将0. 5mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，1. Omg的β -1，3-葡聚糖，13. Omg的聚乙烯醇，0. 2mg的羧甲基纤维素钠，5. Omg的甘油，0. Img的尿囊素，6. Omg 的乙醇，0. 3mg的PEG-12壬基苯基醚，0. 3mg的吐温60与防腐剂、色素和香精(少量)混合。 加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成面膜。[剂型实施例13]凝胶的制备
将0. 05mg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，0. Img的β-1，3-葡聚糖，0. 05mg的乙二胺乙酸钠，5. Omg的甘油，0. 3mg的聚羧乙烯，5. Omg的乙醇，0. 5mg的 PEG-60氢化蓖麻油，0. 3mg的三乙醇胺与防腐剂、色素和香精(少量)混合。加入纯净水后， 按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成凝胶。[剂型实施例14]润肤乳液(润肤乳液)的制备
将各0. Img的黄芪、三白草和甘草提取物，6. Omg的丁二醇，6. Omg的丙二醇，0. 3mg的聚羧乙烯，0. 6mg的PEG-12壬基苯基醚，1. 2mg的吐温80，30. Omg的乙醇，0. 3mg的三乙醇胺和255mg的纯净水与防腐剂、色素和香精(少量)混合，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成润肤乳液。[剂型实施例15]滋养乳液(牛奶乳液)的制备
将各0. 15mg的黄芪和三白草提取物，12. Omg的蜂蜡，4. 5mg的吐温60，4. 5mg的脱水山梨醇倍半油酸酯，1. 5mg的液体石蜡，15mg的蒙大纳202 (Seppic),9. Omg的甘油，9. Omg的丁二醇，9. Omg的丙二醇，0. :3mg的聚羧乙烯，0. 6mg的三乙醇胺和23%ig的纯净水与防腐剂、 色素和香精(少量)混合，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成滋养乳液。
[剂型实施例16]按摩霜的制备
将各0. 075mg的蔷薇、大黄、刺五加和黄柏提取物，30. Omg的蜂蜡，4. 5mg的吐温60， 6. Omg的PEG 60氢化蓖麻油，2. ^ig的脱水山梨醇倍半油酸酯，120. Omg的液体石蜡，15. Omg 的异十三烷，12. Omg的蒙大纳202(kppic)，15. Omg的甘油，12. Omg的丁二醇，12. Omg的丙二醇，0. 6mg的三乙醇胺和70mg的纯净水与防腐剂、色素和香精(少量)混合，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成按摩霜。[剂型实施例17]面膜的制备
将各0. 25mg的刺五加和黄柏提取物，1. Omg的β -1，3-葡聚糖，13. Omg的聚乙烯醇， 0. 2mg的羧甲基纤维素钠，5. Omg的甘油，0. Img的尿囊素，6. Omg的乙醇，0. 3mg的PEG-12壬基苯基醚，0. 3mg的吐温60与防腐剂、色素和香精(少量)混合。加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成面膜。[剂型实施例18]凝胶的制备
将各0. Olmg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇和大黄提取物，0. Img的β _1，3-葡聚糖， 0. 05mg的乙二胺乙酸钠，5. Omg的甘油，0. 3mg的聚羧乙烯，5. Omg的乙醇，0. 5mg的PEG-60 氢化蓖麻油，0. 3mg的三乙醇胺与防腐剂、色素和香精(少量)混合。加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成凝胶。[剂型实施例19]用于外部皮肤涂敷的软膏的制备
将2. Omg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，10. Omg的β -1，3-葡聚糖，10. Omg的蜂蜡，5. Omg的吐温60，2. Omg的PEG-60氢化蓖麻油，0. 5mg的脱水山梨醇倍半油酸酯，5. Omg的凡士林，10. Omg的液体石蜡，5. Omg的异十三烷，3. Omg的牛油果脂， 5. Omg的辛酸/癸酸甘油三酯，IOmg的甘油，10. 2mg的丙二醇，0. 2mg的三乙醇胺与防腐剂、 色素和香精(少量)混合。加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成软膏。[剂型实施例20]局部施用的贴剂的制备
将1. Omg的黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加或黄柏提取物，3. Omg的β -1，3-葡聚糖，20. Omg的己二醇，0. 7mg的二乙胺，l.Omg的聚丙烯酸(卡波姆934P)，0. Img的亚硫酸钠，l.Omg的十二烷基聚氧乙烯醚(E.0 = 9)，l.Omg的聚羟乙烯十六烷基十八酯 (Cetomacrogol 1000)，2. 5mg 的粘性石蜡油，2. 5mg 的辛酸 / 癸酸酯(Cetiol LC), 3. Omg 的 PEG400与防腐剂、色素和香精(少量)混合。加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成贴剂。[剂型实施例21]用于外部皮肤涂敷的软膏的制备
将各1. Omg的黄芪和三白草提取物，10. Omg的β -1，3-葡聚糖，10. Omg的蜂蜡，5. Omg 的吐温60，2. Omg的PEG-60氢化蓖麻油，0. 5mg的脱水山梨醇倍半油酸酯，5. Omg的凡士林， 10. Omg的液体石蜡，5. Omg的异十三烷，3. Omg的牛油果脂，5. Omg的辛酸/癸酸甘油三酯， IOmg的甘油，10. 2mg的丙二醇，0. 2mg的三乙醇胺与防腐剂、色素和香精(少量)混合。加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合，制成软膏。[剂型实施例22]局部施用的贴剂的制备
将各0. 25mg的蔷薇、大黄、刺五加和黄柏提取物，3. Omg的β -1，3-葡聚糖，20. Omg的己二醇，0. 7mg的二乙胺，1. Omg的聚丙烯酸(卡波姆934P)，0. Img的亚硫酸钠，1. Omg的十二烷基聚氧乙烯醚(E.0 = 9)，l.Omg的聚羟乙烯十六烷基十八酯(聚乙二醇1000)，2. 5mg的粘性石蜡油，2. 5mg的辛酸/癸酸酯(Cetiol LC), 3. Omg的PEG400与防腐剂、色素和香精 (少量)混合。加入纯净水后，按照常用的方法，通过加入上述含量的每种成分并均勻混合， 制成贴剂。虽然本发明对具体实施例进行了描述，在不偏离以下权利要求中限定的发明范围和精神的前提下，可进行各种变化和修改，这对本领域普通技术人员是显而易见的。[工业应用]
本发明组合物在抑制痤疮导致的色素沉着和/或有孔痤疮方面有效，可以各种方式用于化妆品、食品和药物领域。
权利要求
1.用于抑制痤疮导致的色素沉着的组合物，所述组合物含有作为活性成分的、选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物。
2.用于抑制痤疮疤痕的组合物，所述组合物含有作为活性成分的、选自黄芪、三白草和甘草中的一种或多种提取物。
3.根据权利要求2所述的用于抑制痤疮疤痕的组合物，其特征在于，所述选自黄芪、三白草和甘草中的一种或多种提取物可抑制明胶酶。
4.用于外部皮肤涂敷的组合物，所述组合物含有权利要求1或2所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的用于外部皮肤涂敷的组合物，其特征在于，所述组合物含有的所述选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物占所述组合物总质量的0. l-20wt%。
6.含有权利要求1或2所述的组合物的化妆品组合物。
7.用于抑制痤疮导致的色素沉着或痤疮疤痕的组合物，所述组合物含有权利要求1或 2所述的组合物。
8.用于调节痤疮后效的调养组合物，所述组合物含有作为活性成分的、选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物。
9.食品添加剂或保健食品组合物，所述组合物含有权利要求1、2和8中任意一项所述的组合物。
全文摘要
本发明公开一种含有活性成分或成分的组合物，该成分含有选自黄芪、三白草、甘草、蔷薇、大黄、刺五加和黄柏中的一种或多种提取物。该组合物对抑制痤疮样色素沉着和/或有孔痤疮有效，可通过各种途径应用于化妆品、食品和药物领域。
文档编号A61K36/78GK102573787SQ201080046468
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月13日 优先权日2009年8月14日
发明者徐姃我, 朴元锡, 朴锺喜, 李昌根, 申洪柱, 金亨俊, 金度勋, 金正焕, 高现珠 申请人:株式会社爱茉莉太平洋