专利名称：一种细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力pmf的测定 方法，从而表征细菌厌氧呼吸产生的能量。
背景技术：
厌氧呼吸是一类在无氧或低氧条件下进行的，以氧气以外物质为呼吸链末端电子受体的 生物氧化过程，是一类产能效率较低的呼吸形式。厌氧呼吸的一般过程为1)电子供体在特 异性酶的作用下被氧化脱下电子，电子沿电子传递链按电势由低到高传递，最后交给末端电 子受体;2)在电子传递过程中，偶联H+由细菌胞质向胞外运输，形成跨膜的H+浓度梯度，
把化学能转化为电势能；3) H+在电化学电势驱动下，通过菌体细胞膜上的FoFrATP酶分子 的特殊通道回流到细菌胞质，同时释放自由能偶联ATP的合成。
在细菌呼吸过程中，能量产生是核心的内容。在生理条件下合成一个ATP分子所需自由 能大约为+40 50kJ/mo1，每合成一分子ATP大约需要2 3个H+跨膜。因此细菌由细菌胞质向 胞外运输的H+量就可以显示细菌能产生ATP的量。虽然体外测定ATP的方法有很多，但是对于 完整的细胞来说，直接测定其产生的ATP仍然比较困难。能量的产生依赖于细菌膜内外质子 动力pmf (proton-motive force)的存在，pm萨生是细菌呼吸产能的基础和前提，是细菌呼吸 产能的一种表征，可以通过测定pm沫反映细菌呼吸产生的能量。
然而细菌厌氧呼吸是一类产能效率较低的呼吸形式，其呼吸过程中细胞膜内外的pmf差较 微弱。如何准确测定细菌厌氧呼吸过程中细胞膜内外pmf是细菌厌氧呼吸产能研究中的技术难 点。
对于细菌呼吸过程中质子动力的测定技术，在国际上基本有两种方法。 一种是丫啶橙显 色双波长分光光度法测定pmf。这种方法的基本原理是根据丫啶橙在不同pH条件下光吸收的 最大波长的不同来指示体系中pH的变化，从而达到测定pm鹏目的。 一般采用的v4柳和^53o的 差值变化来表征在细菌呼吸过程的pm撤变化。这种方法对于那些在493nm或530nm有光吸收 的电子受体物质则不适用。另一种方法是采用电极测试法直接测定pmf。上述两种方法测定的 都是pm飾脉冲变化，即整个呼吸过程中H+被泵出细胞膜及回流的瞬时变化，不能准确表征 能量的产生。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确、适用范围广的测定细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内 外质子动力pmf的方法，从而表征细菌厌氧呼吸产生的能量。
本发明所述的测定细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力(pmf)的方法，主要利用脂溶 性的羧基试剂二环己基碳二亚胺DCCD与细胞膜上F0FrATP酶分子上的Fo蛋白亚基结合， 使H+无法回到细胞膜内，在厌氧呼吸条件下，是通过控制DCCD的量，使所有F(^-ATP酶 分子上的Fo蛋白亚基都能结合上DCCD，使得电子传递产生的H+都滞留在膜外，测定此时 的pH变化即可准确反应细菌膜内外质子动力(pmf)，从而表征细菌厌氧呼吸过程中产生的 ATP的量。
本发明通过以下技术方案予以实现
本发明所述的细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力(pmf)的测定方法，包括以下步
骤
(a) 将待测细菌培养至稳定生长期，收集菌体，去除培养基；
(b) 配置反应液在M9缓冲液的基础上添加待测细菌所需的单一电子供体和单一电子 受体，所述的M9缓冲液是含有5.7mmol/LNa2HP(V12H20， 3.3mmol/L KH2P04，
18.0mmol/L NH4C1的水溶液；
(c) 确定加入反应液中DCCD的用量
分别在若干相同体积的(b)步骤配置的反应液中加入不同剂量的二环己基碳 二亚胺DCCD，形成若干含有不同浓度DCCD的反应液，使各反应液的DCCD的 浓度呈一浓度梯度；在各反应液中分别加入(a)步骤收集的菌体，使各反应液中 的菌体浓度相同，在无氧条件下测定各反应液的pH值变化，以pH值出现下降过 程最后趋于稳定的反应液的DCCD剂量为测试用量；
(d) 测定厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力
在(b)步骤配置的反应液中加入(c)步骤测定的DCCD—种测试用量，所述 的反应液的体积与(c)步骤中一种未加入DCCD的反应液的体积相同，由此形成 测定反应液，在该测定反应液中加入(a)步骤的收集的菌体，使得菌体浓度与所 加入的该种DCCD测试用量的(c)步骤反应液中的菌体浓度相同，在无氧条件下 测定反应液的pH值变化，pH值出现降低过程直至稳定不变，测定的pH变化值即 为细菌膜内外质子动力。 本发明所述的(d)步骤中在反应液中加入的DCCD测试用量是(c)步骤中确定的各 DCCD测试用量中的最小剂量。
本发明还可以在所述的反应液中添加单一碳源，矿质元素和维生素，本发明还可根据细
5菌的具体生理特性添加必需的生长因子，可以保持细菌的生长。
本发明所述的单一碳源，矿质元素，维生素以待测细菌常规需要的组份和含量即可。
本发明所述的单一电子供体，单一电子受体，可根据细菌的呼吸类型来选择，其浓度选 择以不影响细菌的存活为准，并且电子供体提供电子的量等于或大于电子受体接受电子的量。
本发明所述的去除培养基是应用0.8%生理盐水进行洗涤。
本发明可以选择反应液体积的10%的菌液收集的菌体。
本发明所述的矿质元素的组份及含量可为1.0mmol/L MgS04、 0.5g/L MnS04、 0.1g/L ZnS04、 O.Olg/L CuS04、 O.Olg/L A1K(S04)、 l.Og/L NaCl、 0.1 g/L FeCl2、 0.1 g/L CaCl2和 CoCl20.1g/L。
本发明所述的维生素的组份及含量可为2mg/L生物素、2mg/L叶酸、10mg/L维生素 B6、 5 mg/L维生素B2、 5 mg/L维生素B1、 5 mg/L烟酸、5 mg/L泛酸、0.1 mg/L维生素 B12、 5 mg/L对氨基苯甲酸和5mg/L硫辛酸。
本发明所述的细菌可采用脱色希瓦氏菌S12，所述的单一碳源为琥珀酸钠，终浓度为10 mmol/L，所述的单一电子供体为甲酸钠，终浓度为10 mmol/L，单一电子受体柠檬酸铁，终 浓度为lmmol/L或者单一电子受体为觅菜红，其终浓度为0.1mmol/L。
本发明所述的细菌还可为大肠杆菌￡. co/!'DH5a ，所述的单一碳源为琥珀酸钠，终浓度 为10mmol/L，所述的单一电子供体为甲酸钠，终浓度为10mmol/L，单一电子受体柠檬酸铁， 终浓度为lmmol/L。
本发明可以先将DCCD溶解于丙酮中,配fi含有DCCD的母液，然后再加入到反应液中,
以方便使用。
本发明所述的DCCD测试用量以使所有FoFrAT:P酶分子上的Fc蛋白亚基都能结合上 DCCI:),其最小用量为恰好使所有FoFrAT:P酶分子上的F(.)蛋白亚基都能结合上DCCI:)，其最 大用量以不影响细菌的生存为界。
本发明所述的一种测定细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力(pmf)的方法，通过实验 证明本方法测定的细菌膜内外质子动力(pmf)与现有技术如丫啶橙双波长分光光度法测定的 结果或者理论分析结果是一致的，但是本发明不受电子受体是否在493nm或530nm具有光吸 收的影响，因此应用范围更广，而且由于采用DCCD抑制了 H+的回流，测定的不是pmf的 脉冲变化，且本方法操作简单，快速、准确的测定细菌膜内外质子动力(pmf)，表征细菌厌 氧呼吸产生的能量。
图1是不同浓度DCCD条件下脱色希瓦氏菌S12厌氧铁呼吸的pmf变化，其中1表示DCCD 浓度为0.01mol/L; 2表示DCCD浓度为0.0001mol/L; 3表示DCCD浓度为Omol/L; 图2是0.01mol/LDCCD条件下使用丫啶橙双波长分光光度法和本发明的方法测定的脱色希瓦 氏菌S12厌氧铁呼吸的pmf变化，其中1是应用本发明的方法测定的铁呼吸的pmf变化，2 是丫啶橙双波长分光光度法测定的铁呼吸的pmf变化；
图3是不同浓度DCCD条件下脱色希瓦氏菌S12厌氧偶氮呼吸的pmf变化，其中1表示DCCD
浓度为O.Olmol/L; 2表示DCCD浓度为Omol/L; 3表示DCCD浓度为0.0001mol/L;
图4是大肠杆菌DH5 a和脱色希瓦氏菌S12的在DCCD为O.Olmol/L条件下测定的pmf变化，
其中1表示大肠杆菌DH5 a的pH值变化，2表示脱色希瓦氏菌S12的pH值变化；
图5是O.Olmol/LDCCD条件下使用丫啶橙双波长分光光度法和本发明的方法测定的大肠杆菌
DH5a厌氧铁呼吸的pmf变化，其中I表示使用本发明的方法测定的厌氧铁呼吸的pmf变化，
2表示使用丫啶橙双波长分光光度法测定的厌氧铁呼吸的pmf变化。
具体实施例方式
本实施例是对本发明的进一步阐述，并不是对本发明的限制。
实施例1:脱色希瓦氏菌S12厌氧三价铁呼吸pmf的测定
(1) 简易厌氧装置的设计
150mL具盖试剂瓶，打出三个合适大小的气孔，其中一个接进气管(进气管一段接入通 气玻璃管，另一端接入氮气罐的气压计)， 一个插入排气管(排气管直接与大气连接)，另外 一个插入pH电极。试剂瓶内置反应液，于30 35'C水浴摇床培养，整个反应装置可方便移动。 反应前试剂瓶内液体需要鼓吹氮气10min上驱赶溶液中的溶解氧，充气完毕立刻封闭进气管和 排气管，使整个反应体系保持近乎无氧状态。
(2) 配置反应液
(a) 配置M9缓冲液，使得其含有5.7mmol/LNa2HPCV12H20、 3.3mmol/LKH2P04和 18.0mmol/LNH4Cl，在M9缓冲液中加入甲酸钠作为单一电子供体，终浓度为10mmol/L;柠 檬酸铁作为单一电子受体，终浓度为lmmol/L，从而形成反应液；
(b) 然后在反应液中再加入琥珀酸钠作为单一碳源，终浓度为10mmol/L，矿质元素 和维生素，所述的矿质元素的组份及含量(终浓度)为1.01mmol/LMgSO4、 0.5g/LMnSO4、 0.1g/LZnSO4、 0.01g/L CuS04、 O.Olg/L A1K(S04)、 L0g/LNaCl、 O.lg/L FeCl2、 O.lg/L CaCl2 和CoCl20.1g/L，所述的维生素组份及含量(终浓度)为2mg/L生物素、2mg/L叶酸、10 mg/L 维生素B6、 5 mg/L维生素B2、 5 mg/L维生素Bl、 5 mg/L烟酸、5 mg/L泛酸、0.1 mg/L维 生素B12、 5 mg/L对氨基苯甲酸和5mg/L硫辛酸。(3)确定反应液中添加DCCD的合适用量
先将DCCD溶于丙酮中，本步骤加入的DCCD和丙酮，经过测定分析不会引起反应液 pH值的变化，然后分别在步骤(2)中的(b)小步骤配置的反应液中加入二环己基碳二亚胺 DCCD，使得形成含有DCCD浓度分别为0mol/L， 0.0001 mol/L, 0.01mol/L的三种反应液。 接种脱色希瓦氏菌S12于10mLLB液体培养基中，于200rpm， 30 35'C摇床培养14小时左 右，使细菌刚刚进入稳定生长期。9000xg离心15min收集菌体，使用0.8%NaCl的生理盐水 洗涤两次，去除残留培养基，菌体最后重悬于lmL0.8WNaCl的生理盐水并接入100mL的上 述配置的含有O.Ol mol/LDCCD的反应液(含有其余两种浓度DCCD的测定方法同于本测定) 的试剂瓶中，置于30 35'C水浴摇床中，旋紧三孔胶塞盖，鼓吹氮气10min以后封闭进气管 和排气管，使得测定体系内保持无氧环境。由此刻开始，每隔5min记录一次pH变化，每次 测定前先摇匀试剂瓶内反应液以保证pH电极感应的均一性。
其测定结果如图1所示，由图1可见0.0001mol/L的DCCD没有完全抑制FoF,-ATP酶的 活性，pH没有发生降低变化。当使用0.01mol/L的DCCD时，随着脱色希瓦氏菌S12铁呼吸 的进行，三价铁随之还原成二价铁，溶液浅黄色褪去，随之溶液中的pH也逐渐降低，说明 铁呼吸电子传递产生的H+由于DCCD抑制了 FoF,-ATP酶活性而无法回流到细胞膜内，从而 引起溶液pH的降低，因此0.01mol/L的DCCD可以完全抑制细菌膜上的F化-ATP酶活性， 选定0.01mol/L的DCCD为本实验的测试用量。 (3)测定细菌膜内外质子动力(pmf)
在步骤(2)中的(b)小步骤配置的反应液中加入DCCD，其终浓度为0.01mol/L，由此 配置的液体为测定反应液。
接种脱色希瓦氏菌S12于10mLLB液体培养基中，于200rpm， 30 35'C摇床培养14小 时左右，使细菌刚刚进入稳定生长期。9000xg离心15min收集菌体，使用0.8%NaCl的生理 盐水洗涤两次，去除残留培养基，菌体最后重悬于lmL0.8XNaCl的生理盐水并接入100mL 的本步骤配置的含有0.01mol/LDCCD的测定反应液中，试剂瓶置于30 35'C水浴摇床中， 旋紧三孔胶塞，鼓吹氮气10min以后封闭进气管和排气管。由此刻开始，每隔5min记录一次 pH变化，每次测定前先摇匀试剂瓶内反应液以保证pH电极感应的均一性，其测定结果如图 2所示，其测定的pH差值为0.077，而由丫啶橙双波长分光光度法测定pmf为0.076，该方法 与使用丫啶橙双波长分光光度法测定pmf的结果相同。
实施例2:脱色希瓦氏菌S12厌氧偶氮呼吸pmf的测定
本实施同实施例l，只是将苋菜红作为单一电子受体，其终浓度为0.1mmol/L。本次测定结果如图3所示，pH差值为0.034。
理论上lmmol/L的柠檬酸铁作为末端电子受体时产生的氢离子浓度是以0.1mmol/L克菜 红作为电子受体时产生的氢离子的2.5倍，实施例l测定pH差值为0.077，实施例2测定的pH差 值为0.034，两者接近2.5倍，与理论值基本相符合。
实施例3:大肠杆菌DH5 a厌氧三价铁呼吸pmf的测定
本实施例基本同于实施例1,只是待测菌为大肠杆菌DH5 a ，首先配置与实施例l步骤 (2)中的(b)小歩骤配置的一样的反应液，然后在反应液中加入DCCD,使得形成含有DCCD 浓度分别为Omol/L， 0.0001 mol/L, 0.01mol/L的三种反应液，接入到上述反应液的菌体体积 同样为反应液体积的10%的稳定生长期的菌液收集的菌体，经过测定能完全抑制细菌膜上的 F必-ATP酶活性的反应液中DCCD的浓度为0.01mol/L，因此本实施例的测定反应液同实施 例1的测定反应液，测定大肠杆菌DH5a细菌膜内外质子动力(pmf)的测定方法也同于实 施例1的步骤(3)，只是以大肠杆菌DH5a为待测细菌。
本次测定结果如图4所示，pH差值为0.082，而用丫啶橙双波长分光光度法测定pmf为 0.080,该方法与使用丫啶橙双波长分光光度法测定pmf的结果相同，其结果见于图5。
权利要求
1. 一种细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力的测定方法，其特征在于包括以下步骤(a)将待测细菌培养至稳定生长期，收集菌体，去除培养基；(b)配置反应液在M9缓冲液的基础上添加待测细菌所需的单一电子供体和单一电子受体，所述的M9缓冲液是含有5.7mmol/L Na2HPO4·12H2O，3.3mmol/L KH2PO4，18.0mmol/L NH4Cl的水溶液；(c)确定加入反应液中DCCD的用量分别在若干相同体积的(b)步骤配置的反应液中加入不同剂量的二环己基碳二亚胺DCCD，形成若干含有不同浓度DCCD的反应液，使各反应液的DCCD的浓度呈一浓度梯度；在各反应液中分别加入(a)步骤收集的菌体，使各反应液中的菌体浓度相同，在无氧条件下测定各反应液的pH值变化，以pH值出现下降过程最后趋于稳定的反应液的DCCD剂量为测试用量；(d)测定厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力在(b)步骤配置的反应液中加入(c)步骤测定的DCCD一种测试用量，所述的反应液的体积与(c)步骤中一种未加入DCCD的反应液的体积相同，由此形成测定反应液，在该测定反应液中加入(a)步骤的收集的菌体，使得菌体浓度与所加入的该种DCCD测试用量的(c)步骤反应液中的菌体浓度相同，在无氧条件下测定反应液的pH值变化，pH值出现降低过程直至稳定不变，测定的pH变化值即为细菌膜内外质子动力。
2. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于(d)步骤中在反应液中加入的DCCD测试用量是(c)步骤中确定的各DCCD测试用量中的最小剂量。
3. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于在所述的反应液中添加单一碳源，矿质元素和维生素。
4. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤(a)中所述的去除培养基是应用0.8%生理盐水洗涤。
5. 根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于在(c)步骤和(d)步骤中加入到反应液中的所述的菌体量为占反应液体积10%的菌液收集的菌体。
6. 根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于所述的矿质元素的组份及含量为l.Olmmol/LMgS04、 0.5g/LMnSO4、 0.1g/LZnSO4、 O.Olg/L CuS04、 0.01g/LA1K(S04)、 1.0g/LNaCl、0.1 g/L FeCl2、 0.1 g/L CaCl2禾卩CoCl20.1g/L。
7. 根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于所述的维生素的组份及含量为2mg/L生物素、2mg/L叶酸、10mg/L维生素B6、 5 mg/L维生素B2、 5 mg/L维生素B1、 5 mg/L烟 酸、5mg/L泛酸、0.1mg/L维生素B12、 5 mg/L对氨基苯甲酸和5mg/L硫辛酸。
8. 根据权利要求1或3所述的测定方法，其特征在于所述的待测细菌为脱色希瓦氏菌S12， 所述的单一碳源为琥珀酸钠，终浓度为1Ommol/L，所述的单一电子供体为甲酸钠，终浓 度为10 mmol/L，单一电子受体柠檬酸铁，终浓度为lmmol/L或者单一电子受体为觅菜 红，其终浓度为0.1mmol/L。
9. 根据权利要求1或3所述的测定方法，其特征在于所述的待测细菌为大肠杆菌DH5a， 所述的单一碳源为琥珀酸钠，终浓度为10mmol/L，所述的单一电子供体为甲酸钠，终浓 度为10mmol/L，单一电子受体拧檬酸铁，终浓度为lmmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力的测定方法，旨在提供一种快速、准确、适用范围广的测定细菌厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力pmf的方法。本发明的技术方案包括以下步骤将待测细菌培养至稳定生长期，收集菌体，去除培养基；配置反应液；确定加入反应液中DCCD的用量；测定厌氧呼吸过程中细菌膜内外质子动力。本发明用于环境修复和治理中。本发明主要用于测定细菌厌氧呼吸过程细菌膜内外质子动力，从而表征细菌厌氧呼吸的产能。
文档编号C12Q1/02GK101475978SQ20091003670
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者孙国萍, 许玫英, 陈杏娟 申请人:广东省微生物研究所