专利名称：检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以荧 光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中WTl基因mRNA表达的试剂盒。
背景技术：
WT1在正常成人体内只局限于在肾小球细胞，造血干细胞等中表达。当其与转录因 子如p53或EGR-1等相互作用时，会表现出致癌基因的特性。HL60和K562细胞株强烈表达 WT1，而且WT1的反向寡核苷酸通过致K562和匪6细胞凋亡，使表达WT1的癌细胞株(K562， HEL，THP-1等)被抑制，但WT1的反向寡核苷酸对不表达WT1的细胞株(U937)则没有任何 作用。 研究发现WT1与多种造血系统恶性疾病有密切的关系。WTl常常在成人及儿童急 性白血病(AL)，慢性白血病(CL)，脊髓发育不良症(MDS)中过度表达。临床研究指出高表 达量的WT1与成人及儿童急性髓性白血病(AML)，儿童的急性淋巴性白血病(ALL)，和MDS 的预后不良往往是有联系的——WTl基因表达量越高，预后越差。而且越来越多的研究认 为该基因参与了人类白血病的致病过程。 年龄和治疗前的染色体核型是目前公认的影响AML预后的重要因素。50% 60% 的成人原发AML患者的治疗前骨髓中可检出获得性染色体异常(10X 20X为复杂核型)， 而40% 50%的患者未能发现异常。被纳入中危组的正常核型AML是细胞遗传学分类中 人数最多的一个亚型，但该组的长期生存率只有40%。非常有必要寻找一种特异的分子标 记去评价预后，预示复发，从而对患者加强治疗，改善其生存质量及延长生存期。而WTl基 因的检测提供了 一个很好的选择。 总而言之，WT1基因在各类白血病患者中均有不同程度的表达，因而WTl基因可作 为一种广谱的白血病标志物用于判断疗效、预后及微小残留病(MRD)监测。特别是作为染 色体核型正常的AML患者理想的MRD检测指标。对目前检测WTl基因mRNA表达的方法主 要为实时荧光定量PCR技术。 实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与 传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定 量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。
实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种 带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每 个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧 光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct) 的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DNA扩增与检测过程融合 为一体动态检测DNA扩增的全过程，省掉了 PCR后处理过程大大縮短了结果分析时间，使得 该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污 染和由此的造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。 TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al. Real-time PCR in virology. . Nucleic Acids Res. 20025 ;30(6) :1292-1305 ;Lie， Y. S. ， Petropoulos， C.J.， Advances in quantitativePCR technology :5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9，43_48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端 分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能 量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分 子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移 效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现 线性增强。 美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂 盒，如用于HIV-1、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国 目前也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1和SARS等的实时荧光PCR检测试剂 盒的生产和临床应用。在欧盟，一些基于实时荧光PCR检测白血病融合基因的一些检测试 剂盒已经通过CE认证。因此，开发一种能够检测WT1基因mRNA的实时荧光PCR试剂盒，对 相关白血病诊断，治疗检测和预后具有重要意义。 众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特 定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性， 一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和 寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基 础上，开发相应的试剂盒应用于WT1基因所有已知剪切异构体的基因组多核苷酸的检测和 定量分析，成功地完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测白血病临床样品 中WT1基因mRNA的试剂盒。 为了实现本发明，我们采用了以下技术方案 1)使用适当的核酸分析软件对已知的WT1基因型核苷酸序列进行同源性比较并 找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer E邓ress 2)选择 并计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于WT1基因外显子的序 列，而且与其他基因表达mRNA的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切 酶，所以避免了 WTlmRNA检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。
2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析 法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5'端标 记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3'端标记借助活性连接臂偶 联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，可使 用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探 针。 3)从得自受试者的外周血或者骨髓中提取RNA，然后使用逆转录反应体系将所提取的RNA转化成CDNA并将此逆转录产物用于继后的PCR扩增。 4)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c) 2_脱氧核苷三磷酸(dNTPs) 的扩增反应体系，以及包括(d)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引 物，(e)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(f)能够与双链 靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核 苷酸探针的荧光检测体系。通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；退火后 使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产生荧光信号；检测并确定荧光发生 基团所产生的荧光量；分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测靶多核苷酸的存 在。 基于以上技术方案发明的试剂盒包括(l)分别装有RNA提取液、逆转录反应体 系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水(DEPC H^)、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考 品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液包括能够与cDNA双链靶多 核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物、 能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷 酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，特征在于所使用的引物序列分别为5'-CCAGCTCAGTGAAATGGACAGA-3' (SEQ ID N0:l)、5' -GATGGGCGTTGTGTGGTTATC-3' (SEQ ID NO :2)，寡核苷酸探针序列为5'-CAGAGCAACCACAGCACAGGGTACGA-3' (SEQ ID NO :3)。其中 SEQ ID NO :1， SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :3匹配在一起可以检测由WT1基因mRNA逆转录成 的cDNA。 根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别 为5，-AGCACAGGGTACGAGAGCGATA-3， (SEQ ID NO :4)、5' -CGTGCGTGTGTATTCTGTATTGG-3' (SEQ ID NO :5)，寡核苷酸探针序列为5'-AACGCCCATCCTCTGCGGAG-3' (SEQ ID NO :6)。其 中SEQ ID NO :4， SEQ ID NO :5， SEQID NO :6匹配在一起可以检测由WT1基因mRNA逆转录 成的cDNA。 根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别 为5，-CGGTGCTTCTGGAAACTACCA-3， (SEQ ID NO :7) ，5，-AGGGCCTGTGAGTCAACTAAAAGTA_3，( SEQ ID NO :8)，寡核苷酸探针序列为5'-CTGGAAGAGTTGGTCTCTGCCCT-3' (SEQ ID NO :9)。 SEQ ID NO :7， SEQ ID NO :8禾P SEQID NO :9匹配在一起可以检测由WT1基因mRNA逆转录成 的cDNA。。 根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别 为5，-TCTACTGTAAGAAGAGCCATAGCTGATC-3' (SEQ ID NO :10) ，5，-CAGCGAAAACGAGCATAAAAA A-3' (SEQ ID NO :11)，寡核苷酸探针序列为5' -TCCCCCTGACCCTTCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 12)。 SEQ ID NO :10， SEQ ID NO :11禾口 SEQ IDNO :12匹配在一起可以由WT1基因mRNA逆转 录成的cDNA。 根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液，特征在于每微升的PCR缓 冲液中加入2单位Taq酶，缓冲液包含10mM Tris-HCl (pH8. 0) 、150mM KCl、5mM MgCl2。
根据本发明的一个优选实施方案，其中逆转录反应体系由逆转录反应缓冲液、 M-MLV酶、dNTPs，逆转录引物和RNA酶抑制剂所组成，特征在于逆转录引物的序列组合为SEQ ID NO:l禾PSEQ ID N0:2，或SEQ ID N0:4禾PSEQ ID N0:5，或SEQ ID N0:7禾PSEQ ID N0:8，或SEQID NO:IO禾PSEQ ID NO :11。 根据本发明的一个优选实施方案，其中逆转录反应体系，特征在于每微升的逆 转录反应缓冲液中加入50单位M-MLV酶和1单位RNA酶抑制剂。缓冲液包含250mM Tris-HCl(pH8. 0)、250mM KCl、20mM MgCl2和50mM DTT。 根据本发明的一个优选实施方案，其中阴性对照样品为去离子水，阳性定量参考 为携带有WT1基因(cDNA)序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的 载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO:l和SEQ ID NO :2， 或SEQ IDN0:4禾PSEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :7禾P SEQ ID NO :8，或SEQ ID NO:IO禾PSEQ ID NO : 11 ，阳性定量参考品浓度分别为1 X 107拷贝/ml 、 1 X 106拷贝/ml 、 1 X 105拷贝/ml 、 1X1()4拷贝/ml。 根据本发明的一个优选实施方案，其中RNA提取液可以为常规自配的RNA提取试 剂或市售的RNA提取试剂盒。 根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品可选自但不局限于白血 病患者的临床样品。 根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的WT1基因包含WT1基因任何一种 已知的剪切异构体。 根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的靶多核苷酸来自WT1基因mRNA。
根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反 应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。 特别值得说明的是，为了确保本发明的WT1基因mRNA检测方法的准确性，我们还 使用携带有WTl基因(CDNA)序列的重组质粒作为DNA阳性定量参考品。借助这些额外标 准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线， 以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量 控制标准。 与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同，实时定量聚合 酶链反应试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量 检测的准确性和精密度。众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增体系中，同时加入引物 和5' 、3'末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭 基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补 结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产 生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光 报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条 DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地 监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。
利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对 数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从 基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多 核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)。具体实现包括(l)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。
图1显示WT1基因的实时荧光PCR线性梯度实验结果。针对浓度为1X1()3拷贝/ml-l X 109拷贝/ml的重组质粒进行实时荧光RT-PCR检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线有明显指数增长期，均可明确判为阳性。 图2显示WT1基因的实时荧光PCR灵敏度实验结果。针对浓度为1 X 103拷贝/ml的重组质粒进行10次重复检测，检测结果显示荧光扩增曲线有明显指数增长期，均可明确判为阳性。 图3显示WT1基因的阳性定量参考品的标准曲线。针对浓度为1.0X104 1.0X107拷贝/ml的阳性定量参考品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为_3. 44，在Y轴截距(Interc印t)为36. 67，相关系数的平方(R2) = 0.9994。
图4显示WT1基因的实时荧光PCR特异性实验结果。针对8例包括再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血等其他非白血病患者样品进行实时荧光RT-PCR检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长，均可明确判为阴性。 图5显示3份白血病患者的样本的检测结果。3个标本的Ct值分别是15. 18、17. 95、22.21，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。
具体实施例方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1 :WT1基因mRNA检测试剂盒及其使用 (1)制备包括下列组成成分的试剂盒RNA提取液(10ml/管)1管、逆转录反应缓冲液(180 y1/管)1管、逆转录酶系(20 iU/管)1管、PCR反应液(400 iU/管)1管、Taq酶(10iil/管)1管、DEPC !120(2000111/管)1管、阳性定量参考品(50 y1/管)2管、阴性对照样品(50iU/管)l管。 (2)标本采集、运送和保存无菌操作取白血病患者全血或者骨髓，上述标本在2—『C条件下保存应不超过72小时；-2(TC可保存1个月；要长期保存的，需分装后储存于-7(TC。如集中检验，标本需在0°C以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
(3)检测步骤和结果分析
—、RNA提取 1.取3-5ml全血或骨髓，分离提取有核细胞，重悬细胞后，置于灭菌的1. 5ml离心管，加入lml Trizol，充分混匀，再加入200 y 1氯仿，剧烈振荡混匀，4°C ， 12， 000rpm离心15分钟，小心吸取上清； 2.加入500 ii 1异丙醇，充分混匀，4°C ， 12， 000rpm离心15分钟，小心去除上清;
3.加入DEPC水配制的75%乙醇500 y 1充分混匀，1， 000rpm离心5分钟，小心去
7除上清； 4.打开管盖，65。C干燥10分钟，加入30 ii 1 DEPC处理过的水溶解RNA，存于_70°C备用。 二、逆转录 1.取l-2ii g(xiil)RNA加入到(18_x) ii 1逆转录反应缓冲液混匀，再加逆转录酶系2iU，振荡混匀； 2. 37。C放置60分钟，95"C加热3分钟。8000rpm离心1分钟，待用。
三、PCR扩增ABI Prism 7300操作(PE GeneAmp 5700、 ABI Prism 7000、 DA7600、 Line Gene、
iCycler等市售的荧光定量PCR仪可参照此操作，具体仪器操作见各仪器的使用说明书) 1.试剂准备按比例(WT1反应液47 ii 1/人份+Taq酶1 iU/人份)取相应量的
PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按48 y 1/管分装至0. 2ml离心管中，备用。 2.加样向准备好试剂的0.2ml离心管中，加入逆转录后的样品(包括标本、阴性
对照样品、阳性定量参考品)上清液2 iU， 8， OOOrpm瞬时离心，放入仪器样品槽。 3.编辑 3. 1按对应顺序设置阴性对照样品、阳性定量参考品以及未知标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，选择探针模式设置，R印orter Dye :FAM，QuencherDye :TAMRA， Passive Reference :NONE， Data Collection :55。C 45second。(注意使用ABI Prism 7000时探针模式设置，R印orter Dye :FAM， Quencher Dye :TAMRA，PassiveReference :NONE) 3. 2打开instrument窗口设置循环条件
93 °C 2分钟， 93 °C 45秒一55 °C 60秒一10个循环，
93 °C 30秒一55 °C 45秒一30个循环。
保存文件，运行。
4.结果分析 4. 1反应结束后保存检测数据文件。 4.2分析条件设置根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1 10、stop值可以在5 20、 Value值可以在0. 01 0. 2范围选择)，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于_0. 97 _1. 0 (参见附图3所示)。在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。 4. 3到Tray窗口 ，记录未知标本数值(C) 。 "C"表示样品的浓度或含量。4.楊I Prism 7300 (PE GeneAmp 5700、 ABI Prism 7000、 DA7600、 Line Gene、
iCycler等参照此方法判定结果) 1)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值二 30，则判样品的WTl基因cDNA总含量小于检测极限。 2)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈30，则按以下方法判断 若样品的C < 1. 00E+003,则判样品WT1基因cDNA总含量< 1. OX 103拷贝/ml ;
若样品的1. 00E+003《C《1. 00E+008,则判样品WT1基因cDNA总含量=C拷贝/ml ; 若样品的C > 1. 00E+008，则样品WT1基因cDNA总含量> 1. OX 108拷贝/ml。如
果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
实施例2 :WT1基因mRNA检测试剂盒的灵敏度和特异性实验 1)灵敏度实验将浓度为1 X 101Q拷贝/ml的携带有WT1基因(cDNA)序列的重组质粒，10倍梯度稀释成1X1()9拷贝/ml、lXl()8拷贝/ml、lXl()7拷贝/ml、lXl()6拷贝/ml、1X105拷贝/ml、lXl(^拷贝/ml、lX103拷贝/ml作为待检样本，使用本试剂盒进行检测，结果如附图l所示。对浓度为1X103拷贝/ml的样本进行IO次重复检测，结果均为阳性，如附图2所示。检测结果表明，本试剂盒的灵敏度可以达到IX 103拷贝/ml。
2)特异性实验选取8例包括再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血等其他非白血病患者样品作为待检样本，使用本试剂盒进行检测，结果如附图4所示。检测结果表明，本试剂盒对非白血病患者的样本检测均为阴性，试剂盒的特异性很好。
实施例3 :应用WT1基因mRNA检测试剂盒定量检测临床样品 选取3份白血病患者的样本作为待检样本，并以阳性定量参考品作为定量标准，使用本试剂盒进行检测，PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Stdcurve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值> 0. 97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图5所示3个临床标本扩增曲线的Ct值分别是15. 18、17. 95、22.21，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次试验中阳性定量参考品的标准曲线(如附图3所示)可以判定3个临床阳性标本的浓度分别为1.77X1Q6拷贝/m1、2. 77乂105拷贝/ml、l. 60X 104拷贝/ml。序列表〈110〉中由大学达安基因股份有限公司〈120〉检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒〈140〉〈141〉〈160>12〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。〈400>1CC3gCtC3gtg3朋tgg3C3g3〈210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>2 gatgggcgttgtgtggttatc 〈210>3 〈211>26 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈400>3 c3g3gc朋cc3C3gc3C3gggtecg3 〈210>4 〈211>22 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>4 3gc3C3gggtecg3g3gcgate 〈210>5 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>5 cgtgcgtgtgtattctgtattgg 〈210>6 〈211>20 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈400>6 aacgcccatcctctgcggag 〈210>7 〈211>21 〈212>DNA
〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>7 cggtgcttctggaaactacca 〈210>8 〈211>25 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>8 3gggcctgtg3gtc朋cte朋3gte 〈210>9 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈400>9 ctggaagagttggtctctgccct 〈210>10 〈211>28 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>10 tctactgtaagaagagccatagctgatc 〈210>11 〈211>22 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400〉 11 C3gcg朋33cg3gc3te朋333 〈210>12 〈211>20
11
〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400>12 tccccctgacccttcccttc
权利要求
一种检测样品中WT1基因mRNA的试剂盒，试剂盒包括(1)分别装有RNA提取液、逆转录反应体系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括正向引物、反向引物、两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，其特征在于所使用的正反向引物的序列分别为5’-CCAGCTCAGTGAAATGGACAGA-3’、5′-GATGGGCGTTGTGTGGTTATC-3′，寡核苷酸探针的序列为5’-CAGAGCAACCACAGCACAGGGTACGA-3’。
2. 根据权利要求1的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列 还可以为5' -AGCACAGGGTACGAGAGCGATA-3'、 5' -CGTGCGTGTGTATTCTGTATTGG-3'，寡核苷 酸探针的序列还可以为5' -AACGCCCATCCTCTGCGGAG-3'。
3. 根据权利要求l的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列 还可以为5' -CGGTGCTTCTGGAAACTACCA-3' 、 5' -AGGGCCTGTGAGTCAACTAAAAGTA-3'，寡核苷酸 探针的序列还可以为5' -CTGGAAGAGTTGGTCTCTGCCCT-3'。
4. 根据权利要求l的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列 还可以为5 ， -TCTACTGTAAGAAGAGCCATAGCTGATC-3 ， 、 5 ， -CAGCGAAAACGAGCATAAAAAA-3 ，，寡核 苷酸探针的序列还可以为5， -TCCCCCTGACCCTTCCCTTC-3'。
5. 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR缓冲液包含10mM Tris-HCl (pH8. 0)、 150mMKCl、5mM MgCl2，每微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶。
6. 根据权利要求1的试剂盒，其中逆转录反应体系由逆转录反应缓冲液、M-MLV酶、 dNTPs，逆转录引物和RNA酶抑制剂所组成，其特征在于逆转录引物的序列组合为SEQ ID N0:1禾PSEQ ID NO :2，或SEQ ID NO :4禾P SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :7禾P SEQ ID NO :8， 或SEQ ID NO :10禾P SEQ ID NO :11。
7. 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于逆转录反应体系中的逆转录反应缓冲液包 含250mM Tris-HCl (pH8.0)、250mM KCl、20mM MgCl2和50mM DTT，每微升的逆转录反应缓冲 液加入50单位M-MLV酶和1单位RNA酶抑制剂。
8. 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阳性定量参考品为携带有WT1基因cDNA序 列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用 的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO :4和SEQID NO :5，或SEQ ID NO :7禾P SEQ ID NO :8，或SEQ ID NO:IO禾PSEQ ID NO :11。
9. 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反 应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。
全文摘要
本发明涉及检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中WT1基因mRNA表达的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对全血或骨髓样品中的WT1基因mRNA的检测和定量分析，对相关白血病诊断，治疗检测和预后具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK101781677SQ20091003666
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者李明, 陈华云, 陈嘉昌 申请人:中山大学达安基因股份有限公司