专利名称：检测融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合 酶链反应技术检测临床样品中融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒。
背景技术：
融合基因Bcl2-IgH是t(14:18) (q32:q21)染色体易位产物，其引发位于18号染 色体q21区的Bcl2原癌基因并置到IgH序列14q32上，见于非霍奇金淋巴瘤(NHL) 。 Bcl2 基因全长230kb，包含三个外显子，60% -70%的重排发生于Bcl2基因序列第三个外显子3' 端150bp的非翻译区，称主要断裂点决定区(Major breakpoint region, MBR) ;20% -30% 发生于Bcl2基因序列第三个外显子3'端25kb处，称次要断裂点决定区(Minor cluster region，MCR)。其余的断裂点散在分布在Bcl2基因序列上。Bcl2-IgH的重排，导致Bcl2-IgH mRNA水平上调。随后IgH增强子序列超越了正常的Bcl2基因调控过程，导致Bcl2基因在 滤泡中心B细胞的高表达，从而抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖，引发肿瘤。在NHL中， 57%未检测到重排，病人亦没有复发，25%在临床复发前检测到重排。14%在骨髓细胞中检 测到重排，骨髓移植后未能再检测到，因而不需要进一步化疗。未检测到重排的病人无病生 存期较检测到者明显增加(P < 0. 00001)，后者比前者的复发危险要大48倍。
NHL的复发仍是主要问题，检测微小残留病灶对于判定治疗效果，预后复发以及制 定进一步治疗方案均有重要价值。Bcl2-IgH基因重排是NHL最重要的分子生物学特征，检 测该基因对NHL的诊断、鉴别诊断及预后具有重要意义。目前检测融合基因Bcl2-IgH重组 的方法主要为实时荧光定量PCR技术。 实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与 传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定 量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。
实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种 带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每 个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧 光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct) 的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DNA扩增与检测过程融合 为一体，动态检测DNA扩增的全过程，省掉了 PCR后处理过程，大大縮短了结果分析时间，使 得该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶 污染和由此的造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐 取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。 TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al. Real-time PCR in virology. . Nucleic Acids Res. 20025 ;30(6) :1292-1305 ;Lie， Y. S. ， Petropoulos， C.J.， Advances in quantitativePCR technology :5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9，43_48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端
3分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能 量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分 子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移 效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现 线性增强。 美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂 盒，如用于HIV-1、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测试剂盒。同样，中国目 的也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒 的生产和临床应用。在欧盟，一些基于实时荧光PCR检测融合基因的检测试剂盒已经通过 CE认证。因此，开发一种能够检测融合基因Bcl2-IgH重排的实时荧光PCR试剂盒，对NHL 的诊断，治疗检测和预后具有重要意义。 众所周知，在使用已知的实时荧光PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶 核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个 关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核 苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础 上，开发相应的试剂盒应用于融合基因Bcl2-IgH的基因组多核苷酸的检测和定量分析，成 功地完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中
Bcl2-IgH融合基因重排的试剂盒。 为了实现本发明，我们采用了以下技术方案 1)使用适当的核酸分析软件对已知的Bcl2-IgH融合基因核苷酸序列进行同源性 比较并找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer E邓ress 2)选择并计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于Bcl2-IgH融合 基因外显子的序列，而且与其他融合基因表达mRNA的核苷酸序列没有同源性，也不包括任 何常见的核酸内切酶，所以大大减少甚至避免了Bcl2-IgH检测的假阴性和假阳性，提高了 检测的可靠性和准确度。 2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析 法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5'端标 记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3'端标记借助活性连接臂偶 联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，可使 用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探 针。 3)从得自受试者的外周血、骨髓或组织中提取DNA，然后使用DNA用于继后的PCR 扩增。 4)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c) 2_脱氧核苷三磷酸(dNTPs) 的扩增反应体系，以及包括(d)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引 物，(e)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(f)能够与双链
4靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核 苷酸探针的荧光检测体系。通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；退火后 使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产生荧光信号；检测并确定荧光发生 基团所产生的荧光量；分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测靶多核苷酸的存 在。 基于以上技术方案发明的试剂盒包括(l)分别装有DNA提取液、经焦碳酸乙二酯 处理的纯水(DEPC H20)、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考品并加盖密封的多 个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。 根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液包括能够与双链靶多核 苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物、能 够与靶多核背酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷 酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，特征在于所使用的引物序列分别为 5， -GCTTTACGTGGCCTGTTTCA-3' (SEQ ID N0:1)禾P5' -CCTGGCTTCCTT CCCTCTGT—3' (SEQ ID NO :2)，寡核苷酸探针序列为5' -ACCTGAGGAGACGGTGACC-3' (SEQ ID NO :3)。其中SEQ ID NO :1， SEQID NO :2， SEQ ID NO :3匹配在一起可以检测融合基因Bcl2_IgH的重排。
根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列 分另U为5' -TTAGAGAGTTGCTTTACGTG-3' (SEQ ID NO :4)、5 ' -ACCTGAGGAGACGGTGACCA GGGT-3' (SEQ ID NO :5)，寡核苷酸探针序列为5'-AGGGCTCTGGGTGGGTCTGTGTTG-3' (SEQ ID NO :6)。其中SEQ ID NO :4， SEQ ID NO :5， SEQ ID NO :6匹配在一起可以检测融合基因 Bcl2-IgH的重排。 根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别 为5' -CAACACAGACCCACCCAGAG-3' (SEQ ID NO :7) ， 5，-AGTTGCTTTACGTGGCCT-3' (SEQ ID NO :8)，寡核苷酸探针序列为5' -AGGGCTCTGGGTGGGTCTGTGTTG-3' (SEQ ID NO. 9) 。 SEQ ID NO :7， SEQ IDNO :8和SEQ ID NO :9匹配在一起可以检测融合基因Bcl2-IgH的重排。
根据本发明的一个优选实施方案，每微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶，缓冲 液包含10mM Tris-HCl(pH8. 0)、150mM KCl、5mM MgCl2。 根据本发明的一个优选实施方案，其中阴性对照样品为去离子水，阳性定量参考 品为携带有BCL2-IgH序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体 克隆构建而成，所使用的上下游引物的组合可以是SEQ ID NO:l和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO :4和SEQ ID N0:5，或SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，阳性定量参考品浓度分别为1 X 107 拷贝/ml、lXl()6拷贝/ml、lXl()5拷贝/ml、lXl()4拷贝/ml。 根据本发明的一个优选实施方案，其中DNA提取液可以为常规自配的DNA提取试 剂(包括Chelex、 NaOH等)或市售的DNA提取试剂盒(如Qiagen DNA提取试剂盒)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是白血病患者的临床样
PI
PR o 根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的Bcl2-IgH融合基因是选自Bcl2 基因和IgH基因融合的主要断裂区。 根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反 应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。
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特别值得说明的是，为了确保本发明的融合基因Bcl2-IgH检测方法的准确性，我 们还使用了根据Bcl2-IgH融合基因DNA序列合成的双链DNA作为阳性定量参考品。借助 这些额外定量参考品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标 定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试 剂盒附加的质量控制标准。 与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同，实时定量聚合 酶链反应试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量 检测的准确性和精密度。众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增体系中，同时加入引物 和5' 、3'末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭 基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补 结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产 生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光 报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条 DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地 监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。
利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对 数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从 基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多 核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极 好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒 定的)。也就是说，基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)。具体 实现包括(l)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值 时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知 量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。
图1显示Bcl2-IgH融合基因MBR的实时荧光PCR线性梯度实验结果。针对浓度 为1X103拷贝/ml-lXl(T拷贝/ml的重组质粒进行实时荧光PCR检测分析，检测结果显 示荧光扩增曲线有明显指数增长期，均可明确判为阳性。 图2显示Bcl2-IgH融合基因MBR的实时荧光PCR灵敏度实验结果。针对浓度为 1 X 103拷贝/ml的重组质粒进行10次重复检测，检测结果显示荧光扩增曲线有明显指数增 长期，均可明确判为阳性。 图3显示Bcl2-IgH融合基因MBR的阳性定量参考品的标准曲线。针对浓度为 1. OX 104 1. OX 107拷贝/ml的阳性定量参考品进行实时荧光PCR检测分析，绘制得到的 标准曲线斜率(Slope)为-3. 37，在Y轴截距(Interc印t)为34. 72，相关系数的平方(R2) =0.9997。 图4显示Bcl2-IgH融合基因MBR的实时荧光PCR特异性实验结果。针对8例包括 急性髓性白血病、急性淋巴性白血病等不是非霍奇金淋巴瘤的患者样本进行实时荧光PCR 检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长，均可明确判为阴性。
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图5显示3份非霍奇金淋巴瘤患者的样本的检测结果。3个标本的Ct值分别是 17. 78、20. 02、22. 59，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。
具体实施例方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 实施例1 :融合基因Bel2-1 gH重排检测试剂盒及其使用 (1)制备包括下列组成成分的试剂盒红细胞裂解液(40ml/瓶)、DNA提取液
(10ml/管)1管、PCR反应液(400 ii 1/管)1管、Taq酶(10ii 1/管)1管、DEPC H20(2000ii 1/
管)1管、阳性定量参考品(50 iU/管)4管、阴性对照样品(50 iU/管)1管。 (2)标本采集、运送和保存无菌操作取非霍奇金淋巴瘤患者全血、骨髓或组织，
标本在2-『C条件下保存应不超过72小时；-2(TC可保存1个月；要长期保存的，需分装后
储存于_70°C 。如集中检验，标本需在0°C以下环境中运送并于24小时内送达实验室。 (3)检测步骤和结果分析 —、DNA提取 A.标本为全血或骨髓 1.取lml全血或100ul的骨髓，分离提取有核细胞，重悬细胞后，置于灭菌的 1. 5ml离心管，加入lml红细胞裂解液，充分混匀。室温静置3min，6000rpm，离心3min。去 除上清，留沉淀。 2.再次重复上次步骤2次。获得白细胞沉淀。 3.加入50 iil的DNA提取液，剧烈震荡混匀。IO(TC孵育10min。 4. 12000rpm离心5min，取上清备用。 B.标本为组织 1.将其充分破碎匀浆，然后取10mg。 2.加入50 iil的DNA提取液，剧烈震荡混匀。IO(TC孵育10min。
3. 12000rpm离心5min，取上清备用。
二、PCR扩增ABI Prism 7300操作(PE GeneAmp 5700、 ABI Prism 7000、 DA7600、 Line Gene、 iCycler等市售的荧光定量PCR仪可参照此操作，具体仪器操作见各仪器的使用说明书)
1.试剂准备按比例(Bcl2-IgH PCR反应液47 ii 1/人份+Taq酶1 yl/人份)取 相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按48 y 1/管分装至0. 2ml离心管中，备用。
2.加样向准备好试剂的0. 2ml离心管中，加入样品(包括标本、阴性对照样品、 阳性定量参考品)上清液2 iU，8， OOOrpm瞬时离心，放入仪器样品槽。
3.编辑 3. 1按对应顺序设置阴性对照样品、阳性定量参考品以及未知标本，并在Name 栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，选择探针模式设置，R印orter Dye :FAM， QuencherDye :TAMRA， Passive Reference :NONE， Data Collection :55。C 45second。(注 意使用ABI Prism 7000时探针模式设置，R印orter Dye :FAM， Quencher Dye :TAMRA， PassiveReference :NONE) 3. 2打开instrument窗口设置循环条件
93 °C 2分钟， 93 °C 45秒一55 °C 60秒一10个循环，
93 °C 30秒一55 °C 45秒一30个循环。
保存文件，运行。
4.结果分析 4. 1反应结束后保存检测数据文件。 4.2分析条件设置根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及 Threshold的Value值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1 10、stop值可 以在5 20、 Value值可以在0. 01 0. 2范围选择)，使Std curve窗口下的标准曲线图 达到最佳，即correlation数值介于_0. 97 _1. 0 (参见附图3所示)。在Analysis菜单 下选择Analyze自动分析结果。 4. 3到Tray窗口 ，记录未知标本数值(C) 。 "C"表示样品的浓度或含量。4.楊I Prism 7300 (PE GeneAmp 5700、 ABI Prism 7000、 DA7600、 Line Gene、
iCycler等参照此方法判定结果) 1)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值二 30，则判样品的融合基因DNA总含量小 于检测极限。 2)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈30，则按以下方法判断
若样品的C < 1. 00E+003，则判样品融合基因DNA总含量< 1. OX 103拷贝/ml ;
若样品的1. 00E+003《C《1. 00E+008,则判样品融合基因DNA总含量=C拷贝/ ml ; 若样品的C > 1. 00E+008,则样品融合基因DNA总含量> 1. OX 108拷贝/ml。如
果需要粘确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。 实施例2 :融合基因Bcl2-IgH重排检测试剂盒的灵敏度和特异性实验 1)灵敏度实验将浓度为1X1(T拷贝/ml的携带有BCL2-IgH序列的重组质粒，
IO倍梯度稀释成1X1()9拷贝/ml、lXl()8拷贝/ml、lXl()7拷贝/ml、lXl()6拷贝/ml、lX105
拷贝/ml、lX104考贝/ml、lX103拷贝/ml作为待检样本，使用本试剂盒进行检测，结果如
附图l所示。对浓度为1X103拷贝/ml的样本进行IO次重复检测，结果均为阳性，如附图
2所示。检测结果表明，本试剂盒的灵敏度可以达到1X103拷贝/ml。 2)特异性实验选取8例包括急性髓性白血病、急性淋巴性白血病患者样品作为 待检样本，使用本试剂盒进行检测，结果如附图4所示。检测结果表明，本试剂盒对不是非 霍奇金淋巴瘤的其他肿瘤患者的样本检测均为阴性，试剂盒的特异性很好。
实施例3 :应用融合基因Bcl2-IgH重排检测试剂盒定量检测临床样品
选取3份来自临床非霍奇金淋巴瘤患者的样本作为待检样本，并以阳性定量参考 品作为定量标准，使用本试剂盒进行检测，PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数， 使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值> 0. 97)，然 后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图5所示3个临床标本扩增曲线的Ct值分别 是17. 78、20. 02、22. 59，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次 试验中阳性定量参考品的标准曲线(如附图2所示)可以判定3个临床阳性标本的浓度分 别为1.06X1Q5拷贝/m1、2. 30X1。4拷贝/m1、3. 97乂103拷贝/ml。
序列表 〈110〉中山大学达安基因股份有限公司 〈120〉检测融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒 〈140〉 〈141〉 〈160>9 〈210>1 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设汁，以用作PCR扩增的引物。 〈400〉 1 gctttacgtggcctgtttca 〈210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>2 cctggcttccttccctctgt 〈210>3 〈211>19 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈400>3 acctgaggagacggtgacc 〈210>4 〈211>20 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>4 ttagagagttgctttacgtg 〈210>5
9
〈211>24 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>5 acctgaggagacggtgaccagggt 〈210>6 〈211>24 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈400>6 agggc tctgggtggg tctgtgttg 〈210>7 〈211>20 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>7 caacacagacccacccagag 〈210>8 〈211>18 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 〈400>8 agttgctttacgtggcct 〈210>9 〈211>24 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 〈400>9 agggctctgggtgggtctgtgttg
权利要求
一种检测样品中Bcl2-IgH融合基因重排的试剂盒，试剂盒包括(1)分别装有DNA提取液、经焦碳酸乙二酯处理的纯水、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括正向引物、反向引物、两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，其特征在于所使用的正反向引物的序列分别为5’-GCTTTACGTGGCCTGTTTCA-3’和5′-CCTGGCTTCCTTCCCTCTGT-3’，寡核苷酸探针序列为5’-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3’。
2. 根据权利要求l的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列 还可以为5' -TTAGAGAGTTGCTTTACGTG-3' 、5' -ACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3'，寡核苷酸 探针序列还可以为5' -AGGGCTCTGGGTGGGTCTGTGTTG-3'。
3. 根据权利要求l的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列 还可以为5' -CAACACAGACCCACCCAGAG-3' ， 5' -AGTTGCTTTACGTGGCCT-3'，寡核苷酸探针序列 还可以为5' -AGGGCTCTGGGTGGGTCTGTGTTG-3'。
4. 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR缓冲液包含10mM Tris-HCl (pH8. 0)、 150mMKCl、5mM MgCl2，每微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶。
5. 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于阳性定量参考品为携带有BCL2-IgH序列的 重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上 下游引物的组合可以是SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO :4和SEQ ID N0:5，或 SEQ ID NO :7禾P SEQ ID NO :8。
6. 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反 应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。
全文摘要
本发明涉及检测融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中融合基因Bcl2-IgH重排的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对全血、骨髓或组织样品中的融合基因Bcl2-IgH重排进行检测和定量分析，对非霍奇金淋巴瘤诊断、鉴别诊断及预后具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK101781678SQ20091003666
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者李明, 陈华云, 陈嘉昌 申请人:中山大学达安基因股份有限公司