用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶的制作方法

专利名称：用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种2-萘酸单加氧酶在生物催化制备抗癌药物靛玉 红中的应用，及其经过分子改良的2-萘酸单加氧酶突变体在生物催化制备靛玉红中的应用。
背景技术：
最近研究证实很多疾病，包括癌症、糖尿病、炎症是由于细胞信号传导中蛋白激酶紊 乱引起的，临床药物治疗中，药物作用定位于信号传导的各个靶位点癌症抑制蛋白pRb的C
DK介导的磷酸化是有丝分裂周期G1期中必须的，很多人类癌症就是因为癌症抑制蛋白pRb及 其调节出现了紊乱。因此，环化激酶CDK促进因子成为癌症治疗的有效药物。靛玉红是传统 中药中治疗白血病"龙回丸"中药配方中当归所含的小分子成分，体外实验中对CDK有很明 显的促进作用，在中医中用于治疗急性白血病，对核质变化紊乱引起疾病治疗效果很好，近 年来在美国和日本的临床治疗中发现靛玉红对类风湿性关节炎治疗和几种人类肿瘤细胞的 生长抑制有明显的作用。
美国食品与药品监督局要求制药公司在新药的两种异构体有明显的药效和毒理作用差异 时，必须以光学纯的药品形式上市。目前，靛玉红主要从板蓝根，大青叶等一些植物中药中 提取获得的，但是中药中靛玉红的含量为《mg/g，制品含量低于90%，并且化学提取的步骤 繁琐，成本比较高，药品纯度难以满足市场需求。
近年来，有机化学品的生物催化方法因其对环境友好，在制药和化学工业中需求越来越 大。生物催化化学物质转换已经受到广泛重视，它是替代传统的化学合成有效方法，同时有 利于解决合成过程中出现的难题。有机合成中，生物催化专一性强，反应条件温和。酶的手 性催化有立体和结构域的特异性，其反应速度快、酶的底物范围广；同时，通过酶基因工程，
可以进一步改善酶的稳定性、提高反应底物特异性、甚至改变其映像专一性。采用生物技术 手段，改变酶分子结构，给传统生物催化带来了机遇和挑战。采用生物催化，可以合成复杂
的大分子，同时生产过程对环境友好，天然的酶和改造的酶都可以通过DNA重组技术在适当 的宿主内大量生产，因此，化学合成中酶的应用给化学和制药工业的进步带来了巨大的机会。 本发明申请人在生物基因工程研究中，提出一种制备降解2-萘酸活性的DNA片段的方法 从2-萘酸降解菌伯克霍尔德氏菌(5w狄oWen'a sp. JT1500)菌株中提取总DNA，经限制性内 切酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC18载体并转化大肠杆菌HB101获得含有一段8 050bp长度的，上有2-萘酸单加氧酶基因簇和辅酶A连接酶基因的DNA片段，上述序列已经在CN1618971A公开，并且该专利文件的序列表中的序列l中的第2793-3951位的1158bp的核苷酸 序列为2-萘酸单加氧酶基因，编码的2-萘酸单加氧酶如该份专利文件的序列表的序列2所示。 本发明申请人(2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达，方向平，丘晓颖，岑英华， 孙国萍，微生物学报，第43巻第5期，第599 605页，2003年10月)通过酶切连接将Sw/^2o/A rz'。 sp. JT1500的一段DNA片段(4802bp)亚克隆到载体pUC18上，得到了重组子pEK123， 测序后的pEK123重组子4802bp插入片段的序列已经登陆公开于欧洲EMBL基因库，序列号 为AJ566333，该片段是上述专利文件公开的8050bp中的最前面的4802序列，该序列含有编码 黄素还原酶NmoB和2-萘酸单加氧酶NmoA的碱基序列，其中从重组子pEK123中PCR扩增出的 上述专利公开的I158bp的2-萘酸单加氧酶基因(在EMBL基因库接受号为AJ566333的序列的2 793-3951位)编码的酶是含黄素还原酶的单加氧酶家族(FMO)中的一个新成员，与其他已 登录的单加氧酶基因序列同源性较低，是一个新的单加氧酶，该基因编码的酶能对2-萘酸发 生加氧转化。李小波和岑英华(2 —萘酸单加氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆分析， 李小波，岑英华，孙国萍，微生物学报，第45巻第4期，第557 560页，2005年8月)研究发现 该2-萘酸单加氧酶能够催化吲哚产生靛蓝。

发明内容
本发明人通过对重组子pEK123的DNA片段进一步的研究，发现了另外一个开放阅读框， 该开放阅读框位于pEK123的重组DNA片段上，EMBL基因库中AJ566333序列的2579-3892 位，共1314bp，编码437个氨基酸，并且发现该开放阅读框编码的酶能够催化吲哚产生靛玉 红，证明其是一个具有功能的基因，该开放阅读框与本发明人团队以前发现2-萘酸单加氧酶 基因具有部分重叠序列。
因此本发明的目的是提供了一种能够催化喷哚产生靛玉红的2-萘酸单加氧酶及其编码基 因，还提供了以该2-萘酸单加氧酶为基础衍生的，经过分子改良的、氨基酸序列发生功能性 突变的2—萘酸单加氧酶突变体及其在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。
本发明所述的能够催化吲哚产生靛玉红的2-萘酸单加氧酶的基因序列如SEQ1所示，其 氨基酸如SEQ2所示。
本发明通过以下方案证明2-萘酸单加氧酶能够生物催化吲哚制备抗癌药物靛玉红
(a) 从来自5wr狄oWeha sp.JT1500的2—萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号 为AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123上克隆出2—萘酸单加氧酶基因片段。
(b) 将2—萘酸单加氧酶基因片段与表达载体pET22b(+)连接。
(c) 将连接产物转化到大肠杆菌BL21 (DE3)， IPTG诱导表达。
(d) 细菌超声波破碎后，提取2—萘酸单加氧酶，纯化目标蛋白，纯化后的酶经过验证具有催化B引哚生成抗癌药物靛玉红的能力。
本发明还证明含有2 —萘酸单加氧酶的编码基因，能表达该酶的全细胞具有催化吲哚产 生抗癌药物靛玉红的能力。
本发明以2 —萘酸单加氧酶为基础衍生的，经过分子修饰的，引起氨基酸序列发生功能 性突变的2 —萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉红的能力。
其修饰步骤如下
(a) 从来自Bw狄oWm'flsp.JT1500的2—萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号 为AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123上克隆出2—萘酸单加氧酶基因片段。
(b) 通过易错PCR(error-prone PCR)介导的随机突变和DNA重组技术(DNA shuffling) 等分子改良、筛选获得突变体基因。
(c) 表达2-萘酸单加氧酶突变体基因，该基因编码的2-萘酸单加氧酶突变体能够催化吲 哚产生抗癌药物靛玉红。
所述的修饰的2—萘酸单加氧酶突变体是在第118， 201， 245三个位点中任意和组合位 点的氨基酸序列有功能性突变。
本发明证实以2—萘酸单加氧酶为基础，在201位由Phe突变为Ile，而衍生的经过修 饰的2—萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉红中的能力，命名为2—萘酸 单加氧酶突变体-Phe201Ile，其序列如SEQ3所示。
本发明还证实以2—萘酸单加氧酶为基础，在201位由Phe突变为lie, 245位由Trp 突变为Ser，而衍生的经过修饰的2—萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉 红中的能力，命名为2—萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser，其序列如SEQ4所示。
本发明还证实以2—萘酸单加氧酶为基础，在201位由Phe突变为Ile， 245位由Trp 突变为Sen 118位由Leu突变为Ala，而衍生的经过修饰的2—萘酸单加氧酶突变体具有 生物催化制备抗癌药物靛玉红中的能力，命名为2 —萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser/Leull8Ala，其序列如SEQ5所示。
本发明还证实含有上述含有酶突变体的编码基因，表达酶突变体的全细胞也能生物催 化制备抗癌药物靛玉红。
本发明是通过反相高效液相色谱和光谱扫描测定验证靛玉红的产生。
本发明的2—萘酸单加氧酶能够催化吲哚产生靛玉红，从而为利用2-萘酸单加氧酶进
行靛玉红生物转化，通过2萘酸单加氧酶基因重组大肠杆菌生物催化抗癌药物靛玉红的手
性合成，实现酶法全细胞转化，生产品质优良，纯度高，手性合成效率高抗癌药物靛玉红
提供了途径，生物催化制备具有反应条件温和，转化率高等优点，大大降低了靛玉红的生产成本。该2 —萘酸单加氧酶催化效率(Kcat/Km值)为238M"S—1，本发明还通过易错PCR 和DNAshuffling技术制备了 2-萘酸单加氧酶突变体基因，该突变体基闵编码的2-萘酸单加 氧酶突变体能够催化喷哚产生靛玉红所述的2 —萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile，酶催化 效率(Kcat/Km值)为777M"S";所述的2 —萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser， 酶催化效率(Kcat/Km值)为819 (M"S—";所述的2 —萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser /Leull8Ala，酶催化效率(Kcat/Km值)为909M"S"，由此可见本发 明构建的2—萘酸单加氧酶突变体不但具有催化吲哚产生靛玉红的能力，而且其产率也比野 生型的提高了2-4倍。
表12 —萘酸单加氧酶催化(1引哚产生靛玉红反应动力学参数
蛋白酶《cat/《m(M-'S-1)
2-萘酸单加氧酶238
2—萘酸单加氧酶突变体-Phe201 lie777
2—萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser819
2—萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser/Leull8Ala909


图1是蛋白的SDS-PAGE图谱，其中CK:转入空载体p ET22b(+)的大肠杆菌￡ BL21 (DE3)， T:重组pET22b(+)-nmoA大肠杆菌五co/!'TOP10， B:重组p ET22b(+)-nmoA大肠 杆菌五co/ZBL21(DE3)，其中1 ， 2， 3代表不同的克隆子，M: Marker蛋白质分子量标准KDa， Nmo:纯化的2-萘酸单加氧酶；
图2是靛玉红标样的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；
图3是靛玉红标样的光谱扫描图4是靛蓝标样的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；
图5是靛蓝标样的光谱扫描图6是提纯的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱； 图7是提纯的2-萘酸单加氧酶催化B引哚后的氯仿提取物的光谱扫描图8是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱 RP-HPLC图谱；
图9是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫描图； 图10是PCR产物的电泳图，其中1, 2: 2-萘酸单加氧酶基因簇重组子pEK123; 3， 4: PCR1 (error-prone PCR)的产物；5， 6， 7， 8: PCR1 (error-prone PCR)产物经DNAaseI酶切后 的产物；9-14: PCR2 (自身引物PCR)的产物；M: DNAMarker (DL3000);
6图11是PCR产物的电泳图，其中1-3: p ET22b(+)-nmoA*， 4-9: PCR3产物nmoA、 M: DNA Marker (DL3000);
图12是野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶催化吲哚的上清液提取物光 谱扫描图13是突变型pET22b(+)-nmoA-重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化吲哚的上清液提 取物光谱扫描图14是可见光分光光度光谱分析图，其中1:色氨酸(底物)，2:吲哚(底物)，3:吲哚
满二酮(中间体)；4:野生型pET22b(+)-nmoA重组的大肠杆菌催化吲哚后的发酵液萃取产 物；5:靛玉红标样(2， 3'-羟基吲哚)；6:突变型pET22b(+)-nmoA+重组的大肠杆菌催化吲 哚后的发酵液萃取产物；7:靛蓝标样(2， 2'-羟基吲哚)；
图15是蛋白SDS-PAGE电泳图，其中B是没有转入载体的大肠杆菌BL21 (DE3)， B-22是 带有空载体pET (22b+)的大肠杆菌BL21 (DE3)， Bm是转入载体pET22b(+)-nmoA* (突变 体)的大肠杆菌BL21 (DE3), Bw是转入载体pET22b(+)-nmoA (野生型)的大肠杆菌BL21 (DE3); M:蛋白Marker;
具体实施例方式
实施例l
(1)克隆2—萘酸单加氧酶基因。
以从来自Sw狄oWen'a sp.JT1500的2—萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号为 AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123为模板，PCR扩增2—萘酸单加氧酶基因簇中2— 萘酸单加氧酶nmoA片段。
根据EMBL基因库中接受号为AJ566333的序列，设计引物扩增该序列的2579-3892位 的碱基，共1314bp，由于本发明需要利用His-tag标记的表达载体pET22b(+)，融合表达目的 蛋白，因此去掉了该基因的TAA终止子，即扩增了该序列的2579-3889位的碱基，共1311bp。
其引物序列为
引物上游引物AF5>TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG<3引入酶切位点NdeI
下游引物AR5>CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG〈3弓|入酶切位点HindIII 反应体系
10xbuffer 10^1;
10nMdNTP 2^1;
PfUTaq 2^1;
10nMAF 2^1;10nMAR 2^1; 模板DNA 2^1;
超纯水 80pl;
反应的酶为上海生工Pfu DNA Polymerase ( B0093) PCR扩增条件95。C变性5分钟(min)后；在95。Clmin， 57。Clmin， 72。C2min;经过 30个循环，然后72。C延伸10min， 12。C终止反应。
(2) 2—萘酸单加氧酶基因nmoA与pET22b(+)连接 扩增的PCR产物2—萘酸单加氧酶基因nmoA，用上海生工UN1Q-10柱式DNA胶回收
试剂盒(SK1131)回收1311bp大小片段(经克隆、测序分析，其序列位于AJ566333序列的 2579-3889位即SEQ1中的1-1311位，由于需要利用His-tag标记的表达载体pET22b(+)，融 合表达目的蛋白，因此去掉了该基因的TAA终止子)，然后采用NdeI和HindIII双酶切后， 与经过同样酶切后的线性质粒p ET22b(+)连接酶切体系5(^1:载体pET22b(+)或目标基因 證oA各10n1(0.1——l吗)，分别加NdeI和Hindin(10U4il)lp1,， 10xbuffer 5^1,超纯水补足 至50^1, 37°C 2—8小时双酶切。连接体系20^1:酶切产物pET22b(+)/Ndel+Hind111, nmoA/Ndel+HindlII各5nl等摩尔混合，T4DNA连接酶(lswiss/pl) l-2pl， 10x连接buffer2^1， 超纯水补充至20pl。 16°C，连接1…12小时。
(3) 连接产物转化到大肠杆菌￡ >//81^1 (DE3) 连接产物转化大肠杆菌￡ //8!^1 (DE3)感受态细胞(如果效率低可以采用大肠杆菌
TOP10预先转化，阳性克隆连接载体再转化E co/z' BL21 (DE3)感受态细胞)，涂布到涂有 IPTG与X-gal的的氨苄(lOOpgAml) LB琼脂平板上，37。C过夜培养。
(4) 阳性克隆筛选
从上述过夜培养的平板上挑取白色的克隆，并转接到lml含100pg/ml氨苄LB液体培 养液的96微孔板中培养24小时，离心取兰色菌体细胞，用DMF (二甲基甲酰胺)萃取兰色 物质，在610nm与540nm处测定其光吸收值，筛选出540nm处光吸收值高的重组大肠杆菌 克隆。
(5) 2—萘酸单加氧酶纯化
挑取540nm光吸收值高的重组大肠杆菌单克隆接种到5ml含100pg/ml氨苄LB液体培养 液，37'C过夜培养；然后扩大接种到100ml含100ng/ml氨苄LB液体培养液中，接种量 0.5%~5%，培养基pH6.0 8.5，摇床转速为80-200转/分钟(卬m)， 37°C，当0060()达到0.5~0.7 时加入IPTG (终浓度0.5 1.0pM) 28-C低温诱导，继续培养24~48小时，培养液以 3000 12000rpm， 4。C离心，去除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，在冰浴条件下超声波破菌(或高压)5分钟，再用8000 12000rpm， 4。C离心 5~15分钟，得到含有2-萘酸单加氧酶的细胞破碎液。
经过大肠杆菌诱导表达的2-萘酸单加氧酶的细胞破碎液，采用TOYOBO公司的NPK7 蛋白纯化试剂盒纯化NPK7蛋白纯化试剂盒MagExtractor-His-tag是主要用于纯化大肠杆菌 中进行表达的His-tag融合蛋白质的试剂盒。添附的磁珠是与镍螯合的琼脂糖磁珠，与His-tag 的选择性结合能力非常出色，能够从菌体破碎液中直接纯化His-tag融合蛋白质。
使用组氨酸tag (His-tag)进行纯化的方法，是利用了在组氨酸侧链位置处的唑环和金属 离子(Ni2+等)相螯合的性质，可以使由基因重组技术制备的His-tag蛋白质的纯化效率大大 提高。研究中，我们采用pET22b(+)为载体诱导表达2-萘酸单加氧酶，经过表达的2-萘酸单 加氧酶与载体pET22b(+)中组氨酸tag (His-tag)融合，融合蛋白纯化步骤参照TOYOBO公 司的NPK7蛋白纯化试剂盒说明书。
经过诱导表达的pET22b(+)-nmoA，其体内蛋白及体外纯化蛋白SDS-PAGE的图谱见图1 ， 由图l可以看出CK即为转入空载体pET22b(+)的大肠杆菌未表达2-萘酸单加氧酶，而转入 pET22b(+)-nmoA的大肠杆菌表达了2-萘酸单加氧酶，经过提纯得到蛋白经过SDS-PAGE验证其 大小合适，可以推断纯化的蛋白为2-萘酸单加氧酶。 (6) 2-萘酸单加氧酶催化吲哚产生靛玉红。
纯化后2—萘酸单加氧酶(浓度2mg/ml) lml，加入25(^1的浓度为100nM吲哚溶液， 37'C温浴6小时，10ml氯仿提取色素，热浴蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物，将提取物经过 反相高效液相色谱和光谱扫描分析测定。
本次测定的标样靛蓝与靛玉红由中国生物药品制品研究所提供，检测方法是反相高效液 相色谱和光谱扫描分析。
光谱扫描分析测定是参照中国药典2005年版的测定方法。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)的条件及参考文献如下
RP國HPLC采用Hyperclone C18柱，以0.1%H3PO4 :甲醇(30 : 70)为流动相，流速0.9 ml/min，检测波长292nm，检测温度为30。C，仪器岛津LC-20A型高效液相色谱仪。 参考文献
(刘晓芳，程弘.板蓝根质量检测应增加靛玉红、靛蓝检验项目[J ].中国药品标
准,2002年3月第二巻32-33:
王燕桓，刘国瑞等.RP-HPLC法测定板蓝根浸膏中靛蓝、靛玉红的含量.河北大学学报
(自然科学版)2005年9月第25巻第5期507—509;
李莉，曹贺.反相高效液相色谱法测定锡类散中靛蓝及靛玉红的含量.时珍国医国
9药.2006年第17巻第5期 725—726。)
本次测定的图2是靛玉红标样RP-HPLC的图谱，图3是靛玉红标样的光谱扫描图谱，图 4是靛蓝标样的RP-HPLC的图谱，图5是靛蓝标样的光谱扫描图谱，图6是提纯的2-萘酸单 加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；图7是提纯的2-萘酸 单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫描图；由图6与图2， 4，图7与图3， 5比较可 知，图6和图7存在靛玉红的保留时间一致，在同一个位置出现的吸收峰，因此可以证明纯 化的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物含有靛玉红，从而证明2 —萘酸单加氧酶能催 化产生靛玉红。
以标样靛玉红(中国药品生物制品检定所提供)做浓度和光吸收的标准曲线，测定 OD54onm处吸收，计算野生型的pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶，该2-萘 酸单加氧酶催化效率(Kcat/Km值)为238M"S—1
(7)含有2—萘酸单加氧酶的全细胞催化吲哚产生靛玉红。
挑取540nm光吸收值高的重组pET22b(+)-nmoA大肠杆菌E coli BL21 DE3单克隆接种 到5ml含100pg/ml氨苄LB液体培养液，37。C过夜培养；而后接种到100ml含lOO^ig/ml氨苄 LB液体培养液中，接种量0.5%~5%，培养基pH6.0 8.5，摇床转速为80~200转/分钟(rpm)， 37。C培养当OD600达到0.5~0.7时加入IPTG (终浓度0.5~1.0pM) 28。C低温诱导，继续培 养24 48小时，培养液以3000 12000卬m， 4。C离心，去除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮 于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，以3000-12000rpm， 4。C离心，去除上清夜，菌体 细胞加入1000^1的浓度为100nM吲哚溶液，37'C温浴6小时，用8000 12000rpm， 4'C离心 5~15分钟，得到含有2-萘酸单加氧酶的细胞，10ml氯仿萃取色素，真空旋转，蒸干溶剂， 得到紫红色的粉状物，经过反相高效液相色谱分析测定和光谱扫描测定。以未转入载体的大 肠杆菌￡<;0//81^1 (DE3)和转入空载体pET22b(+)的大肠杆菌EcoliBL21DE3作为对照。 图8是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱 RP-HPLC图谱；图9是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫 描图；图8与图2， 4，图9与图3， 5比较可知，图8，图9存在与标样靛蓝、靛玉红的保留 时间一致，在同一个位置出现的吸收峰，因此可以证明2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催 化吲哚后的氯仿提取物含有靛玉红，未转入载体的大肠杆菌￡ co//BL21 (DE3)和转入空载 体pET22b(+)的大肠杆菌Eco"BL21DE3，都没有红色或者蓝色色素的产生，没有检测到靛 玉红及靛蓝，而从而证明2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆能催化吲哚产生靛玉红。
实施例2
10(l) 2-萘酸单加氧酶基因分子体外定向进化技术和DNA shuffling过程 (Al)进行第一步易错PCR1 (error-prone PCR)
以从来自Sw狄oWerZa sp.JT1500的2 —萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号为 AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123为模板，在长度为4802bp的2—萘酸单加氧酶基因 簇(AJ566333)上2579—-3982bp位置处设计特异性引物。
引物上游引物AF5>TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG<3引入酶切位点NdeI 下游弓I物AR5〉CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG<3弓I入酶切位点HindIII PCR反应体系(100W体系)上海生工Pfti DNA Polymerase ( B0093): lOxbuffer 10^1, 5mM MnC12 2pl lOnmdNTP 2(^1, PfU DNA Polymerase 2^1， lOnmPrimersAF 2pl, 1 OnmPrimer s AR 2 pi
模板(5w狄oWw/asp.JT1500的总DNA) 2^1 超纯水 78^1 PCR扩增条件95。C变性5分钟(min)后；在95。Clmin， 57。Clmin， 72。C2min经过30 个循环；然后72。C延伸10min， 12。C终止反应。
经过琼脂糖电泳鉴定(图IO)，扩增获得PCR产物2-萘酸单加氧酶基因片段nmoA，用 上海生工UN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收1311bp大小片段的PCR1产物。 然后用DNAaseI不完全酶切(降解)PCR1产物，DNAaseI酶切条件3~4吗模板片段，0.01U DNaseI， 15 。C 8min，回收10-50 bp碎片段，90°C灭活，冰乙醇+醋酸钠回收，70%乙醇洗 涤，晾干，TE溶解保存。 (A2)无引物(自身引物)进行第二步PCR2
以第一步PCR1酶切得到的10 50bp碎片段的自身为模板，进行无引物PCR2
反应体系
10xbuffer 10(xl
lOnmdNTP 2^1
Pfu DNA Polymerase 2jxl
易错PCR的酶切回收产物
超纯水 76^1反应参数
94 。C变性5min, 94 °C 45s; 45-56 °C 45s;
72。C卯s;进行50个循环 72 。C延伸10min。 得到无引物PCR产物，其电泳图参见图IO。 (A3)采用带酶切位点的特异性引物进行第三步PCR3得到目标大小产物，
引物上游弓i物AF5>TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG<3弓I入酶切位点Ndel 下游弓i物AR5〉CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG〈3弓i入酶切位点HindIII
PCR的反应体系
10xbuffer 10|il,
5mM MnC12 2pl，
10nmdNTP 2^1，
PfU DNA Polymerase 2/al,
10nmPrimersAF/AR 2nl,/2pl 模板(无引物PCR产物)2^1
超纯水 78 ^
PCR扩增条件95。C变性5mm后，在95°C lmin,57。C lmin,72。C 2min，经过30 个循环，然后72'C延伸10min， 12'C终止反应，获得PCR产物，其电泳图参见图11。 (2) pET22b(+)-nmoA^^重组大肠杆菌的构建
步骤(1) A3步骤获得的PCR3产物用上海生工UN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒 (SK1131)回收1311bp大小的2—萘酸单加氧酶突变体nmoA^片段的产物，采用Ndel和 HindIII双酶切后，与经过同样酶切后的线性质粒载体pET22b(+)连接，构建片段 pET22b(+)-nmoA*。
酶切体系50^1:载体pET22b(+)或PCR产物nmoA* 各10^1 (0.1~1吗)，分别加Ndel 和HindlII(10U/n1)1^, 10xbuffer 5nl,超纯水补足至50^1， 37°C 2~8小时双切。
连接体系20^1:酶切产物pET22b(+)/Ndel+Hindl11以及nmoA*/NdeI+Hindin各5pl等摩 尔混合，T4DNA连接酶(lswiss/nl) 1~2^1， 10x连接buffer2pl，超纯水补充至20^1。 16°C， 连接1~12小时。
连接产物转化大肠杆菌￡ co/z'BL21 (DE3)感受态细胞(如果效率低可以采用大肠杆菌TOP10预先转化，阳性克隆连接载体再转化E coli BL21 DE3感受态细胞)，涂布到涂IPTG 与X-gal的的氨苄(100吗/.ml) LB琼脂平板上，37。C过夜培养。
从上述过夜培养的平板上挑取白色的克隆，并转接到lml含100pg/ml氨苄LB液体培养 液的96微孔板中培养24小时，离心取兰紫色菌体细胞，用DMF (二甲基甲酰胺)提取兰紫 色物质，在630nm与540nm处测定其光吸收值，筛选出540nm处光吸收值高的重组大肠杆 菌。
每经过一轮易错PCR1 (Al步骤)、无引物PCR2 (A2步骤)、特异性引物扩增PCR3 (A3 步骤)等三步PCR，连接载体pET22b，筛选阳性克隆，为一轮DNA shuffling;提取筛选得 到阳性克隆的重组质粒，以重组质粒为模版进行下一轮DNAshuffling。经过若干轮的易错PCR 及DNA shuffling筛选，筛选得到540nm处光吸收值高的重组大肠杆菌，命名为突变型 ￡丁2215(+)-謡0八*重组大肠杆菌。
(4) 2 —萘酸单加氧酶进化后的突变型pET22b(+)-nmoA+重组大肠杆菌与其野生型 pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌表达蛋白催化吲哚产生靛玉红的催化效率比较
所述的野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌是将2 —萘酸单加氧酶(nmoA)基因与 pET22b(+)连接，构建形成pET22b(+)-nmoA片段，然后将此片段转化进入大肠杆菌感受态细 胞中，经过蓝白斑筛选，挑取白色克隆，然后将克隆转接到lml含10(Hig/ml氨苄LB液体培 养液的96微孔板中培养24小时，离心取兰色菌体细胞，用DMF (二甲基甲酰胺)提取兰色 物质，在610nm与540nm处测定其光吸收值，筛选获得540nm处光吸收值高的重组大肠杆 菌，此重组的大肠杆菌即为野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌。
野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌及进化后突变型pET22b(+)-nmoA"^重组大肠杆菌 单克隆分别接种到5ml含lOOpg/ml氨苄LB液体培养液，37'C过夜培养；而后接种到100ml 含lOOpg/ml氨苄LB液体培养液中，接种量0.5%~5%，培养基pH6.0~8.5，摇床转速为80 200 转/分钟(卬m)， 37。C培养当OD6oo达到0.5-0.7时加入IPTG (终浓度0.5-1.0nM)， 28。C低 温诱导，继续培养24小时，培养液以3000 12000rpm， 4'C离心，去除上清夜，收集离心后 的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，以3000 12000rpm， 4'C离心，去除 上清夜，菌体细胞悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，在冰浴条件下超声破菌(或 高压)5分钟，再用8000——12000rpm， 4。C离心5—15分钟，分别得到含有2-萘酸单加氧酶 或2-萘酸单加氧酶突变体的细胞破碎液。
经过大肠杆菌诱导表达的的细胞破碎液，采用TOYOBO公司的NPK7蛋白纯化试剂盒 纯化。蛋白纯化步骤参照TOYOBO公司的NPK7蛋白纯化试剂盒说明书。分别在纯化后2 一萘酸单加氧酶(浓度约2mg/ml) lml， 2—萘酸单加氧酶突变体(浓度约2mg/ml) lml中加入250ul的浓度为100nM吲哚溶液，37。C温浴6小时，12000rpm， 4'C离心，取上清产物， 10ml氯仿提取红色色素，热浴蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物，对其进行光谱扫描分析。
图3是靛玉红标样的光谱扫描图，图5是靛蓝标样的光谱扫描图，图12是野生型 pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2 —萘酸单加氧酶催化吲哚的上清液提取物，图13是突变 型pET22b(+)-nmoA+重组大肠杆菌的2—萘酸单加氧酶突变体催化吲哚的上清液提取物。图 12，图13中含有与标样靛玉红的保留时间一致，在同一个位置出现的吸收峰，因此可以证明 两者的上清液提取物中含有靛玉红。
从图15中可以看出转入野生型的2-萘酸单加氧酶基因的大肠杆菌和转入经过筛选得到 的2-萘酸单加氧酶突变体基因的大肠杆菌在40kDa的位置都有蛋白，而转入空载体和未转入 载体的大肠杆菌在相应位置没有出现蛋白条带，因此2个基因重组的大肠杆菌获得了 2-萘酸 单加氧酶或突变体的表达。由于采用了蛋白His-tag特异性亲和吸附的提取方法，因此可以证 明我们提纯的蛋白是转入基因编码的蛋白，即2-萘酸单加氧酶或2-萘酸单加氧酶突变体。
野生型的pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌表达的2-萘酸单加氧酶和突变型 pET22b(+)-nmoA+重组大肠杆菌表达的2-萘酸单加氧酶突变体都能催化U引哚产生靛玉红。以 标样靛玉红(中国药品生物制品检定所提供)做浓度和光吸收的标准曲线，测定ODs4onm处 吸收，计算野生型的pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶和突变型 pET22b(+)-nmoA+大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体产率。
突变型pET22b(+)-nmoA+重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化效率(Kcat/Km值) 为777M"S"。对？￡丁221)(+)-腦0八*重组大肠杆菌￡0 //81^1 (DE3)的2-萘酸单加氧酶突变 体基因nmoA+测序分析发现，该突变体基因在2-萘酸单加氧酶基因的601位的T突变为A， 从而造成了2-萘酸单加氧酶氨基酸序列的201位苯丙氨酸(Phe)突变为异亮氨酸(Ile)。 (5) 2—萘酸单加氧酶进化后的突变型？￡12215(+)-111110六*重组大肠杆菌的全细胞催化吲哚产 生靛玉红。
挑取540nm光吸收值高的重组pET22b(+)-nmoA大肠杆菌及其突变型PET22b(+)-nmoA* 重组大肠杆菌单克隆分别接种到5ml含100pg/ml氨苄LB液体培养液，37'C过夜培养；而后 接种到100ml含100ng/ml氨苄LB液体培养液中，接种量0.5%~5%，培养基pH6.0~8.5，摇 床转速为80~200转/分钟(rpm)， 37。C培养当OD600达到0.5-0.7时加入IPTG (终浓度 0.5~1解)28。C低温诱导，继续培养24 48小时，培养液以3000 12000rpm， 4'C离心，去 除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，以3000 12000rpm， 4'C离心，去除上清夜，菌体细胞加入1000pl的浓度为lOOnM吲哚溶液，37。C温浴6小时， 用8000-12000rpm， 4'C离心5~15分钟，得到含有2-萘酸单加氧酶的细胞，10ml氯仿萃取色素，真空旋转，蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物。光谱扫描(分析方法参照中国药典)，见 图14，从图14中可以看出突变型pET22b(+)-nmoA承重组大肠杆菌和野生型pET22b(+)-nmoA 重组大肠杆菌细胞破碎液的萃取的紫红色产物，存在与标样靛玉红保留时间一致，在特征吸 收波长540nm处峰型一致的吸收峰，证明红色粉状物为靛玉红。将未转化该基因的大肠杆 菌￡ >//81^1 (DE3)和转入空载体pET22b(+)的大肠杆菌五co/ZBL21 (DE3)未能提取到红 色物质，即没有产生靛玉红。
实施例3
本实施例与实施例2相同，只是筛选得到的突变体不同，本实施例筛选到的突变型 pET22b(+)-nmoA一重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化效率(Kcat/Km值)为819M"S—、
对pET22b(+)-nmoA+重组大肠杆菌￡ co// BL21 (DE3)的2-萘酸单加氧酶突变体基因 nmoA^-测序分析发现，该突变体基因在2-萘酸单加氧酶基因的601位的T突变为A， 733位 的T突变为A及735位的G突变为C，从而造成了 2-萘酸单加氧酶氨基酸序列的201位苯丙 氨酸(Phe)突变为异亮氨酸(Ile)， 245位色氨酸(Trp)突变为丝氨酸(Ser)。
实施例4
本实施例与实施例2相同，只是筛选得到的突变体不同，本实施例筛选到的突变型 pET22b(+)-nmoAt重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化效率(Kcat/Km值)为909M—S—1。
对pET22b(+)-nmoA+重组大肠杆菌￡ co// BL21 (DE3)的2-萘酸单加氧酶突变体基因 nmoA^-测序分析发现，该突变体基因在2-萘酸单加氧酶基因的352-354位的CTC突变为 GCA， 601位的T突变为A, 733位的T突变为A及735位的G突变为C，从而造成了 2-萘 酸单加氧酶氨基酸序列的118位的亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)， 201位苯丙氨酸(Phe) 突变为异亮氨酸(Ile)， 245位色氨酸(Trp)突变为丝氨酸(Ser)。
15序列表
<110>广东省微生物研究所
<120>用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶
<160>5
<210> 1
<211> 1314
<212> DNA
<213>伯克霍尔德氏菌(5z^狄oWe〃'asp. JT1500) <220> <221> CDS <400> 1
ATGCGGCGGCATTCGACGCCGAAGTGCGCGCTTTCCTCGCAACACTCTAGAACCCTCCAG60
GAGACTACCGTGGCCTATCAGCCCCCTTCGATCGTCGGCGAGCATTACCCGCTCACGGAC120
AAGCAGCGGCGCTTGCTGGCGCTGGCCGAGCAGGTGGGGCGCGAGTCGCTCGCGCCACGC180
GCCGCGCGCTGGGACCGCGAAGCGTCGTTCCCGTTCGAGAACTACGACGACATGCGCGCC240
GCCGGCTTGCTCAAGCTGTGCATTCCCGAAGCGGACGGCGGTCTGGGCGCCGACTTCGCC300
ACGTACATGA.TGGTTTCCGC360
AACATGCACACGTGCTCGATGATGTGGACAGGGATTCTCGCCGACGATCTCGACATGACG420
CCCGAGCAACGCGCCGAGCATGCGCGTTATCGCGAGCACCACTTCGCCCGGGTGATCCAG■
GACGGTGCGATTTACGCACAGCCGTTCTCCGAGGGCAGCGCCGCGGCGGCGGGCAAGGCA540
CCGTTCGGCACCACGGCCACCAAGGTCGAGGGCGGCTGGAAGATCAATGGCCGCAAGATT600
TTCGCGTCGCTCTCGGGGGCCGCCAACTACTACGGCGTGCTGTGTACCGAAGACAAGCCC660
GAGCTGTCGATGAAGGACACGTTCTACATCGCGGTGCCGGGCGACGCGCCGGGCGTGACC720
GTCACAGGTGACTGGGATCCGCTGGGCATGCGCGGTACGGTCTCGCGCACGTTGCTTTTC780
AAGGACGTGTTCGTGCCCGACGAGCTGCAATTGATGCCGCGCGGCATCTACCATCAGGCC840
GCGAGCCGCTGGCCGCACATGGTCATGACGCTCTCGCCGACATACATGGGTATCGCCCAG■
GCTGCCTATGATTTCACCATCCAGTACCTGCGGGGCGAAGCGCCCGGCATGGGCGCGCCG960
GTCAAGCGCCGCATGTATCCGACCAAGCAGATCGCCGTCGCGCAAATGCACATCCTGCTC1020
GAGCAAACGCGCGCGCTGTTCCTGCGTGCATTGCAGGACGGCCGCGCCGATCCGGGCAAG1080
GAAGCGCGCCTGCGTGCCTATGCGGCGCAGTACACGATCATGGAGAATGCCAACGAGCTG1140
TGCCGGCTGGCCATTCGCACCTGCGGCGGACAGTCGATGCTCAAGACGCTGCCGCTCGAG1200
16CGCATGTACC GCGATTCGCG CTGCGGCGCC CTGATGCTGC CCTGGACGGC CGAGCTGTGT 1260 CTCGATCGCA TCGGCCGCGA AGCGCTCTAC GAACCGGGCG AGCGCGACGA GTAA 1314
<210>2 <211>437 <212> PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(5w狄oWen'a sp. <400> 2
Arg His Ser Thr Pro Lys Cys
JT1500)
Met Arg 1
Ser Arg lie Val Leu Ala Ala Ala Asp Asp Ala Asp Ser Ala Asn Met Asp Leu Arg Glu Ala Gin Pro Phe Asn Gly Tyr Gly Asp Thr Val Thr Arg Thr
Thr Gly Leu Arg Met Gly Glu His Asp His Pro Gly Arg Val Phe Gly Leu
Leu Glu Ala Trp Arg Gly Leu Thr Met His Phe Thr Lys Leu Tyr Asp Leu
Ser
5 Gin
20 His
35 Glu
50 Asp
65 Ala
80 Leu
95 Gly 110 Cys 125 Thr 140 Phe 155 Ser 170 Thr 185 lie 200 Cys 215 lie 230 Trp 245 Phe
Glu Tyr Gin Arg Ala Gly Arg Ser Pro Ala Glu Ala Phe Thr Ala Asp Lys
Thr Pro Val Glu Gly Ala His Met Glu Arg Gly Thr Ala Glu Val Pro Asp
Thr Leu Gly Ala Leu Asp Cys Met Gin Val Ser Lys Ser Asp Pro Leu Val
Val Thr Arg Ser Leu Phe Gly Trp Arg lie Ala Val Leu Lys Gly Gly Phe
Ala
10
Ala
25
Asp
40
Glu
55
Phe
70
Lys
85
Ala
100
Ala
115
Thr
130
Ala
145
Gin
160
Ala
175
Glu
190
Ser
205
Pro
220
Asp
235
Met
250
Val
Leu Ser
Tyr Gin
Lys Gin
Ser Leu
Pro Phe
Leu Cys
Thr Tyr
Thr Als
Gly lie
Glu His
Asp Gly
Ala Alei
Gly Gly
Gly Ala
Glu Leu
Ala Pro
Arg Gly
Pro Asp 17
Ser Pro Arg Ala Glu lie Met Leu Leu Ala Ala Gly Trp Ala Ser Gly Thr Glu
Gin Pro Arg Pro Asn Pro Met Thr Ala Arg lie Lys Lys Asn Met Val Val Leu
His
15 Ser
30 Leu
45 Arg
60 Tyr
75 Glu
90 Val 105 Phe 120 Asp 135 Tyr 150 Tyr 165 Ala 180 lie 195 Tyr 210 Lys 225 Thr 240 Ser 255 GiLeu Met
His Met
Ala Ala
Gly Met
lie Ala
Leu Phe
Glu Ala
Asn Ala
Gin Ser
Ser Arg
Leu Asp
Asp Glu 437
Pro Val Tyr Gly Val Leu Arg Asn Met Cys Arg
260 Arg Gly
275 Met Thr
290 Asp Phe
305 Ala Pro
320 Ala Gin
335 Arg Ala
350 Leu Arg
365 Glu Leu
380 Leu Lys
395 Gly Ala
410 lie Gly
425
lie Leu Thr Val Met Leu Ala Cys Thr Leu Arg
Tyr Ser lie Lys His Gin Tyr Arg Leu Met Glu
His Pro Gin Arg lie Asp Ala Leu Pro Leu Ala
Gin Thr Tyr Arg Leu Gly Ala Ala Leu Pro Leu
265 Ala 280 Tyr 295 Leu 310 Met 325 Leu 340 Arg 355 Gin 370 lie 385 Glu 400 Trp 415 Tyr 430
Met Arg 1
Ser Arg lie Val Leu Ala Ala Ala Asp Asp Ala Asp
Thr Gly Leu Arg Met Gly
Leu Glu Ala Trp Arg Gly
5 Gin
20 His
35 Glu
50 Asp
65 Ala
80 Leu
Glu Tyr Gin Arg Ala Gly
Thr Pro Val Glu Gly Ala
Thr Leu Gly Ala Leu Asp
Val Thr Arg Ser Leu Phe
Ala Met Arg Tyr Glu Ala Tyr Arg Arg Thr Glu
<210>3 <211>437 <212> PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(5w^wWen'fl sp. <400> 3
His Ser Thr Pro Lys Cys
Ala 10 Ala 25 Asp 40 Glu 55 Phe 70 Lys 85 Ala 18
Ser Arg Gly lie Gly Glu Pro Thr Gin Thr Asp Pro Thr lie Thr Cys Met Tyr Ala Glu Pro Gly
270 Trp Pro
285 Ala Gin
300 Ala Pro
315 Lys Gin
330 Arg Ala
345 Gly Lys
360 Met Glu
375 Gly Gly
390 Arg Asp
405 Leu Cys
420 Glu Arg
435
JT1500)
Leu Tyr Lys Ser Pro Leu Thr
Ser Ser Gin Pro Gin Arg Leu Ala Phe Glu Cys lie Tyr Met
Gin His 15
Pro Ser 30
Arg Leu 45
Pro Arg 60
Asn Tyr 75
Pro Glu 90
Met ValSer Ala Glu Leu
Asn Met His Thr
Asp Leu Asp Met
Arg Glu His His
Ala Gin Pro Phe
Pro Phe Gly Thr
Asn Gly Tyr Gly Asp Thr Val Thr Arg Thr Leu Met His Met
Arg Val Phe Gly Leu Pro Val
Lys Leu Tyr Asp Leu Arg Met
AIei Ala Tyr Asp
Gly Met Gly Ala
lie Ala Val Ala
Leu Phe Leu Arg
Glu Ala Arg Leu
Asn Ala Asn Glu
Gin Ser Ser Arg Leu Asp Asp Glu
Met Cys Arg
Leu Gly lie
95 Gly 110 Cys 125 Thr 140 Phe 155 Ser 170 Thr 185 lie 200 Cys 215 lie 230 Trp 245 Phe 260 Gly 2了5 Thr 290 Phe 305 Pro 320 Gin 335 Ala 350 Arg 365 Leu 380 Lys 395 Ala 410 Gly 425
Arg
Ser
Pro
Ala
Glu
Ala
lie
Thr
Ala
Asp
Lys
lie
Leu
Thr
Val
Met
Leu
Ala
Cys
Thr
Leu
Arg
His Met Glu Arg Gly Thr Ala Glu Val Pro Asp Tyr Ser lie Lys His Gin Tyr Arg Leu Met Glu
Cys Met Gin Val Ser Lys Ser Asp Pro Leu Val His Pro Gin Arg lie Asp Ala Leu Pro Leu Ala
Gly Trp Arg lie Ala Val Leu Lys Gly Gly Phe Gin Thr Tyr Arg Leu Gly Ala Ala Leu Pro Leu
100 Ala 115 Thr 130 Ala 145 Gin 160 Ala 175 Glu 190 Ser 205 Pro 220 Asp 235 Met 250 Val 265 Ala 280 Tyr 295 Leu 310 Met 325 Leu 340 Arg 355 Gin 370 lie 385 Glu 400 Trp 415 Tyr 430
Thr
Gly
Glu
Asp
Ala
Gly
Gly
Glu
Ala
Arg
Pro
Ala
Met
Arg
Tyr
Glu
Ala
Tyr
Arg
Thr
Glu
Ala lie His Gly Ala Gly Ala Leu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Gin Asp Thr Thr Met Ala Pro
Leu Leu Ala Ala Gly Trp Ala Ser Gly Thr Glu Arg lie Glu Thr Thr Pro lie Cys Tyr Glu Gly
105 Thr Phe
120 Ala Asp
135 Arg Tyr
150 lie Tyr
165 Lys Ala
180 Lys lie
195 Asn Tyr
210 Met Lys
225 Val Thr
240 Val Ser
255 Leu Gin
270 Trp Pro
285 Ala Gin
300 Ala Pro
315 Lys Gin
330 Arg Ala
345 Gly Lys
360 Met Glu
375 Gly Gly
390 Arg Asp
405 Leu Cys
420 Glu Arg
435
19437
<210>4 <211〉437 <212> PRT
<213>伯克霍尔《恵氏菌(5wA^/zoWen'"sp. <400〉 4
His Ser Thr Pro Lys Cys
JT1500)
Met Arg 1
Ser Arg lie Val Leu Ala Ala Ala Asp Asp' Ala Asp Ser Ala Asn Met Asp Leu Arg Glu Ala Gin Pro Phe Asn Gly Tyr Gly Asp Thr Val Thr Arg Thr Leu Met
Arg Thr Gly Leu Arg Met Gly Glu His Asp His Pro Gly Arg Val Phe Gly Leu Pro
Leu Glu Ala Trp Arg Gly Leu Thr Met His Phe Thr Lys Leu Tyr Asp Leu Arg
5 Gin
20 His
35 Glu
50 Asp
65 Ala
80 Leu
95 Gly 110 Cys 125 Thr 140 Phe 155 Ser 170 Thr 185 lie 200 Cys 215 lie 230 Ser 245 Phe 260 Gly
Glu Tyr Gin Arg Ala Gly Arg Ser Pro Ala Glu Ala lie Thr Ala Asp Lys lie
Thr Pro Val Glu Gly Ala His Met Glu Arg Gly Thr Ala Glu Val Pro Asp Tyr
Thr Leu Gly Ala Leu Asp Cys Met Gin Val Ser Lys Ser Asp Pro Leu Val His
Val Thr Arg Ser Leu Phe Gly Trp Arg lie Ala Val Leu Lys Gly Gly Phe Gin
Ala 10 Ala 25 Asp 40 Glu 55 Phe 70 Lys 85 Ala 100 Ala 115 Thr 130 Ala 145 Gin 160 Ala 175 Glu 190 Ser 205 Pro 220 Asp 235 Met 250 Val 265 Ala 20
Leu Ser Tyr Gin Lys Gin Ser Leu Pro Phe Leu Cys Thr Tyr Thr Ala Gly lie Glu His Asp Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Glu Leu Ala Pro Arg Gly Pro Asp Ala Ser
Ser Gin His 15
Pro Pro Ser 30
Arg Arg Leu 45
Ala Pro Arg 60
Glu Asn Tyr 75
lie Pro Glu 90
Met Met Val 105
Leu Thr Phe 120
Leu Ala Asp 135
Ala Arg Tyr 150
Ala lie Tyr 165
Gly Lys Ala 180
Trp Lys lie 195
Ala Asn Tyr 210
Ser Met Lys 225
Gly Val Thr 240
Thr Val Ser 255
Glu Leu Gin 270
Arg Trp ProHis Met Val
Ala Ala Tyr
Gly Met Gly
lie Ala Val
Leu Phe Leu
Glu Ala Arg
Asn Ala Asn
Gin Ser Met
Ser Arg Cys
Leu Asp Arg
Asp Glu 437
275 Met Thr
290 Asp Phe
305 Ala Pro
320 Ala Gin
335 Arg Ala
350 Leu Arg
365 Glu Leu
380 Leu Lys
395 Gly Ala
410 lie Gly
425
Leu Thr Val Met Leu Ala Cys Thr Leu Arg
Ser lie Lys His Gin Tyr Arg Leu Met Glu
Pro Gin Arg lie Asp Ala Leu Pro Leu Ala
Thr Tyr Arg Leu Gly Ala Ala Leu Pro Leu
280 Tyr 295 Leu 310 Met 325 Leu 340 Arg 355 Gin 370 lie 385 Glu 400 Trp 415 Tyr 430
Met Arg 1
Ser Arg lie Val Leu Ala Ala Ala Asp Asp Ala Asp
Arg Thr Gly Leu Arg Met Gly
Leu Glu Ala Trp Arg Gly
5 Gin
20 His
35 Glu
50 Asp
65 Ala
80 Leu
95
Glu Tyr Gin Arg Ala Gly
Thr Pro Val Glu Gly Ala
Thr Leu Gly Ala Leu Asp
Val Thr Arg Ser Leu Phe
Met Arg Tyr Glu Ala Tyr Arg Arg Thr Glu
<210>5
<211>437
<212>PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(Bw^zoWeWa sp. <400> 5
His Ser Thr Pro Lys Cys
Ala
10
Ala
25
Asp
40
Glu
55
Phe
70
Lys
85
Ala
100
Gly lie Gly Glu Pro Thr Gin Thr Asp Pro Thr lie Thr Cys Met Tyr Ala Glu Pro Gly
285 Ala Gin
300 Ala Pro
315 Lys Gin
330 Arg Ala
345 Gly Lys
360 Met Glu
375 Gly Gly
390 Arg Asp
405 Leu Cys
420 Glu Arg
435
JT1500)
Leu Tyr Lys Ser Pro Leu Thr
Ser Ser Gin Pro Gin Arg Leu Ala_ Phe Glu Cys lie Tyr Met
Gin His 15
Pro Ser 30
Arg Leu 45
Pro Arg 60
Asn Tyr 75
Pro Glu 90
Met Val 105Ser Ala Glu
Asn Met His
Asp Leu Asp
Arg Glu His
Ala Gin Pro
Pro Phe Gly
Asn Gly Arg
Tyr Gly Val
Asp Thr Phe
Val Thr Gly
Arg Thr Leu
Leu Met Pro
His Met Val
Ala Ala Tyr
Gly Met Gly
lie Ala Val
Leu Phe Leu
Glu Ala Arg
Asn Ala Asn
Gin Ser Met
Ser Arg Cys
Leu Asp Arg
Asp Glu 437
Leu Gly Arg
110 Thr Cys Ser
125 Met Thr Pro
140
His Phe Ala 155
Phe Ser Glu 170
Thr Thr Ala 185
Lys lie lie
200 Leu Cys Thr
215 Tyr lie Ala
230 Asp Ser Asp
245 Leu Phe Lys
260 Arg Gly lie
275 Met Thr Leu
290 Asp Phe Thr
305 Ala Pro Val
320 Ala Gin Met
335 Arg Ala Leu
350 Leu Arg Ala
365 Glu Leu Cys
380 Leu Lys Thr
395 Gly Ala Leu
410 lie Gly Arg
425
His Cys Gly Met Met Trp Glu Gin Arg Arg Val lie Gly Ser Ala Thr Lys Val Ala Ser Leu Glu Asp Lys Val Pro Gly Pro Leu Gly Asp Val Phe Tyr His Gin Ser Pro Thr lie Gin Tyr Lys Arg Arg His lie Leu Gin Asp Gly Tyr Ala Ala Arg Leu Als Leu Pro Leu Met Leu Pro Glu Ala Leu
Ala Thr Ala 115
Thr Gly lie 130
Ala Glu His 145
Gin Asp Gly 160
Ala Ala Ala 175
Glu Gly Gly 190
Ser Gly Ala 205
Pro Glu Leu 220
Asp Ala Pro 235
Met Arg Gly 250
Val Pro Asp 265
Ala Ala Ser 280
Tyr Met Gly 295
Leu Arg Gly 310
Met Tyr Pro 325
Leu Glu Gin 340
Arg Ala Asp 355
Gin Tyr Thr 370
lie Arg Thr 385
Glu Arg Met 400
Trp Thr Ala 415
Tyr Glu Pro 430
22
Ala Thr Phe 120
Leu Ala Asp 135
Ala Arg Tyr 150
Ala lie Tyr 165
Gly Lys Ala 180
Trp Lys lie 195
Ala Asn Tyr 210
Ser Met Lys 225
Gly Val Thr 240
Thr Val Ser 255
Glu Leu Gin 270
Arg Trp Pro 285
lie Ala Gin 300
Glu Ala Pro 315
Thr Lys Gin 330
Thr Arg Ala 345
Pro Gly Lys 360
lie Met Glu 375
Cys Gly Gly 390
Tyr Arg Asp 405
Glu Leu Cys 420
Gly Glu Arg 43权利要求
1.一种2-萘酸单加氧酶，其特征在于所述的2-萘酸单加氧酶的氨基酸序列如SEQ2所示，其基因的核苷酸序列如SEQ1所示。
2. —种权利要求1所述的2 —萘酸单加氧酶在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。
3. —种含有权利要求1所述的基因，能够表达权利要求1所述的酶的全细胞在生物催化制备靛玉红中的应用。
4. 以权利要求1所述的2 —萘酸单加氧酶为基础衍生出的，经过分子修饰的，引起氨基酸序列发生功能性突变的2 —萘酸单加氧酶突变体在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。
5. —种含有权利要求4所述酶突变体的编码基因，能够表达权利要求4所述的酶突变体的全细胞在生物催化制备靛玉红中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种2-萘酸单加氧酶及其突变体，以及其在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。本发明通过实验证明2-萘酸单加氧酶能够催化吲哚产生靛玉红，本发明还通过实验证明经过分子改良的2-萘酸单加氧酶突变体也能生物催化制备靛玉红，且其催化效率比野生型2-萘酸单加氧酶高，突变体的催化效率比野生型高2-4倍。本发明主要用于生物制备抗癌药物靛玉红。
文档编号C12R1/01GK101580821SQ200910036718
公开日2009年11月18日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者孙国萍, 岑英华, 许玫英, 俊 郭, 韩木兰 申请人:广东省微生物研究所