专利名称：：Pik3ca基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，具体的是涉及PIK3CA基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。
背景技术：
：PIK3CA基因是逆转录病毒r/7说癌基因在细胞内的同系物，编码IA类磷脂酰肌醇3激酶(pho印hatidylinositol3-kinases,PI3Ks)的pllOa催化亚单位。I类PI3Ks是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异源二聚体，可受表皮生长因子受体(印idermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)、胰岛素受体等受体酪氮酸激酶的激活。活化的PI3Ks磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸[phosphatidylinositol4,5-bisphosphate，PI(4,5)P2],生成细胞内的重要第二信使——磷脂酰肌醇(3，4,5)三磷酸(phosphatidyli-3，4，5-triphosphate,PIP3)。PIP3可激活AKT通路，从而产生广泛的生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等，涉及mT0R(targetofrapamycin)、BAD、Caspase9、Tuberin、GSK3P和FH(forkhead)转录因子家族亚群等众多的靶分子。对PI3K家族全部16个成员的激酶结构域外显子编码区域进行序列分析显示，PIK3CA是唯一被发现由体细胞突变引起致癌的基因。进一步的研究指出，大部分PIK3CA基因突变集中在螺旋结构域和催化结构域，被称为PIK3CA基因突变的"热点"。最新的研究表明，PIK3CA基因突变可发生在包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤细胞中。目前，PI3K通路已经成为各大医药公司开发抗肿瘤小分子抑制剂的主要靶标，而PIK3CA基因也成为了肿瘤诊断及治疗的主要靶点。目前'Quinolone、Pyricbpyrimidine、Imidaz叩yridine等药物均是根据PIK3CA靶点和相应的PI3K通路而开发的。然而，由于PIK3CA在肿瘤细胞中存在的突变的高频性，各种针对EGFR基因以及PI3K通路而开发的药物疗效存在着个体差异。Maruyama等研究报道，存在PIK3CA基因突变的患者其预后更为积极。而有的研究者则指出，在乳腺癌中，PIK3CA中不同的基因突变位点其预后也不同。外显子9(螺旋结构域)上的突变的患者预后比野生型个体要差，而外显子20(催化结构域)上的突变相对与野生型个体具有积极的预后。尽管PIK3CA基因突变对肿瘤患者的治疗预后的尚未定论，但这些研究都提示着PIK3CA基因突变是影响预后的一个重要因素。因此，对肿瘤患者尤其是乳腺癌患者，进行PIK3CA基因突变的检测是实现肿瘤个体化治疗，让患者最大程度的受益就显得十分必要了。当前，国内外进行PIK3CA基因突变检测的主要方法是进行组织DNA样本的直接测序。直接测序法具有直接和直观等优点，能够确切的了解PIK3CA基因突变的位点和类型，然而，直接测序法存在着灵敏度差和效率低等问题，严重的影响了其在临床上的应用。由于肿瘤组织存在着异质性的问题，即使存在PIK3CA基因突变的患者样本中也含有大量的野生型基因，从而干扰了PIK3CA基因突变的有效检出，目前直接测序法可以达到的检测的灵敏度大概为15%-25%;同时，直接测序法难以实现高通量的检测，其时效性严重的制约了其在临床诊断中推广。国际上最先进的检测PIK3CA基因突变的技术是采用位点特异的荧光定量PCR，该方法的优势在于提高了检测灵敏度和检测的时效性。但实时荧光定量PCR检测技术本身存在着假阳性率高亦即特异性差的问题，也为临床诊断所诟病。因此，PIK3CA基因突变的检测要成为一项临床常规检测技术，必须建立一种灵敏度高、特异性好并且能够实现高通量检测的简便易行的检测新技术，是各级医院都有条件开展这一基因诊断项目。
发明内容本发明的目的在于提供用于PIK3CA基因突变检测的探针，以及应用这些探针所制备的PIK3CA基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测PIK3CA基因外显子9和/或外显子20上的相关突变，从而为临床治疗提供参考。实现上述目的的技术方案如下用于PIK3CA基因突变检测的探针包括有针对E542的野生型的SEQIDNO.1探针和针对E542K点突变的SEQ丄DNO.2探针；禾口/或针对E545野生型的SEQIDNO.3探针，针对E545K点突变的SEQIDNO.4探针和针对E545D点突变的SEQIDNO.5探针；和/或针对E1047的野生型SEQIDN0.6探针、针对E1047R点突变的SEQIDNO.7探针。一种PIK3CA基因突变检测的液相芯片，主要包括有包被有SEQIDNO.1的、针对E542的野生型氨基修饰探针的微球、和包被有SEQIDN0.2的、针对E542K点突变的氨基修饰探针的微球；和/或包被有于SEQIDN0.3的针对E545的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDN0.4的针对E545K点突变的氨基修饰探针的微球、以及包被有SEQIDNO.5的针对E545D点突变的氨基修饰探针的微球；和/或包被有SEQIDNO.6的、针对E1047的野生型氨基修饰探针的微球、和包被有SEQIDNO.7的、针对E1047R点突变的氨基修饰探针的微球；上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及用于扩增出具有PIK3CA的9外显子和/或20外显子突变位点的目标序列的引物，且该目标序列的末端具有生物素标记。以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n》3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)千扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5—30个T，更优选为IO个T。优选地，用于扩增出具有9外显子突变位点的目标序列的引物包括有SEQIDNO.8SEQIDNO.10引物序列，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或用于扩增出具有20外显子突变位点的目标序列的SEQIDNO.11SEQIDNO.13引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。本发明的另一目的还在于提供一种PIK3CA基因突变的检测方法，该方法快速、准确、操作简便，可同时并行检测多个突变位点。一种使用上述PIK3CA基因突变检测的液相芯片PIK3CA基因突变的检测方法，包括以下步骤(1)提取待检测样本中的DNA后，以用于扩增出具有PIK3CA基因9外显子和/或20外显子突变位点的目标序列的引物进行第一轮PCR扩增；(2)酶切富集第一轮PCR扩增产物；(3)以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；(4)第二轮PCR扩增产物与上述包被有探针序列的微球进行杂交；(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后通过Luminex仪器检测信号。优选地，进行第一轮PCR扩增用的引物对为SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和/或SEQIDNO.11、SEQIDNO.12。进行第二轮PCR扩增用的引物对SEQIDNO,9、SEQIDNO.10和/或SEQIDNO.12、SEQIDNO.13。优选地，杂交的温度为55—6(TC。优选地，每种包被有探针的微球的制备方法包括步骤如下(1)取微球母液，涡旋，充分混匀成微球悬液；(2)取出8ul微球母液，共含0.8X105—1.2X1()5个微球至0.5ml离心管中；(3)》10，000rPm离心25min，弃去上清液；(4)加入10y1偶联液(pH4.5)，涡旋使之充分混匀；(5)加入2pmol/iU探针工作液2u1;(6)加入2.5ul5mg/ml的EDC工作液，25。C孵育30min;重复该步骤一次；(7)加入0.2ml洗涤液，涡旋使之充分混匀，》10，000rpm离心25rain，弃去上清液；重复该步骤一次；(8)加入500ulTE溶液，涡旋使之充分混匀；(9)》10,OOOrpm离心25min，弃去上清液；(10)加入17iUTE溶液，涡旋使之充分混匀，微球浓度应约为5XK)3个/y丄；(11)取2ul，用水稀释50倍，计数，储存于2-8'C。根据现有的研究，PIK3CA基因突变主要集中在外显子9(螺旋结构域)和外显子20(催化结构域)上，特别的，氨基酸位点E542、E545和H1047被称为PIK3CA突变的热点(Hot-印ot)，约占所有PIK3CA点突变的80M。为此，本发明选择突变率最高的E542、E545和H1047的突变情况进行检测。本发明的主要优点在于-(1)采用本发明提供的PIK3CA基因突变检测液相芯片，可同时对PIK3CA基因突变相对频率较高的位点进行检测，也可以各自单独进行检测，检测时的反应条件均一，检测步骤简单，在检测时效性上远远优于常用的直接测序技术，同时，多位点的并行检测实现了检测的高通量。(2)本发明采用酶切富集的方法进行目标序列的PCR扩增进而用于检测，避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰，从而极大的提高了检测的灵敏度，是现有检测技术所无法比拟的。(3)本发明实现了酶切富集技术和液相芯片技术的有效结合，避免了实时荧光定量PCR存在的假阳性率高的问题，大大的提高了检测的特异性和准确率。具体实施例方式溶液配方'偶联液(pH4.5):0.lmol/LMES(SigmaM-2933)洗涤液0.2ml/LTween-20(SigmaP-9416),lg/LSDS(SigmaL-4390)TE(pH8.0)(储存液)10ramol/LTris(Sigma337501)，lmmol/LEDTA(SigmaE—5134)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>过滤后贮存于4°C。实施例1PIK3CA基因突变检测的液相芯片的制备一、探针序列设计及微球包被针对PIK3CA基因外显子9、20的野生型与突变型序列，设计特异的寡核苷酸探针。探针的5'端为一个氨基基团，接着是一个IO个T的间隔臂。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探针分别与不同颜色编码的微球(购自Luminex公司)通过共价结合偶联在一起(包被过程)。每种微球包被的具体步骤如下(1)取微球母液(购自Luminex公司)于涡旋仪上震荡成微球悬液；(2)取出8ul微球母液，共含0.8X105—1.2X1()5个微球至0.5ml离心管中；(3)10，000rpm离心2min，弃去上清液；(4)加入10ul偶联液(pH4.5),涡旋使之充分混匀；(5)加入2pmol/ul探针工作液2ul;(6)加入2.5ul浓度为5mg/ml的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐)工作液，25'C孵育30min;重复该步骤一次；(7)加入0.2ml洗涤液，涡旋使之充分混匀，10，000rpm离心2min，弃去上清液；重复该步骤一次；(8)加入500ulTE溶液，涡旋使之充分混匀；(9)10，OOOrpm离心2min，弃去上清液；(10)加入20ulTE溶液，储存于2-8。C。探针序列如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。PE9-AS2与PE20-AS2的5'端分别加上生物素标记。其中，PE9-S1与用PE9-AS1于外显子9的第一轮PCR扩增，PE9-S1与生物素标记的PE9-AS2用于外显子9的第二轮PCR扩增；PE20-S1与PE20-AS1用于外显子20的第一轮PCR扩增，PE20-S1与生物素标记的PE20-AS2用于外显子20的第二轮PCR扩增。制备得到的PIK3CA基因突变检测液相芯片包括有包被有SEQIDNO.1的、针对E542的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDNO.2的、针对E542K点突变的氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDNO.3的针对E545的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDN0.4的针对E545K点突变的氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDNO.5的针对E545D点突变的氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDNO.6的、针对E1047的野生型氨基修饰探针的微球、和包被有SEQIDN0.7的、针对E1047R点突变的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，且每种微球具有不同颜色编码；以及SEQIDNO.8—10和SEQIDNO.11—13的引物序列,其中SEQIDNO.10与SEQIDNO.13碱基序列的5'端分别加上生物素标记。实施例2运用实施例1中的PIK3CA基因突变检测液相芯片对乳腺癌组织样本进行检测一、待测样本的准备乳腺癌组织样本中DNA的提取取乳腺癌术后的组织标本5-50mg，研磨后，用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；洗涤后的组织标本重悬于1ml的消化液(50mmol/LTris，l鹏o/LNa2EDTA，0.5%Tween-20,200ug/ml的蛋白酶K200，pH8.5)，55。C水浴消化1小时，99。C水浴15min灭活蛋白酶K;12000转/分钟离心10分钟；取上清，通过酚-氯仿-异戊醇法抽提，乙醇沉淀法获得用于PCR反应的DNA样品。也可通过微量离心柱法提取DNA;二、待测样品的PCR扩增与酶切富集(1)样本DNA的PCR扩增与酶切富集外显子9上E542、E545突变型的酶切富集PCR扩增如下1.第一轮PC財广增PCR反应体系10XTureStartDNApolymeraseBuffer2.5pl2.5mMdNTP混合液2|_UPE9-AS10.5^1(2(Vmol/L)PE9-S10.5fU(20(amol/L)TureStartT叫脆polymerase0.5]ul(2U/jal)模板DNAlpl加入灭菌双蒸水至25plPCR反应条件:步骤预变性变性退火延伸温度95°C95°C58°C72°C时间5min30sec30sec45sec循环次数12010min2.PCR产物酶切E542酶切的反应体系如下10XNEBBuffer4PCR产物Hpyl88I加入灭菌双蒸水至37。C温育2小时，65'C20分钟灭活酶cE545酶切的反应体系如下10XNEBBuffer4PCR产物TspRI100XBSA加入灭菌双蒸水至0.5|al(lOU/pl)I3^10.5pl(10U/|al)0.lul165"温育2小时<3.第二轮PCR扩增PCR反应体系lOXTureStartDNApolymeraseBuffer2.5pl2.5mMdNTP混合液2plPE9_Sl0.5(^1(20nmol/L)Biotin-PE9-As2TureStartTaqDNApolymerase0.5)^1(20,1/L)0.5nl(2,)酶切产物1(^1加入灭菌双蒸水至PCR反应条件:步骤预变性变性退火延伸最后延伸温度95°C95°C59°C72°C72°C时间5min30sec30sec45sec10min外显子20上E1047突变型的酶切富集PCR扩增如下1.第一轮PCR扩增PCR反应体系10XT匿Start腿polymeraseBuffer2.5)^1循环次数302.5mMdNTP混合液PE20-SIPE20-AslTureStartTaq■polymerase152^10.25pl(20|amol/L)0.25^1(20)_unol/L)0.5)ul(2U/)al)模板DNA加入灭菌双蒸水至PCR反应条件:步骤预变性变性退火延伸最后延伸2.PCR产物BsaBI酶切:反应体系如下:温度95。C95°C53°C72。C72°C10XNEBBuffer2PCR产物BsaBI加无酶水至25(il时间5min30sec30sec45sec10min循环次数120lul0.5^1(lOU/fxl)160。C温育2小时，80°C20分钟灭活酶c3.第二轮PCR扩增PCR反应体系:10XTureStartDNApolymeraseBuffer2.5|lU2.5mMdNTP混合液Biotin-PE20-As20.5(^1(20pmol/L)PE20-SI0.5^1(20,1/UTureStartTaqDNApolymerase0.5(jl(2U/(il)酶切产物1^1加入灭菌双蒸水至25|tdPCR反应条件步骤温度时间循环次数预变性95°C5min1变性95°C30sec退火53°C30sec30延伸72°C45sec最后延伸72°C10min1三、杂交与上机检测(1)将包被有探针E542P、E542K-P、E545-P,E545K-P,E545D-P,E1047-P，E1047R-P，阴性对照探针(N-P)的微球分别涡旋混匀；(2)用1.5XTm杂交液配制含有包被有探针的混合微球工作液，使溶液中每种微球浓度为75个/ul;(3)将混合微球工作液涡旋混匀；(4)每孔加入对应的33ul混合微球工作液，使反应体系中最终含有每种微球各约20002500个;(5)背景孔加入17ulTE(pH8.0);其他每孔分别加入每个样本的第二轮PCR产物各2-17ul，补加TE至17ul;轻轻混匀；盖上反应板(管盖)防止蒸发；(6)设置PCR仪程序95°C5min;60。C杂交孵育15min;(7)用lXTm杂交液配制SA-PE至10ug/ml(25ul/孔)；(8)每孔加入25ulSA-PE(链亲和素藻红蛋白)工作液；(9)马上置于杂交温度(6CTC)，孵育5min;(10)将Luminex仪器设置到杂交温度，读数。四、检测结果与数据分析反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，检测结果如表1所示。在此之前，我们首先采用野生型DNA(非特异性)的样本进行检测，记录每次检测荧光值，取突变型(特异性)探针微球上的荧光值的平均值加上5倍标准差(Mean+5*SD)作为每个突变检测的cut-off值。根据这一方法确定的E542K-P、E545K-P、E545D-P和E1047R-P探针的cutoff值均接近100，因此，将本PIK3CA基因突变检测液相芯片各探针的cutoff值确定为100。根据这一判定标准，本实施例所检测的10份样本中，5例存在点突变，其中2号样本突变型为E542K，3号样本为突变型E545D，5号、8号样本突变型为E1047R，9号样本突变型为E542K。同时，我们将检测样本进行测序法检测(见表2)，其中2号样本测序法难以判别是否存在突变(测序出现杂峰，我们从液相芯片检测结果也可以看到，探针E545-P也有一定的响应值，MFI值为787，而探针E545K-P检测值为209,说明该样本中存在异质性且突变型DNA比例较低)，其余9个样本测序情况均与本实施例中检测判定的结果一致，符合率达到100%，即使加上测序无法判别的样本，符合率也达到90%。而本实验也充分说明，本发明所提供的PIK3CA基因突变检测液相芯片及检测方法不仅可以同时检测突变类型，而且具有很高的检测准确率和特异性，其检测的灵敏度明显优于测序法的检测(2号样本测序法无法判读)。表1样本的检测结果样<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例3、PIK3CA基因突变检测液相芯片检测灵敏度实验为了检测本液相芯片的检测灵敏度，设计在PIK3CA野生型DNA中检测突变型DNA的能力，即考察本液相芯片系统所能检测的突变型DNA的最低比例。本实验各组样本中野生型DNA、突变型DNA的拷贝数如表2所示。每组实验都进行重复实验。本实施例中样本的第一轮PCR、酶切反应、第二轮PCR反应以及luminex检测与实施例2所述步骤相同。表3PIK3CA基因突变检测液相芯片灵敏度检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>检测的结果表2所示(检测荧光值MFI值大于100即判定为阳性，为有效检出。)检测的结果表明采用本发明的PIK3CA基因突变检测液相芯片，将酶切富集技术和液相芯片技术有效结合，可以在5000拷贝的野生型DNA中检出5个拷贝数的突变型DNA，检测灵敏度至少为0.1%'同时，采用本发明的检测方法，可以最低检测出5个拷贝的突变型DNA。序列表〈110〉广州益善生物技术有限公司〈120〉PIK3CA基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法〈160〉14〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉22212〉DNA〈213〉人工序列<400〉1tacacgagatcctctctctgaa22〈210〉2〈211〉22〈212〉DNA<213〉人工序列<400>2tacacgagatcctctctctaaa22<210〉3<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3tcactgagcaggagaaagatt〈210〉4〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉4tcactaagcaggagaaagatt〈210〉5〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列tcacttagcaggagaaagatt<210〉6〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉6gatgcacatcatggtggctg〈210>7<211〉20〈212〉■〈213〉人工序列<400〉7gatgcacgtcatggtggctg20〈210〉8〈211〉24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉'8ggaactttaccacactgctgaacc〈210〉9<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9gcaggagaaagattttctatgg〈210〉10<211〉21〈212〉腿24〈213〉人工序列〈400〉10cttctcgggatacagaccaat〈210〉11〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11ccttgtaacacatctcctg〈210〉12〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉12ggatcttccacacaattaaacag23〈210〉13〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉13attgtagttctggcattcc25〈210>14〈211〉20〈212〉腿<213〉人工序列〈棚〉14cgttaggtcggagcttgatc权利要求1.用于PIK3CA基因突变检测的探针，其特征在于，包括有针对E542的野生型的SEQIDNO.1探针和针对E542K点突变的SEQIDNO.2探针；和/或针对E545野生型的SEQIDNO.3探针、针对E545K点突变的SEQIDNO.4探针和针对E545D点突变的SEQIDNO.5探针；和/或针对E1047的野生型SEQIDNO.6探针、针对E1047R点突变的SEQIDNO.7探针。2.—种PIK3CA基因突变检测的液相芯片，其特征在于，主要包括有包被有SEQIDNO.1的针对E542的野生型氨基修饰探针的微球，和包被有SEQIDNO.2的针对E542K点突变的氨基修饰探针的微球；和/或包被有SEQIDNO.3的针对E545的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQIDN0.4的针对E545K点突变的氨基修饰探针的微球、以及包被有SEQIDNO.5的针对E545D点突变的氨基修饰探针的微球；和/或包被有SEQIDNO.6的针对E1047的野生型氨基修饰探针的微球，和包被有SEQIDNO.7的、针对E1047R点突变的氨基修饰探针的微球；上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及用于扩增出具有PIK3CA的9外显子和/或20外显子突变位点的目标序列的引物，且该目标序列的末端具有生物素标记。3.根据权利要求2所述的用于PIK3CA基因突变检测的液相芯片，其特征在于所述间隔臂为5—30个T。4.根据权利要求2所述的用于PIK3CA基因突变检测的液相芯片，其特征在于用于扩增出具有9外显子突变位点的目标序列的引物包括有SEQIDN0.8SEQIDNO.10引物序列，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或用于扩增出具有20外显子突变位点的目标序列的SEQIDNO.11SEQIDNO.13引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。5.—种PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于使用权利要求2所述的PIK3CA基因突变检测的液相芯片，包括以下步骤1〉提取待检测样本中的DNA，以用于扩增出具有9外显子和/或20外显子突变位点的目标序列的引物进行第一轮PCR扩增；2)酶切富集第一轮PCR扩增产物；3)以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；4)第二轮PCR扩增产物与对应的权利要求2中所述包被有探针的微球进行杂交；5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后检测信号。6.根据权利要求5所述的PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于步骤1)第一轮PCR扩增用的引物对的碱基序列为SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和/或SEQIDNO.11、SEQIDNO.12;步骤3)第二轮PCR扩增用的引物对的碱基序列为SEQIDNO.9、SEQIDNO.10和/或SEQIDNO.12、SEQIDNO.13。7.根据权利要求5所述的PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于步骤4)所述杂交温度为55—60。C。8.根据权利要求5所述的PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于每种所述包被有探针的微球的制备方法包括步骤如下(1)取微球母液充分混匀成微球悬液；(2)取出8y1微球母液，共含0.8Xl()5—1.2X105个微球至0.5ml离心管中；(3)》10,OOOrpm离心25min，弃去上清液；(4)加入10ul偶联液，涡旋使之充分混匀；(5)加入2pmol/y1探针工作液2y1;(6)加入2.5y15mg/ml的EDC工作液，25。C孵育30min;重复该步骤一次；(7)加入0.2ml洗涤液，涡旋使之充分混匀，^10,000rpra离心25min，弃去上清液；重复该步骤一次；(8)加入500u1TE溶液，涡旋使之充分混匀；(9)^10，000rpm离心25min，弃去上清液；(10)加入17p1TE溶液，涡旋使之充分混匀，微球浓度应约为5乂103个/"1;(11)取2yl，用水稀释50倍，计数，储存于2-8'C。全文摘要本发明公开了一种PIK3CA基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法，该PIK3CA基因突变检测液相芯片主要包括有包被探针的微球；用于扩增出具有9外显子和/或20外显子的目标序列的引物。采用本发明提供的PIK3CA基因突变检测液相芯片和检测方法，可同时对PIK3CA基因突变相对频率较高的位点进行检测，可以对9外显子和20外显子各单独进行检测，也可以两者同时检测，检测时的反应条件均一，检测结果特异性好，灵敏度高，检测准确度达90％以上，检测所需时间短。文档编号C12Q1/68GK101445832SQ20081022026公开日2009年6月3日申请日期2008年12月23日优先权日2008年12月23日发明者许嘉森,郭元杰申请人:广州益善生物技术有限公司