虫媒病毒液相芯片三重检测方法

虫媒病毒液相芯片三重检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种虫媒病毒液相芯片三重检测方法，即针对基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热和裂谷热病毒三种虫媒病毒分别设计特异性引物和探针，通过单重PCR和克隆测序，确定了引物和探针的特异性后，进行多重PCR扩增，在扩增反应体系中，上下游引物的浓度比为1:1-1:8；然后将探针与荧光编码微球偶联制得微球混合液并通过偶联探针进行偶联质量控制；最后将多重PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。本发明检测特异性好，可以同时检测三种虫媒病毒；由于在多重PCR扩增过程中，采用不对称PCR的扩增方法，本发明检测灵敏度高。
【专利说明】虫媒病毒液相芯片三重检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可以同时检测基孔肯亚热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、裂 谷热病毒三种虫媒病毒的液相芯片三重检测方法以及所涉及的液相芯片的制备方法和应 用。

【背景技术】
[0002] 虫媒病毒是指一类以吸血昆虫为媒介，在脊椎动物和人、畜间传播多种严重疾病 的病毒。目前已发现的虫媒病毒约537种，分布遍及世界五大洲，已证实其中130余种对 人畜有致病性 [1]。在病毒分类中，虫媒病毒隶属14个病毒科。根据所包括病毒的种类及其 与人、畜疾病的关系，虫媒病毒主要集中在披膜病毒科甲病毒属（29种）、黄病毒科黄病毒 属（69种）、呼肠孤病毒科（77种）和布尼安病毒科（350种），其中许多病毒对人类健康和 生命安全危害较大 [2]。
[0003] 基孔肯雅热的病原体为基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV)，主要传播 媒介为埃及伊蚊ii)、白纹伊蚊?)和非洲伊蚊 a/rica/ws)，以"人-蚊-人"的方式循环。该病毒最早在非洲，随后在印度和东南亚流行。 近几年，基孔肯雅热在非洲和亚洲再次暴发，导致数百万人发病 [3]，且传播范围具有超出现 有分布范围的趋势，即向中美洲、南美洲以及美国南部和中国等地区扩散。2008年，我国首 次从2例斯里兰卡回国的输入性病例血清标本中检出CHIKV。2010年我国广东省东莞市发 生基孔肯雅热流行，共确定诊断173例患者。该病传播媒介在我国广泛分布，尤其在南方地 区具有引发基孔肯雅热流行的条件 [2]。基孔肯雅热的典型表现为突起高热，关节疼痛以及 皮疹。在亚洲，CHIKV与出血热综合征有密切关系，类似登革出血热或登革休克综合征。
[0004] 克里米亚-刚果出血热（Crimean Congo hemorrhagic fever, CCHF)(在中国称 新疆出血热）因感染CCHF病毒引起，是中国目前已经发现的4种虫媒病毒性传染病之一
[4] 〇CCHF病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae)，内罗毕病毒属（Nairovirus genus)，CCHF 病毒广（CCHFV)泛分布于非洲、中东、欧洲东南部和亚洲的干燥地区，我国新疆从1964至 1994年共报告260例病人 [5]。各种野生哺乳动物为该病毒储存宿主，流行季节为3-6月，呈 散发流行。该病毒引起以发热、全身性出血为典型特征的烈性传染疾病，病死率高达67% [6]。
[0005] 裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV)属于布尼安病毒科白蛉热病毒 属，蚊虫为主要传播媒介。该病毒可引起具有高发病率和高病死率的急性出血性人畜共 患传染病。人类感染裂谷热后，主要表现为发热，乏力，头痛，肌肉痛，关节痛，有时会有恶 心，呕吐，部分会出现眼部疾病、脑膜炎或出血热。近10多年，该病在非洲流行较为严重， 2006-2007年肯尼亚共报道684例（155例死亡），索马里报道114例（51例死亡）；2007年 坦桑尼亚报道290例（117例死亡），苏丹报道228例；2008年马达加斯加岛报道418例（7 例死亡）（WH0, 2007, 2008)。该病曾被认为仅在非洲流行，直到2000年9月沙特阿拉伯和也 门有确诊病例，该病具有向亚洲其他地区以及欧洲传播的趋势，我国应引起高度关注 [7]。
[0006] 多重PCR (multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，是根植于普通PCR技术 的一种特殊方法，可在同一 PCR反应管中同时扩增出一个或多个核酸片段，一次操作即可 完成多个靶基因的扩增，具有高效性、经济性、简便性等显著的优点。液相芯片技术是20世 纪90年代后期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术，是融流式技术、荧光微球、激 光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术 [8_9]。液相芯 片技术的出现，大大拓宽了科学研究者和医学工作者的研究空间，目前该技术已广泛应用 于临床诊断如肿瘤标志物、内分泌激素、遗传性疾病的基因诊断、组织配型的基因检测、病 原菌感染等的检测 [1°_14]。
[0007] 我国国土面积广大，地理条件复杂多样，地跨寒、温、热三带，存在多种媒介昆虫， 适宜多种虫媒病毒生存。基孔肯雅热和克里米亚-刚果出血热均在我国发生过较大规模的 暴发，同时我国具备裂谷热病毒滋生、传播的天然条件和疫情暴发的诱发条件 [15]。随着人 类活动范围的日益扩大和人员流动的日益广泛，境外虫媒病毒病传入我国的可能性显著增 力口。但上述三种病毒病的临床表现相似，且主要流行于非洲、亚洲等地区，通过简单的体温 监测及流行病学个案调查难以区分与鉴别。本研究采用多重PCR结合液相芯片技术(如图 1所示)，能一次同时检测这3种病毒，对这些病毒的监测、检测和控制研究具有重要的现实 意义。虫媒病毒的早发现、早鉴定可以提高我国防控该类传染病的能力，对保护人民的健康 和生命安全具有重要意义 [16]。


【发明内容】

[0008] 本发明将多重PCR技术和液相芯片技术有机结合，对CHIKV的E1基因、RVFV的 Polymerase L基因、CCHFV的Nucleoprotein基因联合起来检测，提供了一种相比单重PCR 技术检测而言操作步骤简化，而且成本低的检测方法，同时还充分发挥了液相芯片技术高 通量的技术优势，大大减少了工作量。
[0009] 本发明采用的技术方案是：针对CHIKV、RVFV、CCHFV三种虫媒病毒分别设计特异 性引物和探针，通过单重PCR和克隆测序，确定引物和探针的特异性；然后设计三种病毒的 特异性探针，偶联不同编号的编码微球，并通过优化多重PCR反应体系和液相芯片杂交体 系，建立了针对CHIKV、RVFV、CCHFV三种虫媒病毒液相芯片检测最佳反应条件，最后通过液 相芯片检测系统实现对三种虫媒病毒的同时检测。
[0010] 具体而言，本发明提供的一种虫媒病毒液相芯片三重检测方法，包括如下步骤： 1)设计引物并对下游引物进行生物素标记，在引物特异性验证成功后，进行虫媒病毒 多重PCR扩增，其中所述虫媒病毒为基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV)、克里米 亚-刚果出血热病毒（Crimean Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)和裂谷热病毒 (Rift Valley fever virus, RVFV)三种；其中所述PCR扩增的反应体系为：

【权利要求】
1. 虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 设计引物并对下游引物进行生物素标记，在引物特异性验证成功后，进行虫媒病毒 多重PCR扩增，其中所述虫媒病毒为基孔肯雅病毒CHIKV、克里米亚-刚果出血病毒CCHFV 和裂谷热病毒RVFV三种，其中多重PCR扩增反应体系为：
反应条件为：95 °C，10 min;94 °C，30 s，55 °C，30 s，72 °C，30 s，35 cycles;72 °C，10 min ;4°C，hold;所述混合引物为上下游引物的混合物，上下游引物的浓度比为 1:1-1:8 ;反应体系中所述模板可以为模板1、2、3种的任意一种或任意两种组合或三种； 2) 设计核酸探针并进行氨基化修饰，与荧光编码微球偶联制得微球混合液； 3) 设计偶联质控探针并加入到步骤2)得到的微球混合液进行偶联质量控制，所述偶 联质控探针序列与步骤2)所述核酸探针序列互补； 4) 将PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉 素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。
2. 根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述基孔肯 雅病毒CHIKV、裂谷热病毒RVFV和克里米亚-刚果出血热CCHF的引物序列为：
〇
3. 根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述上下游 引物的浓度比为1:8。
4. 根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述核酸探 针和偶联质控探针的序列为：
〇
5. 根据权利要求4所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述序列中 每个核酸探针的5'端加10个poly (T)，再加氨基修饰，并对偶联质控探针的5 '端进行了生 物素标记。
6. 根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤2)所述 偶联微球混合液通过如下步骤制得： 1) 随机选取带有不同编号的羧基化微球并活化； 2) 向活化微球中各加入100 pmol/μ L的氨基化修饰的核酸探针3-5 μ?，瞬时震荡； 3) 再各加3 μ?核酸偶联活化剂，S卩10 mg/mL的EDC到上述微球中，瞬时震荡； 4) 室温避光孵育30-45min; 5) 向上述微球中各加200 μ?核酸偶联洗涤液A，即0. 02%吐温-20,全速震荡5min ; 6) 12,000Xg 离心微球 lOmin; 7) 弃上清，向上述微球中加入20〇μ?核酸偶联洗涤液B，即0. 1% SDS，全速震荡5min ; 8) 12,000Xg 离心微球 lOmin; 9) 弃上清，不要触动沉淀； 10) 各加入?οομ?核酸偶联微球贮存液，全速震荡或超声波悬浮微球5min制得偶联 微球混合液。
7. 根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤3)偶联 质量控制包括如下步骤： 1) 取偶联混合微球5PL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1，即 1. 5XTMAC，稀释至 33PL ; 2) 将偶联质控探针稀释至0. Ο?μΜ的混合液，取7PL偶联质控探针混合液，加入到含上 述33PL微球混合液的1. 5mL离心管中； 3) 然后用核酸检测缓冲液2，即1. 0XTMAC，补足体积至5(^L，52°C避光孵育15min ; 4) 加入25μ?的l(^g/mL SAPE，混匀，52°C避光孵育5min，加入反应终止液5〇μ?; 5) 液相芯片系统中进行测试，判断标准：空白质控荧光信号中值小于100,偶联质控荧 光信号中值大于1〇〇〇。
8. 根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤4)所述 杂交反应步骤为： 1) 设置PCR产物上样量，分别为?μ?ν反应、3μ?ν反应、5μ?ν反应、7μ?ν反应； 2) 全速震荡重悬微球混合液约3min ; 3) 对每个样品孔和背景孔，加入微球混合液1〇μ?，然后加入33μ?核酸检测缓冲液1， 艮 Ρ 1. 5XTMAC ; 4) 对每个背景孔，加入1PL /3PL /5PL /7PL PCR blank产物； 5) 对每个样品孔，加入1PL /3μ? /5μ? /7PL PCR产物； 6) 用核酸检测缓冲液2，即1. 0XTMAC补足体积至5〇μ? ; 7) 充分混匀反应孔中的各成份； 8) 盖上盖子，防止液体蒸发，于金属加热器中进行如下反应：95°C lOmin，变性； 52°C 15min，杂交； 9) 在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2将链霉素-澡红蛋白稀释至l(^g/mL， 制备新鲜的报告液； 10) 向每个反应孔中加入25μ?的报告混合液，充分混匀； 11) 于金属加热器中52°C孵育5min ; 12) 52°C预热，加入5〇μ?终止液，混匀； 13) 依照液相芯片检测仪的操作说明进行检测，判断标准为：待测样本的荧光中值 彡250时，判断为阳性样本。
9.根据权利要求8所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述PCR产物 上样量为7uL。
【文档编号】C12Q1/68GK104120191SQ201410247111
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】李云峰, 蔡鹏 , 龙川凤, 赵亮, 葛藤 申请人:李云峰