表达生长素代谢基因iaaL的载体及其用途

表达生长素代谢基因iaaL的载体及其用途
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及表达生长素代谢基因iaaL的载体及其用途。本发明要解决的技术问题是为改良棉花的品质提供一种新选择。本发明的技术方案是表达生长素代谢基因iaaL的载体。本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。本发明还提供了所述的载体在改良棉花中的用途。利用本发明载体对棉花进行改良，能够实现棉花籽棉产量，纤维产量，种子质量以及纤维品质的明显提高。
【专利说明】表达生长素代谢基因iaaL的载体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及表达生长素代谢基因iaaL的载体及其用途。
【背景技术】
[0002]棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，棉花产业在我国的国民经济中具有举足轻重的地位。近年来，随着人民生活水平的提高和纺织技术的革新，对棉花纤维品质的要求也相应提高；尤其是近年来以气流纺纱取代环锭纺纱的技术革命，要求更长、更强、更细和更整齐的纤维。
[0003]目前我国棉花推广品种大都纤维品质偏低，长度单一，纤维强度偏低，纤维较粗，缺乏纺60支以上的高档棉纱的品种，远不能满足市场的需要。这直接导致了我国原棉在国际市场上缺乏竞争力。同时也导致了我国棉花生产近年来一直处于一种结构性矛盾的困境:一方面原棉产量逐年下降，而库存原棉仍不断增加，造成大量资金积压；另一方面进口棉花数量却不断上升。随 着我国加入世界贸易组织，我国原棉的结构性矛盾变得更为突出。能否迅速提高我国棉花品种的纤维产量和品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工业的生存与发展。
[0004]棉花的产量和品质性状为多基因控制的数量性状，且产量与品质性状之间存在遗传上的负相关。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉(纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等。这些优良性状基因的利用，却在常规育种中受到诸多限制，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺革命对纤维品质的要求。
[0005]利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，以及产量和品质(强度、细度和长度等)直接相关的基因，使得利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成的分子机理也知之甚少。这些都极大的阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。
[0006]迄今仅有少数研究在棉花纤维品质改良方面取得了进展。2009年Wang等利用在棉花中下调肌动蛋白解聚因子(GhADFl)的表达，成功提高了转基因棉花纤维长度和强度(Wang, H., et al., Down-regulation of GhADFlgene expression affects cotton fibreproperties.Plant Biotechnology Journal, 2009.7 (I):p.13-23)。向棉花中导入醋杆菌的纤维素合成的基因acsA和acsB，纤维长度和强度提高约15%，而纤维细度降低了约12% (Li, X., et al., Improvement of cotton fiber quality by transforming the acsAand acsB genes into Gossypium hirsutumL.by means of vacuum infiltration.PlantCell Reports, 2004.22(9):p.691-697)。但是，这些研究仅表明纤维品质得到了改良，产量如何未尝可知。近期，通过在纤维起始阶段的胚珠表皮特异表达来源于农杆菌的生长素合成酶基因iaaM,实现了纤维产量和马克隆值的同步改良(Zhang M, Zheng X，Song S, ZengQ, Hou L, Li D, Zhao J, Wei Y, Li X，Luo M, Xiao Y, Luo X，Zhang J, Xiang C, Pei Y (2011)Spatiotemporal manipulation of auxin biosynthesis in cotton ovule epidermalcells enhances fiber yield and quality.Nat Biotechnol29:453-458)。尽管这是在基因工程改良棉花纤维产量和品质的重大突破，但该转基因棉花在总产量，纤维长度、强度等方面均和野生型无明显差别。尚有待寻求新的改良方案。
[0007]植物激素是植物体内重要的信号物质，调控了几乎所有组织器官的发育进程。在棉花纤维的发育中也有它们的参与。其中就包括重要的植物激素生长素，它主要以吲哚乙酸的形式存在于植物体内。目前研究发现，生长素是促进离体培养的胚珠产生纤维的重要激素(Beasley, C.A., Hormonal regulation of growth in unfertilized cottonovules.Science, 1973.179(4077):p.1003-1005)。在纤维从胚珠表皮分化起始的时候，细胞中会聚集高浓度的生长素，这对纤维细胞的大量产生有促进作用(Zhang, Μ.，etal., Spatiotemporal manipulation of auxin biosynthesis in cotton ovule epidermalcells enhances fiber yield and quality.Nature Biotechnology, 2011.29(5):p.453-458)。此外，纤维大量合成纤维素的时候，细胞中生长素含量也会明显提高。这些都表明生长素是调控纤维发育过程中的重要作用(Yang, Y.，et al., Effects of plant growthregulators on secondary wall thickening of cotton fibres.Plant Growth Regulation, 2001.35(3):p.233-237) ?不仅如此，由于纤维细胞着生于胚珠(种子)表面，是其一部分。纤维细胞和植物主体间的大量物质和能量的交换势必依赖于胚珠进行。因此，胚珠发育的优劣直接关系着纤维发育的状况，影响其产量和品质。大量的研究已经表明，生长素在调控胚珠发育过程中发挥着重要作用(Perrot-Rechenmann, C., R.M.Napier, andL.Gerald, Auxins, in Vitamins&Hormones.2005, Academic Press.p.203-233)。
[0008]尽管如此，利用调控生长素水平改良棉花纤维品质的尝试并非水到渠成。早在1999年John ME就在纤维中分别特异控制生长素IAA生物合成的两个酶基因iaaM和iaaH表达，实现了纤维细胞中生长素含量的大幅上调(高于野生型2-8倍)，但纤维品质却无显著改良(Basra AS 等，1999，Cotton Fiber, New York:Food Products Press, 271-292)。直到2011年，zhang等才利用胚珠表皮特异启动子调控iaaM基因的表达实现了纤维产量和细度的同步改良(Zhang, M.，et al., Spatiotemporal manipulation of auxin biosynthesisin cotton ovule epidermal cells enhances fiber yield and quality.Nature Biotechnology, 2011.29(5):p.453-458)。这表明了在调控棉花纤维过程中生长素水平适时、适地、适度调控的重要性，也表明启动子的选择在利用植物激素基因工程改良棉花品种中的显著作用。同时也可以看到单纯利用胚珠表皮特异调控生长素水平的在改良棉花品种方面的局限，种子减小，不能提高总产量，对除马克隆值以外的纤维品质性状无明显改良效果等。这些都有待新的基因工程改良方法予以解决。

【发明内容】

[0009]本发明要解决的技术问题是为改良棉花的品质提供一种新选择。
[0010]本发明的技术方案是表达生长素代谢基因iaaL的载体。[0011]具体的，所述的载体为植物表达载体。
[0012]具体的，所述的生长素代谢基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]具体的，所述的生长素代谢基因在AtALP启动子的介导下表达。
[0014]具体的,所述AtALP启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。
[0016]本发明还提供了所述的载体在改良棉花中的用途。
[0017]本发明还提供了所述的载体在改良棉花种子中的用途。
[0018]本发明还提供了所述的载体在改良棉花纤维中的用途。
[0019]本发明还提供了所述的载体在提高棉花产量中的用途。
[0020]本发明的有益效果: [0021]利用本发明载体对棉花进行改良，产量性状表现为总产量提高、纤维产量提高、子指(百粒种子重)增大、衣指(百粒纤维重)提高；纤维品质性状表现为纤维长度增加、强度提高，同时马克隆值略有下降。本发明通过对生长素代谢基因在棉花中的特异调控，能够实现棉花籽棉产量，纤维产量，种子质量的明显提高。同时，纤维长度、强度提高，马克隆值降低，纤维品质得到明显改良。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1:植物表达载体构建路线。
[0023]植物表达载体p5是从常用植物表达载体PBI121改造获得的一个双元载体，在其右边界(RB)附近有组成型启动子CaMV35S控制的标记基因NPT II和报告基因⑶S的融合基因，以及Nos终止子序列。在其左边界(LB)附近有组成型启动子CaMV35S和polyA(具有转录终止的作用)。本发明的载体是将AtALP启动子(pAtALP)调控下的iaaM基因表达元件替换掉其左边界附近的组成型启动子CaMV35S。
[0024]图2:AtALP::1aaL转基因棉花iaaL基因的PCR鉴定结果；M:Marker2000 ;1~7分别为转基因棉花不同单株；NG:野生型gDNA为模板的扩增对照。
[0025]图3: At ALP::1aaL转基因棉花开花当天胚珠中iaaL的表达量,纵坐标表示表达量;WT:野生型；AL4 =AtALP::1aaL转基因棉花4号转化子。
[0026]图4 =AtAlp::1aaL转基因棉花和野生型种子比较；WT:野生型；AL4 =AtALP::1aaL转基因棉花4号转化子。
【具体实施方式】
[0027]以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
[0028]本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售。材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell, 2001)。
[0029]实施例1本发明载体的构建
[0030]1.1基因组DNA的提取
[0031]取棉花叶片0.5-1.0g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL65°C预热的CTAB提取液(IOOmmoI/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2 % CTAB(ff/V),4%PVP40 (ff/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀。65°C水浴30min,然后加入lmL5mol/L KAc,冰浴20min后,用等体积的氯仿:异戍醇(24:1)抽提I次(10，000r/min，4°C离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的_20°C预冷异丙醇，混匀，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75%的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗I次，吹干，重悬于 500 μ L TE 中。加入 I μ L RNaseA (10mg/mL)，37°C处理 Ih0 再用酚(ρΗ8.0):氯仿:异戍醇(25:24:1)和氯仿:异戍醇(24:1)各抽提I次(10, OOOr/min,4?离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75%的乙醇漂洗，风干，溶于200 μ L TE中，_20°C保存备用。
[0032]1.2基因组序列的PCR扩增
[0033]扩增体系(25μ L)如 T:10XEx PCR buffer (Mg2+free) 2.5 μ L, 2.5mmol/LdNTPs2y L,25mmol/L MgC122yL，引物 I (5 μ mol/L) I μ L，弓丨物 2 (5 μ mol/L) I μ L，Ex TaqDNA聚合酶IU，基因组DNA约60ng，补ddH20至25 μ L。
[0034]扩增程序为:94°C，5min;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，1.5min，35 个循环；72°C延伸IOrnin0 [0035]1.3特异启动子(AtALP)的获得
[0036]根据拟南芥铝诱导蛋白(AtALP，GenBank登录号:At5gl9140)，设计引物(SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.4)，从拟南芥基因组中PCR扩增获得一个1900bp左右的片段(见序列SEQ ID N0.1)，即得到AtALP启动子，来源于拟南芥。主要茎和叶中表达，在果实中表达较低，并且受生长素诱导。
[0037]基因组DNA提取及扩增可参照前述1.1和1.2。
[0038]SEQ ID N0.3:AtALP 启动子克隆、构建用上游引物 cccgggtagtattctttctttacatttccagttg
[0039]SEQ ID N0.4 =AtALP 启动子克隆、构建用下游引物 ggtacctttctctctctcctccggtg
[0040]SEQ ID N0.1 =AtALP启动子，来源于拟南芥。主要茎和叶中表达，在果实中表达较低，并且受生长素诱导。
[0041]
【权利要求】
1.表达生长素代谢基因iaaL的载体。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于:所述的载体为植物表达载体。
3.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于:所述的生长素代谢基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
4.如权利要求1~3任一项所述的载体，其特征在于:所述的生长素代谢基因在AtALP启动子的介导下表达。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于:所述AtALP启动子的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
6.含有权利要求1~5任一项所述载体的宿主细胞。
7.权利要求1~5任一项所述的载体在改良棉花性状中的用途。
8.权利要求1~5任一项所述的载体在改良棉花种子中的用途。
9.权利要求1~5任一项所述的载体在改良棉花纤维中的用途。
10.权利要求1~5任一项所述的载体在 提高棉花产量中的用途。
【文档编号】C12N15/84GK103981217SQ201410246979
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】张觅, 裴炎, 李德谋, 宋水清, 赵娟, 李改玲, 唐静, 李先碧 申请人:西南大学