专利名称：生长素输入载体aux1/lax家族基因在玉米和高粱育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属农作物的生物工程育种领域，涉及一种通过构建融合基因及转基因改变玉米和高粱性状的方案的应用，具体说，涉及生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米和高粱育种中的应用。
背景技术：
植物基因工程的发展依赖于具有不同功能基因的应用。生长素在植物生长发育中起重要作用，通过生长素合成、转运、代谢及相关的信号转导基因的表达修饰有可能对植物的生长发育产生重要影响。生长素在植物幼嫩部分或分裂旺盛的组织中合成，通过其特有的运输方式到达作用部位，在植物生长发育的多个过程中起重要作用。生长素在植物组织内的差异分布影响多个发育过程，不同环境信号和内源信号能够通过生长素的局部合成和细胞间转运影响生长素分布变化。IAA是多数植物中生长素的主要形式。在不少系统中低浓度生长素促进细胞伸长与分裂，而高浓度的生长素则抑制细胞的分裂与伸长。生长素信号促进了细胞分裂素抑制蛋白的表达，而细胞分裂素诱导了生长素信号抑制蛋白。在植物激素中生长素具有最明显的促进不定根和侧根发生及生长作用， 参与根毛发育、初生根生长、侧根原基形成和根的向重力性反应，乙烯通过调控生长素的代谢起一定作用(Pitts et al,1998 ；Rahman et al，2002)。生长素和细胞分裂素的相互作用调控胚根形成和侧根发生的决定。生长素在细胞间活跃转运创建局部最大浓度，从而调控许多发育事件的起始和进程。植物组织内的生长素浓度梯度包括生长素在细胞内和细胞间的不均勻分布。细胞的生长素浓度可在合成、钝化、活化、分解和细胞间的极性转运多个层面上调节。并且这些不同层面的调节在不同物种、不同发育时期均起重要作用。在植物根尖生长点中，生长素的极性运输和局部合成促成了在静止中心(即干细胞组织中心)部位形成所谓“生长素积累高峰”，对于静止中心的建立和维持起至关重要的作用。侧根器官发生(Dubrovsky等，2008)显示了生长素最大浓度与发育编程调整和器官起始在时空上具有对应关系，遗传或药物干扰生长素的差异分布和响应过程阻碍了生长素梯度存在时出现的发育事件。另外，生长素差异分布似乎足以启动发育过程。生长素微量应用到茎尖分生组织的精巧试验表明局部增加生长素浓度足以启动和完成叶或花的发育 (Reinhardt et al.，2003)。生长素在给定细胞积累能修饰它的发育程序，即生长素积累的时间和位置决定了发育程序改编的时间和位置。在中柱鞘细胞中随机刺激引起的细胞生长素合成的增加，提高了局部生长素浓度，引起这些感受态细胞起始侧根发生。植物体存在两种不同的生长素运输途径韧皮部运输和皮层中载体介导的极性运输。在韧皮部运输系统中，生长素的运输与其它营养物质的运输没有根本区别；而极性运输则是生长素所特有的一类从细胞到细胞的主动运输，依赖于膜定位的载体和能量消耗 (Lomax等，1995)，运输速度也比维管系统运输速度较慢，一般为5_20mm/h。生长素在组织中的极性运输很大程度上归功于高度调控、极性定位的输入、输出载体蛋白。极性运输使生长素在植株体内形成以器官顶端为中心的浓度梯度，并维持不同组织中的生长素浓度差， 实现植物发育的调控。且生长素信号和生长素极性转运之间存在着正反馈调节(Vieten 等，2005)。介导生长素极性运输的蛋白有AUX1/LAX家族、PIN-formed家族、ABCB家族蛋白寸。生长素进入细胞可通过被动扩散和质膜上极性分布的生长素输入载体(auxin influx carrier)介导的两种方式完成。由输入载体介导的生长素流入细胞可以使生长素逆浓度梯度运输，也可以防止生长素被动扩散入邻近细胞中，从而保证了不同细胞和组织中生长素浓度与分布适宜。AUX1/LAX家族参与生长素极性转运，它们介导生长素流入细胞。拟南芥AUXl是首个发现的生长素输入载体，其突变导致生长素极性运输受阻、根对生长素的敏感性下降、根向地性丧失和叶序排列无序。拟南芥基因组编码4个生长素输入载体 AUXl (auxin resistant 1)、LAXl、LAX2 和 LAX3 (Kramer，2004)。AUXl 是首个发现的输入载体。AUXl是由485个氨基酸残基组成的具有通透酶性质的蛋白质，推测其有11个跨膜区域(Marchant等，2002)。AUXl与其它3个LAX氨基酸序列的相似性为73% 82%。它们都具有生长素输入载体的功能。水稻含有4个可能的生长素流入载体，命名为Os auxin transporter protein 1、 Os auxin transporter protein 2、 Os auxin transporter protein 3、Os auxin transporter protein 4。从玉米中克隆的 ZmA UXl 基因与拟南芥 AUXl相比，在氨基酸序列的相似性为81%，据报道在萌发12天玉米小苗的初生根、冠根、 种子根和侧根的根尖(根尖Icm切段)中表达丰度高，而在根系较上区段几乎检测不到该基因表达。原位杂交显示ZmAUXl在根尖的表皮细胞、中柱鞘和内皮层细胞中表达丰度高 (.Hochholdinger等，2000)。申请人通过对玉米、水稻、拟南芥的生长素输入载体的系统比较与分析，发现 ZmAUXl 与拟南芥 auxintransporter 2 禾P3、/K稻中 Os auxin transporter 3的相似性高，且在氨基酸组成、肽链长度和等电点、分子量上更为接近，应命名为Sii auxin transporter protein 3。为了方便叙述，在该说明书中仍称其为ZmAUXl。植物的抗逆境特性和无机养分的吸收能力大部分与根系形态和生理特性直接相关。通过生长素浓度和极性分布的调节有望实现1)提高作物对肥料的利用率，节省生产成本并减少环境污染；2)提高根系对水分的利用率，增加干旱地区作物产量；3)提高作物抵抗盐渍化的能力，增加盐渍耕地中作物产量；幻创造高产、优质抗倒伏作物品种。
发明内容
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一个通过转AUX1/LAX家族基因产生生长素浓度梯度发生变化从而引起植株根系性状、株高和抗倒性发生改变的转基因玉米和高粱，后者用于玉米、高粱的遗传改良。本发明所述的AUX1/LAX家族基因包括从不同高等植物中克隆的与拟南芥UXl/ LAX家族的多肽序列相近或相同的蛋白基因，也包括人工合成或由不同序列重组的多聚核苷酸序列，即序列和功能相近或相同的编码蛋白基因或其RNAi结构。本发明所述的基因应用包括以完整和部分cDNA基因形式、完整和部分基因组基因形式、和它们的RNAi结构形式。本发明所述是将从高等植物如拟南芥、水稻、玉米中克隆AUX1/LAX家族基因成员的全长或部分序列分别重组到中间质粒中构建融合基因，然后将融合基因插入到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行性状鉴定，从中筛选出目标性状明显改变的转基因植株及其后代，创造出在作物育种中具有应用前景的新种质和新品种。其中，所述用于构建融合基因的AUX1/LAX家族基因的全长序列可以为cDNA序列， 也可以为基因组序列，也可是人工合成的与AUX1/LAX家族基因序列一致或相近DNA片段。 所述的AUX1/LAX家族基因来自高等植物，如拟南芥、水稻、普通栽培玉米和玉蜀黍属的玉米近缘种或亚种，可来自高粱和苏丹草，也可是人工合成的与AUX1/LAX家族基因序列一致或相近DNA片段。其中，所述的ZmAUXl的全长序列来自普通栽培玉米和玉蜀黍属的玉米近缘种或亚种，也可是人工合成的序列一致和相近DNA片段。其中，构建融合基因所用的启动子可为根特异性启动子，也可为茎、果穗、雄穗特异性启动子，以及诱导型启动子。本发明所说的融合基因由启动子序列和目标基因编码序列、植物基因的3'尾巴区构成。融合基因能在植物细胞中有效表达。本发明克隆出的AUX1/LAX家族基因可单独或联合重组到建植物表达载体中，再由后者将目标基因转入优良基因型的玉米和高粱，获得农艺性状发生改变的转基因玉米和高粱。本发明产生的转AUX1/LAX家族基因的玉米和高粱可单独利用，也可以通过转基因植株之间的杂交后获得兼有2 3个转基因的植株进行利用。AUX1/LAX家族基因的鉴别、克隆和植物表达载体的构建通过全基因组和cDNA文库的筛查和序列拼接，结合利用AtAUXl基因序列进行相似性比较，在玉米和水稻中分别鉴定出4个AUX1/LAX家族基因。采用通过常规克隆技术从供体植物中克隆出目标基因，通过测序进行确定。若从基因组测序未完成的物种克隆AUXl/ LAX家族基因，则通过同源序列的利用寻找和克隆出目标基因。在本发明中，将从玉米或水稻中克隆的AUX1/LAX家族基因，以全长或部分序列形式、或以RNAi结构形式与启动子融合，产生融合基因(目标基因可以正义或反义形式与启动子相连)。根据工程植株所需的性状，将选择的从不同高等植物中克隆的AUX1/LAX基因与选定的广谱性或组织特异性或诱导特异性表达的启动子融合，产生不同的AUX1/LAX融合基因。然后采用常规技术将融合基因插入到植物表达载体中。采用转基因技术将融合基因导入植物细胞，获得转基因植株。以 pCAMBIA1300-Pubi: :AUXl/LAX-Tnos-P;35S: :EPSP 质粒构建为例，扼要阐述植物表达载体的构建过程。AUX1/LAX基因用玉米泛素蛋白启动子Pubi启动，筛选标记基因为除草剂草甘膦抗性基因EPSP，后者由花椰菜花叶病毒35S RNA启动子P35S启动。植物表达载体构建路线为首先，连有外源基因的pT-easy-AUXl/LAX和中间载体ρ⑶NA3分别通过限制酶酶切，回收AUX1/LAX片段和载体片段，经脱磷和连接，将AUX1/LAX基因插入到pCDNA3 中。连接正确的质粒经Mc I酶切，回收加有Mc I酶切位点的融合基因片段，然后插入到植物表达载体？(诎(口0六1^认1300- 111^::]\ ^-111108-；355: :EPSP)中。重组子通过 Xho I+Not I或Hind III+BamHI双酶切鉴定融合基因插入方向。AUX1/LAX基因可以正、反义形式插入到植物表达载体PCUE中。从含有重组质粒的大肠杆菌提取质粒DNA并纯化，利用液氮速冻法转化农杆菌LBA4404和EHA105中。转化产生的农杆菌菌落采用PCR法鉴定，然后用于农杆菌介导的玉米、高粱的遗传转化。转基因植株的获得和鉴定通过遗传转化转化法将构建的植物表达载体导入到玉米和高粱优良基因型中，获得转化植株。在采用无菌苗茎尖转化方法时，将T0-T2转化体植株在三叶期进行除草剂筛选。若以除草剂草甘膦为筛选剂，浓度为1.25 1.5%。在除草剂喷后12 15d，统计植株除草剂抗、感程度。由于高浓度草甘膦引起玉米叶片发黄死亡，可根据发黄死亡程度将植株分为I、II、III、IV级，I级抗性最强。将抗性为I级或II级的Tl和T2代植株移栽到大田套袋自交，收获子代种子，同时进行PCR检测。经除草剂筛选和PCR检测，选择除草剂抗性强和PCR阳性的植株移栽至大田收获下一代种子，淘汰除草剂敏感株系。根据除草剂抗性和PCR检测结果，从T3代挑选出转基因纯合系(Tl和/或T2代呈现孟德尔分离比例，T3 植株除草剂抗性无分离)用于植株性状观察和生理学测定。将T3代PCR阳性株系的种子萌发4天，取幼叶(包括芽鞘)和幼根进行 Real-time RT-PCR检测。通过转基因植株Real-time RT-PCR检测，筛选出目标基因表达强度与对照植株有显著差异的转基因纯合株系。若以玉米自交系齐319为受体，以目标基因正义质粒pCAMBIA1300-Pubi: :AUX1/LAX(+)-Tnos-P35S: :EPSP和目标基因反义质粒 pCAMBIA1300-Pubi: :AUX1/LAX(-) -Tnos-P35S: :EPSP分别为转化载体进行遗传转化和后代筛选及鉴定。在18个目标基因正义质粒产生的独立转化体的T3代株系中，幼叶的ZmAUXl 的表达丰度约是根的5倍。在不同转基因株系中，ZmAUXl基因表达丰度与齐319的相比有不同程度的提高，多数株系的ZmAUXl表达量是对照齐319植株的1. 67 2. 3倍。而在转反义基因株系中，ZmAUXl的表达丰度有不同幅度的下降，在多数株系中ZmAUXl表达量是对照齐319植株的60%左右。转ZmAUXl正、反义基因玉米植株的表型分析将未转基因对照株系和不同转基因株系的种子播于大小一致、蛭石含量相等的无盖大箱里。3叶期定苗，隔天浇灌1/2MS营养液。转基因植株与对照植株地上部分形态与生长速率与对照植株差别不大。玉米长至6叶期时，用自来水洗去蛭石，轻轻分离出根系，转正义基因植株根系发达，表现在种子根长度和侧根数目较对照植株增多，生物量测定结果与形态观察结果一致，根冠比比对照增加，根系干重是对照植株的120 150%。转反义基因植株根系和对照相近或略有减小，但部分株系地上部生物量有一定增加。将T3代转基因植株和对照植株在足磷营养液中培养至V6期，分别测量它们的根长度、根数目、茎叶和根系的生物量。在足磷营养液中转正义ZmAUXl株系玉米具有较发达的根系，与对照植株和反义植株相比，冠根数和种子根数虽无明显差异，但具有更多的侧根。转正义基因株系的侧根总数比对照植株增加55% 101%，因株系而异。在4个转反义基因株系中，除一个株系植株的侧根数少于对照植株外，其余在根数目及组成上与对照植株相差不大。测定根系长度得出，转正义基因株系的初生根、种子根和侧根的长度均比对照植株和反义株系的显著增加，总根长比对照增加44% 96% ；而4个转反义基因株系的根总长是对照株系的95. 9 115%，即与对照差异较小。将T3代转基因植株和对照植株在缺磷营养液中培养至V6期，分别测量转基因和对照植株的根长度、根数目、茎叶和根系的生物量。在低磷培养条件下，所有株系的根数目和根长度都比在足磷营养液中培养有较大增加，其中种子根的长度增加尤为明显。比较转基因植株与对照植株的根系形态参数发现，在缺磷营养液中转正义基因植株具有比对照更发达的根系，虽在冠根数和种子根数上与对照植株及转反义基因植株的差异不显著，但转正义基因植株具有较多的侧根，且着生在冠根、初生根、种子根上的侧根数均比对照和转反义基因植株的多。转正义基因植株的侧根总数是对照植株的112 152%。在4个转反义基因株系中，除一个株系的侧根数少于对照植株外，其余在根数目及组成上与对照植株相差不大。在根长度上，转正义基因株系的初生根、种子根和侧根的长度均比对照植株和反义植株有增加，总根长是对照的193 221%。4个反义株系总根长则是对照株系的83%左右ο不同供磷水平下V6期玉米生物量测定结果表明，转正义ZmAUXl基因促进了植株根系发育，增加了植株根冠比，这与蛭石培养条件下的结果是一致的。当植株在缺磷营养液中处理8天，虽明显影响了碳水化合物向根茎的分配比例，影响了根冠比，即低磷胁迫处理促进了根系发育，减慢了根系生长，但对植株生物量影响不大。检测种子萌发4天产生小苗的幼叶(包括芽鞘)和根的生长素极性运输相关基因的表达水平，发现在转基因株系和对照植株的地上、地下部分，过表达ZmAUXl的株系中生长素流出载体Pmi家族基因的表达量都有所提高，这可能是生长素流入增加导致细胞产生的适应性变化，通过加速生长素的运出以维持细胞正常水平的生长素浓度，从而维持植物体内的生长素浓度梯度。而细胞内膜定位的几个PIN-Iike基因的表达量没有明显差异。 这些基因的变化情况表明生长素浓度及信号对生长素极性转运相关基因的表达有反馈调节的作用，在一定程度上会影响转基因的作用。但增加了的生长素流入流出势必造成生长素在“库”和“源”之间分配比例的变化，这些都会对根系的生长发育和对低磷胁迫的反应造成一定的影响。从根系发达的转基因株系中选择农艺性状优良的株系用于玉米、高粱等作物的新品种培育。
具体实施例方式实施例1 转Os auxin transporterprotein 3基因创造根系发达的玉米自交系转Os auxin transporter protein 3基因旨在是该基因在玉米根部特异表达， 因此，需要与根特异表达的启动子构建融合基因。大麦磷转运体1基因在根中特异性表达且受低磷胁迫诱导，因此，采用PCR方法将其启动子部分(GenBank accession number AFM3197中ATG密码子5，上游的84;3bp，非全长)从大麦基因组中扩增出，命名为I^rsp。 经测序验正后将其重组到中间载体P⑶NA3中。然后利用Hind III和)(bal I酶切位点将该启动子定向重组到植物表达载体PCPE中，得到质粒pCAMBIA-Prsp: :MCS-Tnos-P35S: :EPSP (pRPE)。该载体含有由P35S启动的除草剂草甘膦抗性基因EPSP，即筛选标记基因，含有
启动的目的基因插盒。构建好的植物表达载体PRPE用于Os auxin transporterprotein3 基因的植物表达载体的构建。受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、 DH4866等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。 所用培养基有
种子萌发培养基:KN031 900mg/l, NH4N03 1650mg/l, CaCl2 · 2H20 440mg/ 1，MgSO4 · 7H20 370mg/l, KH2PO4 · H2O 170mg/l, FeSO4 · 7H20 27. 8mg/l, ZnSO4 · 7H20 10mg/l, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/l, H3BO3 10mg/l, KI 0. 83mg/l, Na2MoO4 · 2H20 0. 5mg/l, CuSO4 · 5H200. 025mg/l，CoCl2 · 6H20 0. 025mg/l，盐酸硫胺素 10. Omg/1，盐酸吡哆醇 1. Omg/ 1，烟酸1. Omg/1，甘氨酸2. Omg/1，肌醇100. Omg/1，生物素0. 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/ 1，蔗糖30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5. 8 6. O。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。A培养基种子萌发培养基附加6-BA 4. 5 9. O μ mol/1禾Π 2，4_D 1· O 3. O μ mol/1，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。B培养基种子萌发培养基附加6-BA 4. 5 μ mol/1和IBA (吲哚丁酸)1. 8 μ mol/1， 用于丛生芽组织块分化小苗。成苗培养基种子萌发培养基附加6-BA 2. 25 μ mol/1和IBA 3. 6 μ mol/1，用于丛生小芽发育成小苗。生根培养基种子萌发培养基附加IBA 2. 8 3. 6 μ mol/1，用于无根小苗生根。基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。种子灭菌和萌发玉米种子用70 %乙醇浸泡10分钟，再用0. 1 %氯化汞浸泡 10-15分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30—40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23—30°C )下1一2 天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化萌发种子的胚芽伸长止3—5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下 (24-270C )培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3. O μ mol/1 ；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为Ι.ΟμπιοΙ/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5-6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生将带有双元载体(Mini—Ti质粒带有选择剂抗性基因和I^rsp Os auxin transporter protein 3基因)的根瘤农杆菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB 培养基(每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中
下震荡培养，震荡速率为IlOrpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm 下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone， As) 100 μ mol/1的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5—20倍用于转化。
取继代后培养13-20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime) 250mg/l或羧苄青霉素(Carb) 500mg/l的培养基上于黑暗中培养7—12 天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂草甘膦0. 04%的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-30001χ，光照14_15小时/天。 小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40%的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温 22-280C，夜温15-21°C，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。转基因植株的抗性检测和选择利用取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。而后将转基因植株 (TO)套袋自交结实。将来自不同TO植株的Tl种子播在温室或具有防护设施的田间，出苗后取叶片进行转基因PCR检测。对入选植株进行Southern blotting验证，并采用RT-PCR 技术检查转基因表达强度。Tl代筛选出的植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定、测定株高及各节间长度、观测根系和其它主要的农艺性状并优先植株自交留种。将T3代转Os auxin transporter protein 3基因植株和对照植株在不同供磷水平的营养液中培养至V6期，分别测量转基因和对照植株的根长度、根数目，测定茎叶和根系的生物量。当植株在低磷营养液中生长时，对照植株的根数目下降，为足磷培养下的 88%。比较各株系对低磷胁迫的反应，发现转基因植株都表现出对低磷胁迫的敏感性降低，侧根数、总根数和足磷培养液中生长的植株相差不大或相对较高。这一现象在植株生物量的变化中也存在。汇总连续三代的观察统计资料得出，当向玉米骨干自交系引入玉米 Os auxintransporter protein 3基因时，植株形态尤其是根系性状发生了变化，过表达Os auxin transporter protein 3增加了侧根数目、促进了初生根的伸长，但对株高等农艺性状无明显影响。实施例2 转ZmAUXl基因改变高粱的株型转ZmAUXl基因的目的在于适当降低高粱株高或拉开植株上部节间并促进根系发育，因此，首先需要ZmAUXl基因的编码区或其RNAi结构与特异表达的启动子连接形成融合基因，再利用适宜的载体将融合基因导入高粱细胞，从转基因植株后代中选择具有目标性状的材料。1.依据Ming-Bo Wang等报道的水稻蔗糖合成酶_1 (Rk-I)启动子序列(Plant Molecular Biology 19:881-885,1992.)设计引物，以高质量水稻基因组DNA为模板， 采用PCR方法扩增出水稻蔗糖合成酶-1启动子冊^-1，该启动子长约1.71Λ，启动基因在植物韧皮部特异表达。克隆出的启动子片段经测序确定后，与ZmAUXl的开放读码框及3’尾区连接，构建出融合基因H^s-1: :ZmAUXl。再将后者重组到植物中间表达载体 ρ⑶NA中。该载体含有由P35S启动的bar基因，即筛选标记基因。构建好的植物表达载体ρ⑶NA-PRSs-I ZmAUXl转入根瘤农杆菌用于高粱遗传转化。2.高粱无菌苗获得高粱优良自交系或品种的种子，用70%乙醇浸泡4分钟，再用0. 氯化汞浸泡8 分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3厘米左右时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。3.农杆菌培养及活化将带有双元载体(Mini-Ti质粒为pCDNA-PRSs-l :ZmAUXl，带有除草剂抗性基因 bar和H^s-1: ZmAUXl融合基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB 培养基中下震荡培养，震荡速率为llOr/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/ min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加 100 μ mol/1乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5_20倍用于转化。4.高粱无菌苗转化(1)将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大气压下处理8-12分钟。(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸轻轻吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24°C。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。(3)将光照培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温2218°C，夜温15-21°C，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。5.转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂Finale (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9. 6ml_12. 8ml Finale"/L，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时， 将其定植到田间，套袋自交结籽。6.转基因植株子代分析Tl代植株长到3叶期用12. 8ml Finale"/!水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因，并进行 Southern blotting验证，采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株不同节间的长度和叶片大小的变化，测定3-7叶期小苗生长速率、根冠比和单株生物量，观察根系变化和抗逆性状的变化，并以未转基因植株为对照。选出株高和节间长度发生变化且不定根增多转基因株系在大田栽培条件下进行高粱产量性状的观测和比较，选择高产抗倒株系进入生物安全性试验和高粱育种实验。
权利要求
1.生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用，其特征是，从高等植物中克隆出AUX1/LAX家族基因，与不同启动子融合用于玉米或高粱转基因，产生长素浓度梯度和植株性状发生改变的工程植株及其后代。
2.如权利要求1所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用， 其特征是，所述AUX1/LAX家族基因克隆于拟南芥、水稻、玉米或大麦。
3.如权利要求1所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用， 其特征是，克隆出AUX1/LAX家族基因通过与不同启动子连接形成融合基因，利用启动子控制转基因的表达特异性和表达强度。
4.如权利要求1所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用， 其特征是，融合基因用于玉米、高粱转基因，不同AUX1/LAX基因可单独或联合转入受体植物，产生生长素浓度梯度发生改变的转基因植株。
5.如权利要求1所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用， 其特征是，转基因植株及其后代通过筛选和测定，选出遗传稳定且目标性状显明改变的株系用于玉米、高粱的遗传改良。
6.如权利要求1和2所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用，其特征是，AUX1/LAX家族成员来自于从普通栽培玉米、玉米近缘种或亚种、水稻或拟南芥。
7.如权利要求1和6所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用，其特征是，所述的AUX1/LAX家族基因是完整或部分cDNA基因形式，完整或部分基因组基因形式，或它们的RNAi结构。
8.如权利要求1或3所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用，其特征是，选用的启动子是广谱性的、根特异性的、茎特异性的、果穗特异性的或诱导型的。
9.如权利要求1或8所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用，其特征是，从水稻中克隆出Os auxin transporter protein 3基因，将它们分别与根特异表达的启动子I^rsp融合，重组到植物表达载体中转入玉米，获得根系发达、耐低磷特性的转基因株系，用于玉米育种。
10.如权利要求1或8所述生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米或高粱育种中的应用，其特征是，从玉米中克隆出ZmAUXl基因，将它与维管束特异表达的启动子H^s-I融合，转入高粱优良品种中，获得根系发达、株高降低的转基因株，用于高粱育种。
全文摘要
本发明公开生长素输入载体AUX1/LAX家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是，从不同高等植物中克隆出AUX1/LAX家族基因的不同成员，通过分别与不同启动子连接构建融合基因，采用转基因技术将重组基因导入玉米、高粱细胞，获得转基因植株及其后代，筛选植株性状发生改变的工程植株，创造出在玉米、高粱育种中具有应用前景的新种质。
文档编号A01H5/00GK102492718SQ20111037699
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者张举仁, 张新蕊, 李朝霞 申请人:山东大学