专利名称：类胡萝卜素合成相关基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物学领域，具体地说，本发明涉及类胡萝卜素合成相关基因及其应用，具体地涉及CYP97A4基因，该基因参与植物在强光胁迫条件下的光保护、捕光复合物II的三聚体装配及稳定等作用。本发明还公开了所述基因及其所编码的蛋白酶的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中用于改变植物的光保护性质。
背景技术：
类胡萝卜素属于四萜化合物，在自然界中广泛存在于光能自养生物。类胡萝卜素包括胡萝卜素和叶黄素两大类，前者是只含有碳和氢原子的多烯烃，后者是前者的含氧衍生物。根据含量的高低，植物叶片中主要的类胡萝卜素成分是叶黄质(lutein)，β-胡萝卜素(β-carotene)、紫黄素(violaxanthin)与新黄素(neoxanthin)。其中，叶黄质(Lutein)作为叶片器官中含量最高的类胡萝卜素，对于光合系统捕光复合体亚基的装配、稳定型维持以及光保护起到非常重要的作用。由于类胡萝卜素种类的多样性与复杂性，多种多样的蛋白酶参与到合成代谢与分解代谢中。因此，为了有效地、有针对性地改变植物品种，本领域迫切需要开发与类胡萝卜素合成有关的编码基因、蛋白及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与类胡萝卜素合成相关的基因及其应用。本发明的另一目的是提供所述基因编码的多肽及其用途。本发明的另一目的是提供一种改变植物中类胡萝卜素组成成分的比例或含量、或提高植物抗强光胁迫的能力的方 法。在本发明的第一方面，提供了一种分离的CYP97A4多肽或其编码基因的用途，所述用途任选自下组:(I)所述CYP97A4多肽或基因用于催化β，ε -类胡萝卜素的β _环的羟化反应；和/或(2)所述CYP97A4多肽或基因用于改变植物中类胡萝卜素组成成分的比例或含量；和/或(3)所述CYP97A4多肽或基因用于提高植物抗强光胁迫的能力。 在另一优选例中，所述的CYP97A4多肽选自下组:⑴具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(ii)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或几个(如1_10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有催化类胡萝卜素β_环的羟化反应功能的由(i)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的CYP97A4多肽的编码序列选自下组:(I)编码如SEQ ID NO:2所述多肽的多核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；(3)与(I)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。在本发明的第二方面，提供了一种提高植物抗高光胁迫能力，或提高植物捕光色素复合体II三聚体的装配及稳定能力的方法，所述方法包括:提高所述植物中CYP97A4多肽的表达或活性。在另一优选例中，所述的抗高光胁迫能力为抗光氧化胁迫的能力。 在另一优选例中，所述方法包括:(I)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有CYP97A4多肽的编码序列；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使表达CYP97A4多肽的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择已转入CYP97A4多肽编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。在另一优选例中，所述植物选自下组:水稻、大麦、玉米、杨树、大豆，或葡萄。在本发明的第三方面，提供了一种提高植物中β，ε -类胡萝卜素与β，β-类胡萝卜素比例和含量的方法，所述方法包括:降低植物CYP97A4多肽的表达或活性。在本发明的第四方面，提供了一种提高植物中α -胡萝卜素或α -隐黄质的含量的方法，所述方法包括:降低植物中CYP97A4多肽的表达或活性。在另一优选例中，所述方法为:特异性敲除或干扰CYP97A4多肽的编码基因的表达；或特异性的抑制CYP97A4多肽的活性。在另一优选例中，特异性敲除或干扰CYP97A4多肽编码基因的表达方式选自下组:RNA干扰法，MiRNA调控法，siRNA调控法，或其组合。 在另一优选例中，特异性抑制CYP97A4多肽的活性方法包括:表达CYP97A4的抗体或配体。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图1显示水稻CYP97A4-YFP蛋白荧光(图1A左图)与叶绿体自发荧光(图1B左图)完全重叠(图1B右图)，表明CYP97A4特异性定位在叶绿体内，图1A是35S::CYP97A4-YFP融合蛋白构建，图1C是对照35S::YFP空载体。图2显示水稻cyp97a4突变体由于β -环羟化功能缺失导致底物α -隐黄质(a -cry, a -cryptoxanthin)与 α -胡萝卜素(α -car, a -carotene)的积累；图 2A 为背景品种Nippon的叶片类胡萝卜素成分结果；图28为野生对照TosWT_97a4-l的叶片类胡萝
卜素成分结果；图2C为cyp97a4-l的叶片类胡萝卜素成分结果。
图3显示互补实验结果，为室外种植并取叶片抽提色素的HPLC图谱，结果显示，cyp97a4_l突变体苗(图3A)中出现的两个新的成分a-cry和a-car,在互补转基因单株的叶片里消失(图3B)，HPLC图谱恢复为与野生型(图3C) —致；图3A为cyp97a4_l的叶片类胡萝卜素成分分析结果；图38为转入互补载体的cyp97a4转基因苗类胡萝卜素成分结果；图3C为背景品种Nippon的叶片类胡萝卜素成分结果。图4显示蓝绿温和凝胶电泳分离各基因型类囊体膜中色素-蛋白复合体分析结果，突变体的捕光复合体II三聚体(LHCII trimer)减少，单体(LHCII monomer)增多(cyp97a4-l、4-2为突变体；TosWT_a4-l、4_2为野生型对照；Nippon背景品种)。图5显示强光胁迫条件下，cyp97a4突变体比对照组更敏感(左半图为CK，右半图为强光处理)(cyp97a4-l、4-2，4-3为突变体；TosWT_a4-l、4-2、4_3为野生型对照；Nippon背景品种)。突变体叶片出现光破坏现象，叶片损伤严重(图5B、图5D、图5F)，而对照(图5A、图5C、图5E)没有明显变化。各基因型水稻离体的叶片在强光照射一段时间后煮沸脱色，突变体(图5H、图5J、图5L)的染色结果更深。图6显示在正常光照条件和强光照胁迫下，35S启动子驱动过量表达CYP97A4的四个转基因系0E_1 0E_4体内积累的ROS都明显少于空载体对照(vector)，提高强光胁迫的耐受能力，图6A为正常生长条件，图6B为强光处理条件。
具体实施例方式本发明人通过 广泛而深入的研究，获得一种与类胡萝卜素合成相关的基因CYP97A4，生化实验结果表明，所述基因编码的蛋白参与β，ε -类胡萝卜素的β-环羟化反应，维持捕光复合体II的三聚体装配及稳定，参与植物在强光胁迫条件下的光保护等生理过程。本发明还提供了所述基因及其编码的多肽的用途，及其在植物品种改良中的作用。具体地，本发明人通过反向遗传学方法，找到一个类胡萝卜素β_环羟化酶，并得到了全长cDNA序列。该基因属于细胞色素Ρ450家族的单加氧酶类。该基因含有Ρ450蛋白共有的两个保守结构:结合血红素的保守结构域以及含有苏氨酸并结合氧分子的基序。高效液相色谱(HPLC)分析结果显示此基因被敲除之后，与野生型相比，突变体体内存在的类胡萝卜素，包括叶黄质、新黄素、紫黄素与β_胡萝卜素的含量都显著减少，叶黄质的底物
胡萝卜素含量显著提高，叶绿素a与叶绿素b的比值没有变化。非变性蛋白电泳表明突变体光合系统中捕光复合体II三聚体形式含量降低，而单体形式相应增加。在强光下突变体的叶片更容易发生光破坏，而对照叶片并没有发生明显改变。化学染色结果显示突变体叶片在光胁迫时会积累更多的活性氧物质(ROS)，从而导致了突变体敏感表型。由此可见，所述基因在水稻以及其他经济作物中参与强光胁迫下光保护过程，具有广泛的应用潜力。在本发明中，术语“CYP97A4蛋白”、“CYP97A4多肽”等可互换使用，指具有CYP97A4蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。在未特别指出时，术语“CYP97A4蛋白”包括野生型和突变型CYP97A4蛋白。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的CYP97A4蛋白或多肽”是指CYP97A4蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻CYP97A4蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括CYP97A4蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然CYP97A4蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是:(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“CYP97A4蛋白”或“CYP97A4多肽”指具有类胡萝卜素β _环羟化酶活性的多肽，其中一个序列如SEQ ID Ν0:2所示。该术语还包括具有与CYP97A4蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个，较佳地1 -30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CYP97A4蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度的条件下能与CYP97A4蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含CYP97A4蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽夕卜，本发明还包括了 CYP97A4蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有CYP97A4蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“CYP97A4保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
权利要求
1.一种分离的CYP97A4多肽或其编码基因的用途，其特征在于，所述用途任选自下组: (1)所述CYP97A4多肽或基因用于催化β，类胡萝卜素的β_环的羟化反应；和/或 (2)所述CYP97A4多肽或基因用于改变植物中类胡萝卜素组成成分的比例或含量；和/或 (3)所述CYP97A4多肽或基因用于提高植物抗强光胁迫的能力。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP97A4多肽选自下组: (i)具有SEQID NO:2氨基酸序列的多肽； (ii)将SEQID NO:2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有催化类胡萝卜素β_环的羟化反应功能的由(i)衍生的多肽。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP97A4多肽的编码序列选自下组: (1)编码如SEQID NO:2所述多肽的多核苷酸序列； (2)如SEQID NO:1所示的多核苷酸序列； (3)与(I)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
4.一种提高植物抗高`光胁迫能力，或提高植物捕光色素复合体II三聚体的装配及稳定能力的方法，其特征在于，提高所述植物中CYP97A4多肽的表达或活性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗高光胁迫能力为抗光氧化胁迫的能力。
6.如权利要求4-5任一所述的方法,其特征在于,该方法包括: (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有CYP97A4多肽的编码序列； (2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使表达CYP97A4多肽的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上； (3)选择已转入CYP97A4多肽编码序列的植物细胞或组织或器官； (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物选自下组: 水稻、大麦、玉米、杨树、大豆，或葡萄。
8.一种提高植物中β，ε -类胡萝卜素与β，β-类胡萝卜素比例和含量的方法，其特征在于，降低所述植物中CYP97A4多肽的表达或活性。
9.一种提高植物中α-胡萝卜素或α-隐黄质的含量的方法，其特征在于，降低所述植物中CYP97A4多肽的表达或活性。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，特异性敲除或干扰CYP97A4多肽的编码基因的表达；或特异性的抑制CYP97A4多肽的活性。
全文摘要
本发明提供了类胡萝卜素合成相关基因及其应用，具体地，所述的基因为CYP97A4，该基因参与植物在强光胁迫条件下的光保护、捕光复合物II三聚体装配及稳定等作用。本发明还公开了该基因及其所编码的多肽的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中改变植物的光保护性质和类胡萝卜素组成成分中的应用。
文档编号C12P23/00GK103114120SQ20111036399
公开日2013年5月22日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者林鸿宣, 吕明珠, 晁代印, 高继平, 单军祥, 朱美珍, 施敏 申请人:中国科学院上海生命科学研究院