专利名称：类人胶原蛋白及类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制作方法
类人胶原蛋白及类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶技术领域
本发明属于蛋白质工程、生物医用材料领域，具体涉及类人胶原蛋白、类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶及其制备方法。
背景技术：
整形美容行业正随着人们生活水平的不断提高而快速发展，隆胸、隆鼻、除皱、脸部整形等都受人追捧。目前面部整形的需求包括祛除皱纹，改善面部轮廓，填平凹陷瘢痕或唇部，修复受伤的组织等。因此，软组织填充材料市场需求量大。
在19世纪90年代至今，人们先后研究了白蜡、脂肪移植、硅树脂、凝胶植入体等材料用于软组织整形，临床应用发现都存在着硬化，瘤状肿块、吸收过快、慢性炎症等问题。 近些年来，美国FDA相继批准了几个用于软组织填充的产品，其主要成分为牛胶原、透明质酸钠、PMMA小球等，已经有了较好的效果，对于部分使用者仍然存在着使用部位红肿、过敏及降解过快等情况。
胶原蛋白，又称为胶原，是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白， 是脊椎动物身体结构的重要材料，也是在哺乳动物中含量最丰富的蛋白。胶原由多糖蛋白分子组成，是结缔组织的主要蛋白成分，占机体总蛋白的20 30%。机体中大约一半的胶原蛋白存在于皮肤中，胶原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相当于体重的6%。类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰， 转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得，由西安巨子生物基因技术股份有限公司发明并独家生产。它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患 (疯牛病、猪瘟疫、禽流感)等问题，并且具有良好的生物学特性和功能，促新细胞形成和促上皮细胞、成纤维细胞生长功能相比动物体提取胶原蛋白优良，免疫排异反应低。
透明质酸钠是广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布。其溶液具有高黏弹性及仿形性，是目前公认的生物相容性极好的生物医用材料，为眼科手术的辅助剂，并有保护角膜内皮细胞及眼内组织，减少手术并发症，促进伤口愈合的作用。发明内容
本发明的目的是提供一种类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶及其制备方法，该方法工艺简单，所制备的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶机械性能良好、生物相容性优异，降解时间与目前市场上同类产品相比大大延长，彻底杜绝了动物胶源材料存在的病毒隐患，保证了材料的安全性。
本发明人经过深入研究发现单纯使用透明质酸钠制备温敏型水凝胶存在着降解速度过快，机械轻度过低的问题，不能完全满足临床要求，我们在透明质酸钠的基础上引入了类人胶原蛋白来改善单纯透明质酸钠凝胶降解过快的问题，经过反复复合试验，得到了理想的温敏型水凝胶，从而完成了本发明。
SP，本发明如下
1. 一种重组胶原蛋白，其由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成。
2.编码项1所述的重组胶原蛋白的核酸。
3.导入了项2所述的核酸的载体。
4.用项3的载体转化宿主细胞而得到的转化体。
5. 一种类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤
1)将类人胶原蛋白用注射用水溶解成质量分数为1. 0% 5. 0%的溶液；
2)将医用透明质酸钠用注射用水溶解成质量分数为1. 0% 2. 0%的溶液；
3)将β-甘油磷酸钠用注射用水溶解为20% 50%的溶液；
4)将上述三种溶液按一定比例混合后，在0°C 15°C条件下搅拌10 30分钟混合均勻，并同时将PH调整至7. 0 7. 4 ；
5)将上述混合液在无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中，即为成品。
6.根据项5所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其特征在于所述类人胶原蛋白是项1所述的重组胶原蛋白。
7.根据项5所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其特征在于所述透明质酸钠的分子量为100万 250万。
8.根据项5所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其特征在于类人胶原蛋白溶液、透明质酸钠溶液及β-甘油磷酸钠混合过程中体积比为(1 3) (1 5) (1 2)。
9.根据项5所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其特征在于类人胶原蛋白溶液、透明质酸钠溶液及β-甘油磷酸钠混合过程溶液的温度维持在 0°C 15°C。
10.根据项5所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其中，成品溶液的PH值的调节依赖于β-甘油磷酸钠添加量。
11.根据项5所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法，其特征在于步骤5)中，所用的注射器为根据临床需要定制的不同规格的一次性玻璃注射器。
12.通过项5 11中任一项所述的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的制备方法得到的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶。
本发明提供的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶在37°C具有良好的成胶性，成胶时间在10分钟以内，机械强度优于目前临床使用的同类产品，且降解速度慢于单纯的透明质酸凝胶。类人胶原蛋白的免疫排异反应更弱，而且彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患。
图1动物胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶压缩试验结果。
图2类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶压缩试验结果。
图3动物胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶与类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶压缩试验结果对比。其中，对照组为动物胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶，试验组为类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶。
图4类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶注射小鼠皮下2周的照片。
图5类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶注射小鼠皮下4周的照片。
图6台湾“双美”胶原蛋白植入剂透明质酸钠凝胶注射小鼠皮下2周的照片。
图7台湾“双美”胶原蛋白植入剂透明质酸钠凝胶注射小鼠皮下4周的照片。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义， 如有冲突以本说明书中的定义为准。
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本发明的一个方面涉及一种重组胶原蛋白(简称本发明的重组胶原蛋白)，其由 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成。
SEQID NO:1
HDPVVLQRRDffENPGVTQLNRHLAHAHPPFASD
HPMGAPGPAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
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GPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAH
GPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPL
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP
GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP
GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH
GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS AGA THG
LVT CGL
本发明的重组胶原蛋白是中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1所述的类人胶原蛋白，其具有三链、三螺旋结构，其可以采用例如该中国专利申请公开CN1371919A 中公开的基因工程表达方法来制备。本发明的重组胶原蛋白是由中国西北大学的范代娣教授发明的，因此又称作范氏重组胶原蛋白或范氏类人胶原蛋白(Fan's Human-like Collagen，FHLC)。
此外，本发明还涉及编码上述本发明的重组胶原蛋白的核酸。
此外，本发明还涉及导入了上述核酸的载体。
此外，本发明还涉及用上述载体转化宿主细胞而得到的转化体。
上述核酸、载体、转化体可以基于本发明的重组胶原蛋白的氨基酸序列来制造，其制造方法是本技术领域公知的，例如可以参见分子克隆实验指南第三版[美]J.莎姆布鲁克著黄培堂等译科学出版社2002年9月。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。
制备例1重组胶原蛋白的制备
按中国专利申请公开CN1371919A所述方法制备了类人胶原蛋白(由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成)，确认其分子量为约90kD。这里，将该重组胶原蛋白简称为类人胶原蛋白，并用于下面的实施例。
实施例1
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成1.0%的溶液，将分子量为250万的透明质酸钠用注射用水溶解成1. 5%的溶液，将β -甘油磷酸钠用注射用水溶解为20%的溶液，然后将三者按1 3 2(体积比)混合，4°C条件下搅拌均勻后真空脱泡，无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中即为成品。
实施例2
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成1. 5%的溶液，将分子量为250万的透明质酸钠用注射用水溶解成1. 5%的溶液，将β -甘油磷酸钠用注射用水溶解为25%的溶液，然后将三者按2 2 1(体积比)混合，0°C条件下搅拌均勻后真空脱泡，无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中即为成品。
实施例3
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成2. 0%的溶液，将分子量为200万的透明质酸钠用注射用水溶解成2. 0%的溶液，将β -甘油磷酸钠用注射用水溶解为30%的溶液，然后将三者按1 5 1(体积比)混合，4°C条件下搅拌均勻后真空脱泡，无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中即为成品。
实施例4
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成3. 0%的溶液，将分子量为200万的透明质酸钠用注射用水溶解成1. 0%的溶液，将β -甘油磷酸钠用注射用水溶解为45%的溶液，然后将三者按2 3 1(体积比)混合，12°C条件下搅拌均勻后真空脱泡，无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中即为成品。
实施例5
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成4. 0%的溶液，将分子量为150万的透明质酸钠用注射用水溶解成2. 0 %的溶液，将β -甘油磷酸钠用注射用水溶解为40 %的溶液，然后将三者按3 1 2(体积比)混合，8°C条件下搅拌均勻后真空脱泡，无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中即为成品。
实施例6
将类人胶原蛋白用注射用水溶解成5. 0%的溶液，将分子量为100万的透明质酸钠用注射用水溶解成2. 0%的溶液，将β -甘油磷酸钠用注射用水溶解为50%的溶液，然后将三者按1 4 1(体积比)混合，4°C条件下搅拌均勻后真空脱泡，无菌条件下灌装在一次性玻璃注射器中即为成品。
实施例7
(1)力学性能测试
试验方法采用美国英斯特朗公司3365型电子万能材料试验机来测量水凝胶的压缩载荷和弹性模量。首先按照实施例1的方法制备类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶，制备完成后将溶胶放于IOmL的离心管中，在37°C条件下使其呈凝胶状，直径为10mm。 然后将制备好的水凝胶样品用手术刀片切成长为IOmm的圆柱状凝胶块进行抗压试验。对照组为将实施例1中类人胶原蛋白替换为动物胶原蛋白的水凝胶。打开电子万能材料试验机，调节相关参数主要有初始抗压盘高度为10mm，最终抗压盘高度为4mm，抗压盘形状为圆形，直径为10mm，压缩速度为2mm/min，横坐标设为压缩位移，纵坐标设为压缩应力。然后将切好的凝胶块放于抗压盘上，开始试验，当抗压盘高度为4mm时停止试验。保存数据图并自动给出该样品的弹性模量数据。
试验结果如图1 3所示。
由图1、2、3可以明显看出类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶的机械强度优于目前临床使用的透明质酸钠凝胶。
(2)皮下降解试验
试验方法按照实施例2制备类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶。将制备好的混合液移入ImL的注射器中，置于4°C环境下备用。选优良的雄性昆明小鼠20只，体重在 25-30g之间，随机均分为两组，一组为类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶组，另一组为台湾“双美”胶原蛋白植入剂。所用小鼠在室温环境下养一周时间，观察小鼠的生长反应。待小鼠比较适应环境后，用脱毛剂将小鼠背部去毛，然后采用常规麻醉，将皮肤消毒后，用注射器注射于小鼠皮下组织。注射时，用左手拇指和食指轻轻提起小鼠皮肤，右手持注射器， 将注射针刺入皮下，若针头可左右摆动则证明针头已进入皮下，注射0. 2mL后缓慢拔出注射针，然后用无菌纱布轻压针刺部位半分钟，以防止凝胶胶外漏。于第2周和第4周，每次每组处死3只小鼠，将与材料注射的部位取下拍照，观察凝胶在皮下的降解情况。
试验结果如图4 7所示。
由图4 7可以可以看出。类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶注射小鼠皮下2周和4周后凝胶基本维持原来的注射后的形状不变，无明显的炎症反应和降解。而台湾“双美”胶原蛋白植入剂透明质酸钠凝胶注射小鼠皮下2周和4周后降解较为明显，4周皮下凝胶的体积已降至原来的三分之一左右。表明类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶在皮下的降解速度更慢。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
以上通过具体实施方式
和实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应该理解的是，这些并非意图对本发明的范围进行限定，本发明的范围应由权利要求书确定。
工业实用性
根据本发明，能够提供一种类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶及其制备方法， 该方法工艺简单，所制备的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶机械性能良好、生物相容性优异，降解时间与目前市场上同类产品相比大大延长，彻底杜绝了动物胶源材料存在的病毒隐患，保证了材料的安全性。
权利要求
1.一种重组胶原蛋白，其由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成。
2.编码权利要求1所述的重组胶原蛋白的核酸。
3.导入了权利要求2所述的核酸的载体。
4.用权利要求3的载体转化宿主细胞而得到的转化体。
全文摘要
本发明涉及类人胶原蛋白及类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶。与目前临床广泛应用的同类凝胶材料相比，所制备的类人胶原蛋白复合透明质酸钠水凝胶成胶速度快、生物相容性优异，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶类填充材料在临床使用中的安全性。
文档编号C12N15/11GK102492033SQ20111036314
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者严建亚, 范代娣, 马晓轩 申请人:陕西巨子生物技术有限公司