专利名称：一种透明质酸-海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种透明质酸-海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid, HA)是一种线性、无支链酸性粘多糖，由N-乙酰氨基 葡萄糖和D-葡萄糖醛酸反复交替组成，是一种价值很高的医药、化妆品原料。HA具有良好 的亲水性、生物相容性和保湿功能，广泛应用于化妆品中，被誉为天然保湿因子。HA还具有 很好的生物相容性，在体内不产生排异反应。由于HA独特的流变学性质、润滑性和生物相 容性等物理化学性质，HA可作为弹性材料应用于眼外科手术，治疗骨关节疾病，并具有促进 伤口愈合和一定抗癌效果。HA在药物缓释、术后防粘连和组织工程中也具有重要作用。但是，机械性质较差、在体内易被透明质酸酶快速降解等缺陷限制了透明质酸在 临床应用。为了改善HA的物理、化学稳定性，同时保持其天然的生物相容性、生物可降解性 和体内无排异的特性，人们采用多种途径对其羟基和羧基进行改性修饰。化学改性方法包 括交联、接枝、酯化和复合改性等。目前，由于复合改性往往能够保持两种原料的最初的特 性而受到人们的关注。对于复合改性而言，许多大分子物质通过羧基或羟基与HA的羧基形 成交联。成功复合交联的物质包括羧甲基纤维素钠、胶原质、明胶、聚乳酸、壳聚糖等。海藻 酸钠(sodium alginate，简称SAL)是一种由α-L-古罗糖醛酸和β _D_甘露糖醛酸通过1， 4-糖苷键连接而成的酸性粘多糖，广泛应用于食品加工、医药领域，包括药物缓释载体、细 胞培养等。SAL具有良好的生物相容性，一旦形成凝胶后，便具有较好的机械性质。SAL与 其他多糖，如壳聚糖、硫酸软骨素等的复合物已见诸报道，也有人对SAL-HA的复合物进行 了流变学的考察，但这种复合物仅是两种高分子物质的混合液。
发明内容
本发明的目的是提供一种透明质酸_海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法。本发明所提供的透明质酸(HA)和海藻酸钠(SAL)复合水凝胶是按照包括下述步 骤的方法制备的1)将透明质酸和海藻酸钠溶于水中，得到溶液1，2)将交联剂加入所述溶液1中，并用缓冲溶液调节PH值为4. 0-5. 5，得到溶液2 ；3)向所述溶液2中加入羧基激活剂并搅拌，搅拌过程中用缓冲溶液调节所述溶液 2的pH值在2. 0-5. 5直至形成凝胶，即得到透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶。上述溶液1中，透明质酸和海藻酸钠的质量比可为1 4-4 1，优选质量比 为1 2。溶液1中，透明质酸和海藻酸钠的浓度之和可为0.5-1. 5g/100ml，优选为 1.0g/100ml。上述步骤2)中所述交联剂可选自下述至少一种己二酸二酰胼(ADH)，聚乙二醇 (PEG)，戊二醛和二乙烯基砜(GTA)，优选为己二酸二酰胼(ADH)；所述交联剂的加入量与所 述溶液1的配比可为0. lg-1. Og IOOmL,优选为0. 52g IOOmL0
步骤3)中所述羧基激活剂可选自下述至少一种碳化二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀 酰亚胺(NHS)和N，N，N"，N" —四甲基乙二胺(TEMED)，优选为碳化二亚胺；所述碳化亚胺 的添加量与所述溶液2的配比可为lOmmol-lOOmmol 1L，优选为50mmol IL0步骤3)中所述搅拌可在15°C -40°C条件下进行，优选为20°C -30°C ；所述搅拌过 程中需用缓冲溶液调控溶液2的pH值为2. 0-5. 5，优选pH值为4. 75。搅拌时，搅拌的转速 应不宜过快，避免导致形成凝胶后变稀。上述步骤2)和步骤3)中所用的缓冲溶液相同，所述缓冲溶液可选自下述任意 一种磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲溶液；所述缓冲溶液的浓度可为
0.01-0. 5mol/L，pH值为2. 0-4. 5，优选为醋酸盐缓冲溶液，最优选浓度为0. lmol/L，pH值为 3. 6的醋酸盐缓冲溶液。本发明的方法还包括对步骤3)得到的透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶进行洗涤 的步骤。洗涤次数不应少于5次，洗涤时慢慢翻转凝胶，以使残余反应杂质溶于水中而去 除。本发明所用的透明质酸的分子量可为5.0X105Da_2. 1 X IO6Da,优选分子量为
1.5 X IO6Da ；所用的海藻酸钠粉末的粒度为50目-300目，优选为200目。本发明是在羧基活化剂存在下，由分子结构中具有两个或两个以上氨基的高聚物 或低聚物(交联剂)与透明质酸、海藻酸钠进行酰胺化反应交联而制得硬度、粘弹性较好的 透明质酸_海藻酸钠复合交联物。获得的复合交联水凝胶具备HA和SAL的双重优点，一方 面，抗酶降解的能力得到提高，另一方面，水凝胶的机械性质和质构特征得到改善。复合交 联水凝胶的物理化学性质改善后，具有作为真皮填充物和组织支架材料的潜在用途而用于 外科手术、组织工程领域。
图1为本发明制备透明质酸_海藻酸钠复合水凝胶的工艺流程图。图2为实施例1制备的透明质酸_海藻酸钠复合水凝胶的红外光谱图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如 无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、透明质酸_海藻酸钠水凝胶的制备及其理化特性验证按照图1所示的工艺流程图制备透明质酸_海藻酸钠水凝胶，具体步骤如下①多糖溶解分子量为1. 5 X IO6Da的透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司) 和海藻酸钠(粒径为200目筛，10mg/ml的水溶液，在25°C时其粘度为205mPa *s，青岛晶岩 生物科技有限公司)以1 2的比例(质量比)溶于水中，令其总浓度为1.0% (g/100ml), 得到溶液1。②添加交联剂并调节溶液pH 待步骤①中的多糖完全溶解后，将交联剂ADH (北京 金源化学集团有限公司)以0.52g 100ml的配比加入所述溶液1中，混合均勻。并对上 述混合溶液进行PH调整，用0. lmol/L的HAc-NaAc缓冲液(pH 3. 6)调整pH至4. 75，得到溶液2。③添加羧基激活剂向溶液2加入EDC (上海共价化学有限公司)，使其EDC浓度 达到 50mmol/L。④搅拌进行反应并控制pH 对步骤③中的反应液进行搅拌并控制pH，加入EDC的 同时即开始进行搅拌，搅拌速度不宜过快，避免形成的凝胶剪切变稀。在室温下搅拌4h，反 应过程中，通过滴加0. lmol/L的HAc-NaAc缓冲液使反应液的pH值保持在4. 75，得到透明 质酸和海藻酸钠复合水凝胶。⑤凝胶洗涤对步骤④形成的复合水凝胶，用去离子水反复洗涤，洗涤次数应不少 于5次，每次洗涤20分钟以上，洗涤时慢慢翻转凝胶，使残余反应杂质溶于水中而去除。⑥凝胶保存对步骤⑤洗涤后的凝胶在4°C下保存。按照上述方法制得的透明质酸-海藻酸钠复合水凝胶为无色，具有一定的硬度和 粘弹性。对透明质酸-海藻酸钠复合水凝胶的特性进行测定1、采用FT-IR光谱仪 (Nicolet Nexus, Thermo Electron, USA)测定是否形成共价键；2、采用扫描电镜(Hitachi SEM-2500，Japan)观察形成凝胶的微结构；3、采用质构仪对凝胶的质构特征进行测定(pre test speed 2. Omm/s, test speed 0. 8mm/s, post test speed 2. Omm/s, rupture test distance 4. 0%, distance 50%，temperature 25。C ·) 0红外光谱图见图2，测定结果表明凝胶形成了新的共价键，透明质酸和海藻酸钠通 过己二酸二酰胼(ADH)交联在一起。扫描电镜表明，凝胶中形成较均勻而孔径适宜的网状 结构。质构仪(Cns-Farnel 1, Britain)测得凝胶硬度为357. 06g，碎裂度为253. 56g，弹性 为 0. 961。溶胀试验真空冻干后的凝胶，称重后置于去离子水中12h，用滤纸去除表面的水后，称重，结 果表明，凝胶吸水可达自身重的40-50倍。抗酶降解试验凝胶样品置于IOml酶活力为10U/ml的透明质酸酶液中，每间隔3h从中取Iml上 清液进行测定，然后补充Iml新配制的透明质酸酶液至反应体系中。测定方法如下5mL浓 H2SO4置于试管中并冷却至4°C，ImL样液或标准液小心地置于浓H2SO4层之上，开始轻轻振 摇，然后剧烈振摇，并使之在冰浴中不断冷却，接下来将试管在沸腾的蒸馏水中加热lOmin， 然后冷却至室温，加入0. 2mL咔唑试液，再次摇勻，并在沸水浴中加热15min，冷却至室温， 将反应液倒入Icm比色皿中，在530nm下测定吸光度(A530)。通过标准曲线测定溶液中透 明质酸含量。根据下列公式计算凝胶被透明质酸酶分解的程度Wi = CiV+ Σ Ci-IVs其中，Ci和Cp1为凝胶在i和i-Ι时刻被分解下来的HA浓度(mg/ml)，V为酶液总 体积(IOml)，Vs为每次取出的样品体积(Iml)。结果表明，随着处理时间的延长，凝胶逐渐被透明质酸酶分解，在第9h时，几乎被 分解完全，而对照组的透明质酸凝胶，在3h后即被分解完全。实施例2、透明质酸_海藻酸钠水凝胶的制备及其理化特性验证按照图1所示的工艺流程图制备透明质酸_海藻酸钠水凝胶，具体步骤如下
①多糖溶解分子量为5. OX IO5Da的透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司) 和海藻酸钠(粒径为50目蹄，10mg/ml的水溶液，在25°C时其粘度为IOOmPa · s，青岛晶岩 生物科技有限公司)以1 4的比例(质量比)溶于水中，令其总浓度为0.5% (g/100ml), 得到溶液1。②添加交联剂并调节溶液pH 待步骤①中的多糖完全溶解后，将交联剂ADH (北京 金源化学集团有限公司)以0. Ig IOOml的配比加入所述溶液1中，混合均勻。并对上述 混合溶液进行PH调整，用0. lmol/L的HAc-NaAc缓冲液(pH 3. 6)调整pH至4. 75，得到溶 液2。③添加羧基激活剂向溶液2加入EDC (上海共价化学有限公司)，使其EDC浓度 达到 10mmol/L。④搅拌进行反应并控制pH 对步骤③中的反应液进行搅拌并控制pH，加入EDC的 同时即开始进行搅拌，搅拌速度不宜过快，避免形成的凝胶剪切变稀。在室温下搅拌4h，反 应过程中，通过滴加0. lmol/L的HAc-NaAc缓冲液使反应液的pH值保持在4. 75，得到透明 质酸和海藻酸钠复合水凝胶。⑤凝胶洗涤对步骤④形成的复合水凝胶，用去离子水反复洗涤，洗涤次数应不少 于5次，每次洗涤20分钟以上，洗涤时慢慢翻转凝胶，使残余反应杂质溶于水中而去除。⑥凝胶保存对步骤⑤洗涤后的凝胶在4°C下保存。按照上述方法制得的透明质酸-海藻酸钠复合水凝胶为无色，具有一定的硬度和 粘弹性。红外光谱测定表明，凝胶形成了新的共价键，透明质酸和海藻酸钠通过己二酸二 酰胼(ADH)交联在一起。扫描电镜表明，凝胶中形成较均勻而孔径适宜的网状结构。质构 仪(Cns-Farnel 1, Britain)测得凝胶硬度为71. 02g，碎裂度为66. 89g，弹性为0. 97。溶胀试验真空冻干后的凝胶，称重后置于去离子水中12h，用滤纸去除表面的水后，称重，结 果表明，凝胶吸水可达自身重的55倍。抗酶降解试验凝胶样品置于IOml酶活力为10U/ml的透明质酸酶液中，每间隔3h从中取Iml上 清液进行测定。结果表明，随着处理时间的延长，凝胶逐渐被透明质酸酶分解，在第6h时，几乎被 分解完全，而对照组的透明质酸凝胶，在3h后即被分解完全。实施例3、透明质酸_海藻酸钠水凝胶的制备及其理化特性验证按照图1所示的工艺流程图制备透明质酸_海藻酸钠水凝胶，具体步骤如下①多糖溶解分子量为2. IXlO6Da的透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司) 和海藻酸钠(粒径为300目筛，10mg/ml的水溶液，在25°C时其粘度为300mPa *s，青岛晶岩 生物科技有限公司)以4 1的比例(质量比)溶于水中，令其总浓度为1.5% (g/100ml), 得到溶液1。②添加交联剂并调节溶液pH 待步骤①中的多糖完全溶解后，将交联剂ADH (北京 金源化学集团有限公司)以l.Og 100ml的配比加入所述溶液1中，混合均勻。并对上述 混合溶液进行PH调整，用0. lmol/L的HAc-NaAc缓冲液(pH 3. 6)调整pH至4. 75，得到溶液2。③添加羧基激活剂向溶液2加入EDC (上海共价化学有限公司)，使其EDC浓度 达到 100mmol/L。④搅拌进行反应并控制pH 对步骤③中的反应液进行搅拌并控制pH，加入EDC的 同时即开始进行搅拌，搅拌速度不宜过快，避免形成的凝胶剪切变稀。在室温下搅拌4h，反 应过程中，通过滴加0. lmol/L的HAc-NaAc缓冲液使反应液的pH值保持在4. 75，得到透明 质酸和海藻酸钠复合水凝胶。⑤凝胶洗涤对步骤④形成的复合水凝胶，用去离子水反复洗涤，洗涤次数应不少 于5次，每次洗涤20分钟以上，洗涤时慢慢翻转凝胶，使残余反应杂质溶于水中而去除。⑥凝胶保存对步骤⑤洗涤后的凝胶在4°C下保存。按照上述方法制得的透明质酸-海藻酸钠复合水凝胶为无色，具有一定的硬度和 粘弹性。红外光谱测定表明，凝胶形成了新的共价键，透明质酸和海藻酸钠通过己二酸二 酰胼(ADH)交联在一起。扫描电镜表明，凝胶中形成较均勻而孔径适宜的网状结构。质构 仪(Cns-Farnel 1, Britain)测得凝胶硬度为209. 50g，碎裂度为190. 28g，弹性为1. 14。溶胀试验真空冻干后的凝胶，称重后置于去离子水中12h，用滤纸去除表面的水后，称重，结 果表明，凝胶吸水可达自身重的20倍。抗酶降解试验凝胶样品置于IOml酶活力为10U/ml的透明质酸酶液中，每间隔3h从中取Iml上 清液进行测定。结果表明，随着处理时间的延长，凝胶逐渐被透明质酸酶分解，在第8h时，几乎被 分解完全，而对照组的透明质酸凝胶，在3h后即被分解完全。
权利要求
1.一种透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，包括下述步骤1)将透明质酸和海藻酸钠溶于水中，得到溶液1，2)将交联剂加入所述溶液1中，并用缓冲溶液调节PH值为4.0-5. 5，得到溶液2 ；3)向所述溶液2中加入羧基激活剂并搅拌，搅拌过程中用缓冲溶液调控所述溶液2的 pH值在2. 0-5. 5，直至形成凝胶，即得到透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶液1中透明质酸和海藻酸钠的质 量比为1 4-4 1，优选质量比为1 2;所述溶液1中透明质酸和海藻酸钠的浓度之和 为 0. 5-1. 5g/100ml，优选为 1. 0g/100ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤幻中所述交联剂选自下述至少 一种己二酸二酰胼，聚乙二醇，戊二醛和二乙烯基砜，优选为己二酸二酰胼；所述交联剂 的加入量与所述溶液1的配比为0. lg-l.Og IOOmL,优选为0. 52g IOOmL0
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步骤幻中所述羧基激活剂选自 下述至少一种碳化二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺和N，N，N"，N" —四甲基乙二胺，优选为碳 化二亚胺；所述碳化二亚胺的添加量与所述溶液2的配比为lOmmol-lOOmmol 1L，优选为 5Ommol IL0
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步骤3)中所述搅拌在 15°C -40°C条件下进行，优选为20°C -30°C ；所述搅拌过程中调控溶液2的pH值为4. 75。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于步骤2、和步骤幻中中所述缓 冲溶液相同，选自下述任意一种磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲溶液， 所述缓冲溶液的浓度为0. 01-0. 5mol/L, pH值为2. 0-4. 5。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤幻和步骤幻中中所述缓冲溶液为 醋酸盐缓冲溶液，优选为浓度为0. lmol/L、pH值为3. 6的醋酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述透明质酸的分子量为 5.0X105-2. IX IOfiDa,优选分子量为1.5X IO6Da ；所述海藻酸钠的粒度为50目-300目，优 选为200目。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括对步骤幻得到 的透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶用水进行洗涤的步骤。
10.权利要求1-9中任一所述方法制备得到的透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶及其制备方法。该复合水凝胶是按照包括下述步骤的方法制备得到的1)将透明质酸和海藻酸钠溶于水中，得到溶液1，2)将交联剂加入所述溶液1中，并用缓冲溶液调节pH值为4.0-5.5，得到溶液2；3)向所述溶液2中加入羧基激活剂并搅拌，搅拌过程中用缓冲溶液调控所述溶液2的pH值在2.0-5.5直至形成凝胶，即得到透明质酸和海藻酸钠复合水凝胶。本发明为透明质酸的改性提供了新的途径，用本发明方法制备的复合改性物具有较高的机械性能、抗透明质酸酶降解能力、生物相容性等优点，在外科手术、组织工程方面有着潜在的用途。
文档编号C08B37/04GK102070786SQ20091023760
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者刘丽, 刘红芝, 王强, 陈永浩 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所