专利名称：一种野油菜黄单胞菌必需基因及其编码的蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种野油菜黄单胞菌必需基因及其编码的蛋白及应用。
背景技术：
细菌的必需基因(essential gene)是指维持细菌细胞正常生长和繁殖所必需存在的基因。必需基因一般编码细胞代谢活动和生化过程里的关键分子，如核酸、氨基酸、脂肪和细胞壁合成代谢、细胞分裂、物质转运、基因表达调控中的关键蛋白。其突变或失活将直接导致细菌细胞生长停滞或死亡。因此，必需基因也是发展新型抗生素或抑菌化合物的理想药物作用靶标，可利用其编码产物的生物学活性或稳定性，对可能的抗菌化合物进行筛选。细菌的双组分信号转导系统(two-component signal transduction system)则由组氨酸激酶(histidine kinase)和反应调节蛋白(response regulator)组成，是细菌感应外界环境刺激和调控相应基因表达的主要分子机制。当细菌感受到特定环境刺激时，组氨酸激酶会自磷酸化(autophosphorylation)，随后将磷酸基团转移给下游的反应调节蛋白。被磷酸化后的反应调节蛋白发生变构作用，激活其C末端的信号输出区(往往具有转录因子活性)并调控下游基因的表达。必需双组分信号转导系统基因曾在多种病原细菌中被发现并应用于抗生素的筛选，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的 yycF-yycG (Fabret C and Hoch JA. 1998. A two-component signal transduction system essential for growth of Bacillus subtilis amplication for anti-infective therapy. Journal of Bacteriology. 180 6375-6383)，以及结核分枝杆菌的mtrA基因(Zahrt T and Deretic V. 2000. An essential two-component signal transduction system in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Bacteriology. 182 :3832-3838)。十字花科植物(如甘蓝、白菜、芥菜、萝卜、拟南芥等)黑腐病病原-野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)的核酸序列已由基因组测序项目报道 (Qian W,Jia YT, He YQ et al. 2005. Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv. campestris. Genome Research, 15 :757-767.)，尽管该项目对野油菜黄单胞菌中的基因进行了分析，但其具体基因的生物学功能和应用并未由实验加以证明。
发明内容
本发明是在上述野油菜黄单胞菌基因组测序项目基础上，利用实验分析对可能的基因功能基因进行证明获得的成果，涉及野油菜黄单胞菌必需反应调节基因及其编码的蛋白，该基因和它编码的蛋白是野油菜黄单胞菌生长所必需的，因此可以作为筛选预防十字花科植物黑腐病农药的靶标。本发明的技术方案为一种野油菜黄单胞菌必需基因，具有序列表中SEQ ID No. 1 的DNA序列或者是编码序列表SEQ ID No. 2的氨基酸序列的多核苷酸。该基因被命名为phoP基因。所述必需基因的检测方法为1)利用序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4的多核苷酸作为引物，经PCR方法扩增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全长片段；2)将扩增出的核苷酸序列克隆到载体上，获得在严谨性启动子控制下的重组载体；3)将重组载体转入野油菜黄单胞菌菌株中获得重组菌株；4)利用重组自杀载体对重组菌株染色体上的必需基因核苷酸序列进行读框内删除获得突变体；4)将该突变体置于培养基中，利用添加的严谨性物质作为诱导物，控制突变体中重组必需基因的转录水平，检测该必需基因对野油菜黄单胞菌生长的影响；5)确定该基因是否为必需基因。所述基因的转录被控制后，野油菜黄单胞菌的生长受到抑制，说明该基因为野油菜黄单胞菌生长特异性的必需基因。所述重组自杀质粒的制备方法为1)分别用PCR扩增必需基因的上游基因和下游基因，获得上游基因片段和下游基因片段；2)将上游基因片段和下游基因片段分别克隆到自杀载体中获得重组自杀载体。本发明还提供一种上述必需基因编码的蛋白，具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸序列。所述蛋白为野油菜黄单胞菌生长所必需的反应调节蛋白。所述反应调节蛋白的检测方法为1)将32P标记的醋酸磷酸与野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白混合；2)提取混合物样品，利用电泳方法分离并进行同位素信号检测所述蛋白是否被磷酸化。所述反应调节蛋白的另一种检测方法为1)将α -32P标记的组氨酸激酶与野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白混合；2)提取混合物样品，利用电泳方法分离并进行同位素信号检测所述蛋白是否被磷酸化。一种制备上述必需蛋白的方法1)利用序列表中SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10的多核苷酸作为引物，经PCR方法扩增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全长片段；2)将扩增出的核苷酸序列连接到载体上，转化到大肠杆菌菌株上；3)获得的大肠杆菌菌株进行培养后离心收集裂解后进行亲和层析获得重组蛋白。所述获得重组蛋白后还可以经电泳分析对蛋白进行纯化。本发明还提供一种筛选抗野油菜黄单胞菌物质的方法，以野油菜黄单胞菌中的蛋白或编码该蛋白的基因作为筛选靶标，所述蛋白具有序列表中的SEQ ID No. 2的氨基酸序列；所述编码该蛋白的基因具有序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列。该序列的转录受到抑制后，会使细菌生长停止和死亡。本发明还提供一种控制野油菜黄单胞菌的方法，以野油菜黄单胞菌中的蛋白或编码该蛋白的基因作为靶标筛选能控制野油菜黄单胞菌的物质，所述蛋白具有序列表中的 SEQ ID No. 2的氨基酸序列；所述编码该蛋白的基因具有序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列。所述方法是以控制野油菜黄单胞菌所述基因的转录来控制野油菜黄单胞菌的生长。编码本发明的必需反应调节蛋白的基因phoP不能被普通的、基于同源重组的遗传学方法所突变。而其近缘细菌水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)中， phoP的直向同源基因已被证明可被遗传突变(Lee Sff, Jeong KS，Han Sff et a. 2008. The Xanthomonas oryzae pv. oryzae PhoPQ two-component system is required for AvrXA21 activity,hrpG expression,and virulence. Journal of Bacteriology. 190(6) 2183-2197)，已经表明水稻黄单胞菌的phoP不是必需基因，而野油菜黄单胞菌的phoP则是一个经快速进化而产生的细菌物种特异性的必需基因，可以作为该菌理想的、特异性的农药作用靶标。由于该菌导致的十字花科植物黑腐病是世界上大宗蔬菜生产的重大病害，对该蛋白的研究、开发和应用将会对控制黑腐病发挥独特的作用。下述的实验证明了 phoP基因或phoP蛋白是野油菜黄单胞菌物种特异性的生长必需基因。由于只有将该基因克隆到PHM2表达载体并置于阿拉伯糖启动子控制下，反式提供到野油菜黄单胞菌细胞内后，才能用同源重组的方法对细菌染色体上的PhoP拷贝进行突变和读框内删除。并且，利用外源添加阿拉伯糖的方法对phoP进行诱导生长发现，只有当培养基内含有0. 05%的阿拉伯糖诱导其转录时，phoP突变体才能正常生长，否则其生长受到很大的抑制。小分子磷酸化实验和WioQ磷酸转移酶实验都证明W10P蛋白确实具有反应调节蛋白活性。因此，野油菜黄单胞菌的PhoP是一个必需的反应调节蛋白基因(essential response regulator gene)，其编码产物WioP蛋白是一个非常理想的农药作用靶标。
图1是重组载体pHM2-pBAD-phoP结构示意图；图2是phoP突变体的验证图；图3是醋酸磷酸对WioP蛋白的磷酸化水平示意图；图4是组氨酸激酶WioQ对反应调节蛋白WioP的磷酸化示意图；图5是阿拉伯糖诱导转录对phoP突变体的影响曲线图。
具体实施例方式实施例1、phoP是细菌必需基因1. phoP严谨型表达重组载体的构建由于必需基因的突变会导致细菌细胞死亡，因此，不能简单地利用基于同源重组的遗传学方法直接对PhoP基因进行突变和敲除。对其进行突变必须先在细菌细胞中额外提供一个phoP基因的拷贝，并能够利用严谨型调节的启动子控制该拷贝的转录，在此基础上才能对染色体上的PhoP拷贝进行遗传学操作。为此，利用引物1 (5 ‘ -GTCGACATGCGTATCCTTTTGGTCGA-3 ‘)和引物 2 (5 ‘ -GGTAC CTCAGCCTTCCGTACGCGGGA-3 ‘)，即序列表中的 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4，通过 PCR 方法扩增野油菜黄单胞菌8004菌株(以下简称kc 8004)的phoP基因全长序列(684bp)。扩增条件为 94°C 2min ；94°C 30sec,60°C 60sec,72°C 60sec，沘个循环；72°C 5min。PCR 产物在的琼脂糖凝胶电泳中分离回收后，克隆到PGEM-T easy载体上(购自Promega公司，美国)并转化大肠杆菌DH 5α。该重组载体经测序正确后，利用限制性内切酶MlI和 KpnI进行双酶切，回收插入片段。该插入片段克隆到经MlI和KpnI双酶切处理的ρΗΜ2载体上，并置于大肠杆菌阿拉伯糖启动子(pBAD-araC)的控制之下。转化大肠杆菌DH 5α，在含有150μ g/ml壮观霉素的LB培养基平板上培养M小时获得转化子，其中含有重组载体 pHM2-pBAD-phoP(图1)。该重组载体可用常规提取质粒的方法进行分离和纯化。2.基因敲除重组菌株的构建利用电击转化的方法，将重组载体pHM2-pBAD-phoP转入he 8004野生型菌株感受态细胞，并在含有150 μ g/ml壮观霉素的NYG培养基平板上，生长2_3天筛选正确的转化菌株kc 8004-phoP(由于重组载体的转入，使得该菌株获得壮观霉素和链霉素的抗性)。该重组菌株(Xcc 8004-phoP)含有2个拷贝的phoP全长基因(分别位于细菌染色体上和重组载体pHM2-pBAD-phoP上)，可作为工程菌，用于下一步敲除染色体上的必需基因 phoP。3. phoP基因的读框内敲除和验证由于利用pHM2-pBAD-phoP重组载体额外提供了 1个phoP基因的拷贝，使得利用同源重组双交换方法对细菌染色体上的PhoP拷贝进行删除成为可能。为此，利用引物 3(5，-TCTAGATGTTCCGTTTGGCGATAGC-3，)和弓丨物 4(5，-GAATTCTTCTTCGCCGTCCTGTGC-3 ，)，即序列表中的SEQ ID No.，5和SEQ ID No. 6，通过PCR方法扩增phoP基因上游序列 phoP-upstream ；利用引物 5 (5，-GAATTCGTGCTGGAAGTGTTCATCGG_3，)和引物 6 (5，_CTGCAGCG TCAGGTCGCACCACTTC-3，)，即序列表中的 SEQ ID No. 7和 SEQ ID No. 8，扩增phoP基因下游序列 phoP-downstream(扩增条件均为 94°C 2min ；94°C 30sec,60°C 60sec，72°C 60sec,28 个循环；72°C 5min)。将phoP-upstream和phoP-downstream PCR产物片段分别克隆到pGEM T easy载体上，测序正确后，分别用内切酶)(bal，EcoRI和EcoRI，PstI处理，回收插入片段。 并将这两个插入片段克隆进入经I3StI酶和^CbaI酶处理过的自杀载体pK18mobsacB中，获得重组自杀载体pK18mobsacB-phoP。利用电击转化的方法，将载体pK18mobsacB-phoP转化进入上述kc 8004-phoP重组菌株。如果发生同源重组，该自杀质粒将在phoP基因区域内整合进入细菌染色体，并使重组细菌获得抗卡那霉素的能力。利用含有50 μ g/ml卡那霉素的NYG培养基平板筛选发生第一次同源单交换的突变菌株，经Southern blot和PCR验证正确后，培养并在含有10%蔗糖的NYG培养基上进一步筛选发生第二次同源交换的菌株。 在培养基里含有蔗糖的情况下，由于sacB基因表达的产物会对细菌细胞产生毒害作用。如果发生同源双交换，则双交换菌株有可能丢失质粒序列和待删除序列，能够恢复对卡那霉素的敏感性且能够在含蔗糖的NYG培养基生长。经此方法筛选得到的候选菌株用PCR和 Southern blot进行验证(图幻，获得正确的phoP的读框内删除突变体IFD-phoP。在该突变体中，PhoP基因的第106-564个碱基，对应第36-188个氨基酸编码序列被正确删除。同时，该实验也证明如果不通过反式提供一个额外拷贝的PhoP，无法获得任何染色体上phoP 基因的突变体(即突变后致死)。因此证明，PhoP是一个野油菜黄单胞菌的必需基因。图 2(a)是对突变体的PCR验证，图中phoP读框内删除突变体为IFD-phoP。由于序列被删除，其PCR产物小于)(cc 8004-pHM正对照菌株。图2 (b)突变体的Southern杂交验证。图中 pHM2 :phoP为重组质粒。Single-crossover为单交换菌株。IFD-phoP(T)为正确的phoP 读框内删除突变体，IFD-phoP(F)为假阳性。( 二)实施例2、PhoP是一个反应调节蛋白1. PhoP-His6重组蛋白的表达与纯化经生物信息学预测，PhoP含有Receiver结构域和转录因子结构域，是一个可能的细菌反应调节蛋白。但该推测尚无任何实验证据。由于反应调节蛋白会被醋酸磷酸等化学小分子磷酸化，并且可以被对应的组氨酸激酶磷酸化。为此，本发明表达并纯化了 WioP蛋白并对其磷酸化特性进行了分析。利用引物7 (5 ‘ -CATATGCGTATCCTTTTGGTCGA-3 ‘)和引物8(5' -CTCGAGGCCTTCCGTACGCGGGA-3‘)，即序列表中的SEQ ID No.，9和SEQ ID No. 10， 经PCR方法扩增phoP全长片段。扩增条件为退火94°C 2min ；94°C 30sec，60°C 60sec, 72°C 循环；72°C 5min。PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳中分离后，克隆到 PGEM-T easy载体上(购自Promega公司，美国)并转化大肠杆菌。经测序正确后，利用 NdeI酶和^CbaI酶双酶切回收插入片段。该片段连接到经NdeI酶和HindIII酶双酶切处理的pET30a载体(购自Novagen公司，美国)上，转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。正确的重组菌株在LB培养基中生长至0D_ = 0.6，加入ImM IPTG，16°C诱导18小时。诱导后的细菌细胞经离心收集、裂解后，利用Ni-NTA琼脂糖(购自Novagen公司，美国)进行亲和层析， 250mM咪唑缓冲液洗脱获得纯化的WioP重组蛋白。该蛋白的纯度利用12% SDS-PAGE胶进行电泳分析，纯度达90 %以上。2.小分子对WioP的磷酸化小分子化合物，如醋酸磷酸，能够对反应调节蛋白进行磷酸化。为此，在14. Oul AKP 缓冲液(25mM Tris_HCl，pH 7. 4 ；60mM KOAc ；IOmM MgCl2)中加入 1. OU 的 E. coli 醋酸激酶(购自Sigma公司，美国)和20uCi y-[32P]-ATPQu1)。25°C温育30min。获得同位素 32P标记的醋酸磷酸小分子。将IOuM WioP-Hk6重组蛋白，即WioP重组蛋白与32P标记的醋酸磷酸混合，在一定的时间内收集样品，利用5XSDS点样缓冲液中止反应后，样品用12% SDS-PAGE胶进行电泳分离并检测同位素信号(图3)。该实验证明，同位素32P标记的醋酸磷酸小分子能够对WioP重组蛋白进行磷酸化，在W10P蛋白位置处出现明显的同位素信号， 表明该蛋白内存在磷酸化位点。3.组氨酸激酶WioQ对WioP的磷酸化在同一双组分信号转导系统中，对于反应调节蛋白而言，其对应的组氨酸激酶能够在极短的时间内对其进行磷酸化。为此，在IOul磷酸化反应缓冲液(Tris-HCl，50mM， DTT, 2mM, NaCl 25mM，KCl，25mM，MgCl2 5mM)中加入IOuM的野油菜黄单胞菌组氨酸激酶 PhoQ-His6重组蛋白，并加入20uCi y-[32PJ-ATP,混合物在30°C温育30min，获得保守组氨酸位点自磷酸化的WioQ-His6重组蛋白。随后在该混合物中加入20uM的野油菜黄单胞菌反应调节蛋白WioP-His6，在一定的时间内收集样品，利用5XSDS点样缓冲液中止反应后，样品用12% SDS-PAGE胶进行分离并检测同位素信号(图4)。该实验证明，磷酸化的WioQ-His6 能够在15sec内磷酸化WioP-Hk6重组蛋白，在W10P蛋白位置处出现明显的同位素信号， 具有较高的酶动力学性质，表明WioQ和W10P构成一对细菌双组分信号转导系统。实验同时表明，PhoQ是一个组氨酸激酶，具有自磷酸激酶活性和磷酸转移酶活性；WioP是其对应的反应调节蛋白，能够被WioQ磷酸化。(三)实施例3、缺乏阿拉伯糖培养下调phoP基因转录能够显著抑制细菌生长必需基因phoP敲除突变体的成功获得，使得人工操纵该基因表达量，并观察其对细菌生长的影响成为可能。由于在该突变体中，PhoP被置于严谨型的阿拉伯糖启动子 (pBAD-araC)控制之下。如果在培养基中添加一定量的阿拉伯糖，该启动子被诱导后能够驱动PhoP的转录。如果培养基中不含阿拉伯糖，由于位于重组载体pHM2-pBAD-phoP上的 PhoP拷贝停止转录，而染色体上的phoP拷贝已经发生了读框内删除，不能调控细菌的正长生长，会导致细菌生长停滞甚至死亡。如图5所示，当把黄单胞菌菌株在NYG富营养培养基 (含阿拉伯糖)中生长至0D_ = 0.6后，利用不含碳源的MMX基本培养基洗涤菌体2-3次以便除去阿位伯糖。将细菌调整到OD6tltl = 0. 1，随后分别用不含阿拉伯糖的MMX培养基和含有0. 05%阿拉伯糖的MMX培养基重悬，并继续在下摇菌培养。在有或无阿拉伯糖的 MMX培养基中，作为阳性对照的)(cc 8004菌株生长无明显的区别。但对于IFD-phoP突变菌株而言，当生长于含有阿拉伯糖的MMX培养基中时，由于重组载体上的PhoP基因仍然得以转录，该突变体的生长并未受到影响，与野生菌株相比无明显差异。但当IFD-phoP突变菌生长于不含阿拉伯糖的MMX培养基中时，由于重组载体上的PhoP停止转录，而细菌染色体上的PhoP基因已经被读框内删除，从而影响到了菌株的正常生长，其生长速度极显著地慢于其余对照菌株。请见图5的曲线图，图5(a)中细菌菌株生长于添加0.05%阿拉伯糖的MMX培养基中，显示IFD-phoP突变体生长比野生型细菌略快。图5(b)细菌菌株生长于无阿拉伯糖的MMX培养基中，显示IFD-phoP突变体生长受到显著抑制。因此，该实验进一步证明phoP是一个野油菜黄单胞菌的必需反应调节蛋白基因。当使用人工方法抑制该基因的转录后，会导致细菌生长受到强烈的抑制。序列表<110>中国科学院微生物研究所<120> 一种野油菜黄单胞菌必需基因及其编码的蛋白及应用<130>2011<160>10<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>684<212>DNA<213> 里予油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)<400>1atgcgtatccttttggtcgaagacgaagctCCgCtgCgCgagacccttgcCgCgCgCCtg60
aagcgcgaaggctttgctgttgacgctgcacaggacggcgaagaaggtctctacatgggc120
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1.一种野油菜黄单胞菌必需基因，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQID No. 1的DNA序列；(2)编码序列表SEQID No. 2的氨基酸序列的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的野油菜黄单胞菌必需基因，其特征在于，所述必需基因的检测方法为1)利用序列表中SEQID No. 3和SEQ ID No. 4的多核苷酸作为引物，经PCR方法扩增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全长片段；2)将扩增出的核苷酸序列克隆到载体上，获得在严谨性启动子控制下的重组载体；3)将重组载体转入野油菜黄单胞菌菌株中获得重组菌株；4)利用重组自杀载体对重组菌株染色体上的必需基因核苷酸序列进行读框内删除获得突变体；4)将该突变体置于培养基中，利用添加的严谨性物质作为诱导物，控制突变体中重组必需基因的转录水平，检测该必需基因对野油菜黄单胞菌生长的影响；5)确定该基因是否为必需基因。
3.根据权利要求2所述的野油菜黄单胞菌必需基因，其特征在于，所述重组自杀质粒的制备方法为1)分别用PCR扩增必需基因的上游基因和下游基因，获得上游基因片段和下游基因片段；2)将上游基因片段和下游基因片段分别克隆到自杀载体中获得重组自杀载体。
4.一种野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白，具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白，其特征在于所述蛋白为野油菜黄单胞菌生长所必需的反应调节蛋白。
6.根据权利要求5所述的野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白，其特征在于所述反应调节蛋白的检测方法为1)将32P标记的醋酸磷酸与野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白混合；2)提取混合物样品，利用电泳方法分离并进行同位素信号检测确定所述蛋白是否被磷酸化。
7.根据权利要求5所述的野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白，其特征在于所述反应调节蛋白的检测方法为1)将α-32P标记的组氨酸激酶与野油菜黄单胞菌必需基因编码的蛋白混合；2)提取混合物样品，利用电泳方法分离并进行同位素信号检测确定所述蛋白是否被磷酸化。
8.一种制备野油菜黄单胞菌必需基因编码的反应调节蛋白的方法，包括如下步骤1)利用序列表中SEQID No. 9和SEQ ID No. 10的多核苷酸作为引物，经PCR方法扩增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全长片段；2)将扩增出的核苷酸序列连接到载体上，转化到大肠杆菌菌株上；3)将获得的大肠杆菌菌株进行培养后离心收集裂解后进行亲和层析获得重组蛋白。
9.一种控制野油菜黄单胞菌生长的方法，以野油菜黄单胞菌中的蛋白或编码该蛋白的基因作为靶标筛选能控制野油菜黄单胞菌的物质，所述蛋白具有序列表中的SEQ ID No. 2 的氨基酸序列；所述编码该蛋白的基因具有序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列。
10.根据权利要求9的控制野油菜黄单胞菌生长的方法，其特征在于，所述方法是以控制野油菜黄单胞菌所述基因的转录来控制野油菜黄单胞菌的生长。
全文摘要
本发明公开了一种野油菜黄单胞菌必需基因及其编码的蛋白与应用，其必需基因具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；(2)编码序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列的多核苷酸。必需基因编码的蛋白具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列。以上述必需基因或其编码的蛋白作为靶标，可以用于筛选抗野油菜黄单胞菌的物质。本发明的必需基因及其编码的蛋白为野油菜黄单胞菌生长所必需的，因此可以作为野油菜黄单胞菌理想的、特异性的农药作用靶标。由于该菌导致的十字花科植物黑腐病是世界上大宗蔬菜生产的重大病害，对该蛋白和基因的研究、开发和应用将会对控制黑腐病发挥独特的作用。
文档编号C12R1/19GK102399793SQ20111036330
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者彭宝玉, 钱韦 申请人:中国科学院微生物研究所