专利名称：马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法
技术领域：
本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及一种马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。
背景技术：
马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis, ER)是马属动物几种高度接触传染性疾病的总称，其病原体为亲缘关系密切的两种疱疹病毒马疱疹病毒1型(EHV-I)和马疱疹病毒 4型(EHV-4)。马鼻肺炎是马的一种急性发热性传染病。在敏感马群中可100%感染，1993 年6月在新疆野马繁殖中心野马群中爆发的马鼻肺炎流行过程中，马群100%感染，成年马临床症状较轻而幼驹症状严重，临床表现为发热、上呼吸道粘膜的卡他性炎症以及白细胞减少。病程1周左右，幼驹可达IOd以上，妊娠毋马感染本病时易发生流产和产下弱驹，弱驹产下后多在48h内死亡，流产和弱驹死亡率可达80%以上。本病广泛发生于世界各地，美国、英国、日本、澳大利亚、新西兰、意大利、波兰、瑞典、比利时、爱尔兰、挪威、瑞士、葡萄牙、西班牙、法国、德国、匈牙利、加拿大、南非、巴西、 阿根廷、印度、马来西亚以及我国的台湾省和香港特别行政区等50多个国家和地区均有报导，给世界养马业带来很大危害、多数国家已将本病例为养马业重点防制疫病之一。世界动物卫生组织将马鼻肺炎列为须通报动物疫病。在大量饲养马匹进行传统耕作或以之作为农业经济一部分的国家中，EHV-I和 EHV-4这两种病毒感染呈地方性流行。从马以外的其它马属动物，如斑马、亚洲野驴和驴，已经分离到与EHV1/4亲缘关系极为密切的疱疹病毒.也可见到EHV-I感染非马属动物的个别病例，如感染牛引起流产，美洲驼引起视神经疾病和失明等。目前，尚无证据证明这两种疱疹病毒对人有感染性。马鼻肺炎的呼吸道疾病虽说可造成很大的经济损失，但最大的威胁却是给种马、赛马或娱乐马带来的潜在的流产和神经疾患后遗症。国内于1980年从流产的马胎儿中分离到了病毒(但未区分是EHV-I还是EHV-2)，并对部分省区的马匹进行了普查，总阳性率为49. 9 %，证明了本病在我国的存在。人类基因组测序已经完成，丰富的信息加深了我们对基因差异及其与疾病和疾病治疗关系的理解。越来越多的致病基因突变需要鉴定，分子生物学实验室要检测的DNA大幅度增加，迫切需要快速，精确，经济的高通量核酸检测方法。本专利采用PCR检测方法与液相芯片检测技术结合，建立了马鼻肺炎(EHV-I)的液相芯片快速检测方法，为马鼻肺炎的检测提供了又一种方法。
发明内容
本发明的目的是提供马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一种操作简单、结果准确的马鼻肺炎病毒液相芯片检测方法，及其所用到的引物，从而弥补现有技术的不足。本发明为实现上述目的，采用液相芯片技术。该技术是在核酸水平上的一种检测技术，具有准确性好、灵敏度高的特点。其原理是将编码微球单个逐一通过检测通道时受到双色激光(如红色和绿色)同时照射，第一束激光激发微球的分类荧光，根据荧光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比例也不同，从而将不同的特异性反应区分开来；第二束激光激发报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子的数量从而确定目标分子的数量(定量)。系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号， 不记录未结合的报告分子荧光信号，因此检测前无需洗脱未结合的报告分子。此外，利用流式细胞术中90°C角散射光可有效地消除微球聚集对结果造成的影响。各种荧光信号经分析软件进行数字化处理，可获得检测物的种类和数量。本发明中所涉及到的引物和探针序列如下正向引物dirct primer :5-AAGCCCAGGCATTCGCAAGACC-3~ SEQ ID NO :1反向引物reverse primer :5:CAAACCGACGCTGATGCCCACA_3~ SEQ ID NO :2探针Probe 5~ _TTAAGTGGCCCAGCATCAAACA_3~ SEQ ID NO :3。正向引物和反向引物5’端进行生物素标记；探针的5’端进行氨基化修饰。本发明的引物和探针用于检测马鼻肺炎病毒，其检测方法包括有1)检测样品 RNA的提取、2) RT-PCR扩增目的片段、3)寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR 扩增片段杂交和幻液相芯片仪分析步骤。其中步骤2~) RT-PCR反应的循环条件为第一阶段，反转录50°C :30min ；第二阶段，预变性94°C :3min ；第三阶段，扩增94°C :30s, 59°C :30s, 72°C :30s，30 个循环；第四阶段，延伸72°C :5min。本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。本发明所用到的仪器耗材信息如下表面羧基化的荧光编码微球、鞘液购置于BD 公司，TMAC temtrameihyl-ammdni μπι chloride, Tris, SDS (10% sol μ tion)购置于美国 Sigma 公司，SPAE Str印tavidin-R-phycoerythrin 购于美国 Prozyme 公司，RNA 提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司。主要设备包括BD FACSArray液相芯片仪、梯度 PCR扩增仪、凝胶成像系统、Sigma高速冷冻离心机等。通过hternet登陆美国国立生物信息技术中心(NCBI)，查询检索已公布的马鼻肺炎病毒基因序列。利用I^rimer Premierf.O软件设计引物和探针，并最终筛选出一对具有高特异性的引物和探针，参见表1。表1设计的引物和预期目的片段大小
权利要求
1.一种马鼻肺炎病毒的液相芯片检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针的核酸序列如下正向引物=SEQ ID NO 1 反向引物Γ SEQ ID NO 2 探针 Γ SEQ ID NO :3ο
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于所述的正向引物和反向引物5'端进行生物素标记；探针的5'端进行氨基化修饰。
3.一种液相芯片检测马鼻肺炎病毒的方法，其特征在于，是用权利要求2所述的引物和探针进行检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括有1)检测样品RNA的提取、2)RT-PCR扩增目的片段、幻寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR扩增片段杂交和幻液相芯片仪分析步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤2)RT-PCR反应的循环条件为 第一阶段，反转录50°C :30min ；第二阶段，预变性94°C :3min ；第三阶段，扩增 94°C :30s, 59°C :30s，72°C :30s，30 个循环； 第四阶段，延伸720C :5min0
全文摘要
本发明涉及一种马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。
文档编号G01N21/64GK102433394SQ20111042642
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者孙涛, 岳志芹, 徐彪, 朱来华, 梁成珠, 王群, 肖西志, 赵玉然, 邓明俊, 郑小龙 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心