一种人参不定根诱导增殖方法
【专利摘要】本发明涉及一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸。利用本发明所提供的方法，可以显著提高诱导获得的不定根数量，而且，将诱导获得的不定根进行增殖培养后，与利用愈伤组织进行不定根诱导的方法相比不定根增殖率更高，增殖效果更好。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养【技术领域】，具体的涉及一种人参不定根诱导增殖方法。
【背景技术】
[0002] 人参（PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科人参属多年生双子叶植物，为古老而 名贵的中药材，具有调节人体免疫力、抗癌和抗糖尿病等多种作用。人参皂苷是其主要的活 性物质。近年来，国内外对于人参的需求快速增长。但是，由于长期过度采挖，人参野生资 源已基本枯竭，且人参栽培周期长，易受气候、病虫害及栽培条件的影响，难以满足越来越 大的市场需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产， 具有很大的发展前景。
[0003] 利用发根农杆菌诱导人参产生的发根生长迅速，皂苷种类与田间栽培的人参 相同，含量比普通的细胞培养物高，且利用生物反应器大规模培养人参发根的体系也已 建 立[JeongGT,ParkDH,HwangB,etal.Comparisonofgrowthcharacteristics ofPanaxginsenghairyrootsinvariousbioreactors[J]?ApplBiochem Biotechnol，2003, 107:493]。然而，由于发根诱导过程中外源基因的导入具有潜在的安全 性问题，因此该技术没有用于商业化。
[0004] 近年来，不经过发根农杆菌转化直接诱导人参不定根的研宄取得了较大进展。但 不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的[SivakumarG,YuKW,PaekKY.Productionof biomassandginsenosidesfromadventitiousrootsofPanaxginsenginbioreactor cultures[J].EngLifeSci, 2005, 4:333]。上述方法的缺陷在于：需要先诱导愈伤组织，导 致实验周期长。
[0005] 因此，有必要提供一种简便的直接利用人参组培苗作为外植体的不定根诱导增殖 方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用人参组培苗的根、茎段或叶片诱导不定根产生及 对不定根进行增殖培养的方法。
[0007] 为达到以上目的，本发明提供了一种不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：
[0008] 将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所 述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；
[0009] 其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养 基含有浓度为l-l〇mg/L的吲哚丁酸（IBA)。
[0010] 优选的为了获得更好的人参不定根诱导增殖效果，所述固体诱导培养基和液体增 殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为2-5mg/L的吲哚丁酸。
[0011] 可选的，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基还含有浓度为1. 8-2. 2质量％的 蔗糖。
[0012] 可选的，所述诱导增殖方法包括以下步骤：
[0013] 1)将人参组培苗切割成组织小块，利用固体诱导培养基在培养温度为23_25°C的 黑暗条件下诱导培养3-6周获得不定根；
[0014] 2)将步骤1)获得的不定根切割成不定根小块，利用液体增殖培养基在培养温度 为23-25°C的黑暗条件下以50-80rpm的速度震荡培养3-9周。
[0015] 可选的，所述组织小块为对人参组培苗根进行切割获得的人参组培苗根小块、对 人参组培苗茎段进行切割获得的人参组培苗茎小块或对人参组培苗叶片进行切割获得的 人参组培苗叶小块。
[0016] 可选的，所述人参组培苗为经种子萌发或者外植体离体培养获得的组培苗，组培 苗的日龄为28-32天。
[0017] 可选的，所述人参组培苗的品种为石柱参或大马牙参。
[0018] 利用本发明所提供的方法，可以显著提高诱导获得的不定根数量，而且，将诱导获 得的不定根进行增殖培养后，与利用愈伤组织进行不定根诱导的方法相比不定根增殖率更 高，增殖效果更好。此外本发明所提供的方法可以大大缩短获得人参不定根的时间，通过直 接对人参组培苗进行不定根诱导增殖避免了将组培苗培养成完整植株后取得外植体进行 愈伤组织诱导培养的步骤，缩短了实验周期。为利用人参不定根生产人参皂苷奠定了良好 的基础，也为利用人参不定根进行代谢途径的基础研宄提供了重要的材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为人参组培苗不同组织诱导增殖产生的不定根；
[0020] 图中，（A)为利用人参组培苗根诱导培养不定根的情况；(B)为利用人参组培苗茎 段诱导培养不定根的情况；(C)为利用人参组培苗叶片诱导培养不定根的情况。
[0021] 图2为人参组培苗不同组织诱导产生不定根的增殖情况；
[0022] 图中，（A)为组培苗根；⑶为组培苗茎段；（C)为组培苗叶片；l/2MS(-N)+5mg/L IBA和l/2MS(-N)+2mg/LIBA代表培养基类型；1st代表第一次继代，2nd代表第二次继代， 3rd代表第三次继代。
[0023] 图3为五年生人参的根愈伤组织诱导产生不定根的增殖培养；
[0024] l/2MS(-N)+5mg/LIBA和l/2MS(-N)+2mg/LIBA代表培养基类型；1st代表第一次 继代，2nd代表第二次继代，3rd代表第三次继代。
【具体实施方式】
[0025] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0026] 本发明提供了一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：
[0027] 将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所 述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；
[0028] 其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(_N)培养基为基本培养 基含有浓度为l-l〇mg/L的吲哚丁酸。
[0029] 在本发明所提供的方法中，为了提高诱导和增殖的效果，所述固体诱导培养基和 液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为2-5mg/L的吲哚丁酸。
[0030] 在本发明中，所述人参组培苗为经种子萌发得到的组培苗或者经过外植体离体培 养获得的再生植株组培苗。优选的情况下，当利用本发明提供的方法对经过离体培养获得 的人参组培苗进行诱导增殖时，能够获得优异的不定根诱导增殖效果。
[0031] 其中，本发明所提供的方法对于经种子萌发得到的组培苗的获得方法没有特别的 限制，可以是按照本领域常规的处理方法获得的，例如，在本发明的一种实施方式中，经种 子萌发得到组培苗的方法可以为：取经层积处理后的人参裂口种子，剥去外壳，经70%乙 醇浸泡1分钟后，于1 %次氯酸钠中消毒20分钟，无菌水清洗3-4次后，于超净台剥出完整 胚，接种于1/2MS培养基，在24±2°C黑暗培养3天后，转入光下培养4周后即可用于不定根 的诱导。
[0032] 其中，本发明所提供的方法对于通过外植体离体培养体系获得再生植株组培苗的 方法没有特别的限制，可以是按照本领域常规的处理方法获得的，例如，在本发明的一种实 施方式中，通过外植体离体培养体系获得再生植株组培苗的方法可以为：将人参种子去壳 后，用70 %乙醇表面消毒1分钟后，转入1 %次氯酸钠溶液消毒20分钟，无菌水清洗3-4次， 然后在超净工作台用无菌解剖刀小心取出胚，接种至1/2MS培养基（含2%蔗糖和7g/L琼 月旨，pH值为5. 8)于24±2°C黑暗培养3天后，切下子叶接入MS+lmg/L2, 4-二氯苯氧乙酸的 培养基（含3%蔗糖和7g/L琼脂，pH值为5. 8)，于24±2°C，16小时光照/8小时黑暗条件 下培养。取生长状态良好的胚性愈伤组织转入不含激素的MS培养基（含5%蔗糖和IOg/ L琼脂，pH值为5. 8)进行体细胞胚的诱导。约一个月后，将诱导出的体细胞胚转入含5mg/ L赤霉素的1/2MS培养基（含2%蔗糖和2. 5g/L植物凝胶，pH值为5. 8)进行植株的萌发， 然后将再生植株转入不含順4勵3的1/2MS培养基（含2%蔗糖和2. 5g/L植物凝胶，pH值为 5. 8)进行生根培养，约3周左右即可生根，获得再生植株组培苗。
[0033] 在本发明所提供的方法中，所述组织小块为人参组培苗根小块、人参组培苗茎小 块或人参组培苗叶小块。
[0034] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述组织小块的尺寸可以约为 5mmX5mmX3mm。对所述组培苗和不定根进行切割的过程中应注意器械灭菌和保持无菌环 境以避免污染。
[0035] 在本发明所提供的方法中，1/2MS(_N)培养基为大量元素减半其他成分不变的 MS(-N)培养基，其中，MS(-N)培养基是不含有硝酸铵的MS培养基。
[0036] 其中，MS(-N)培养基的配方为：硝酸钾1900mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁 370mg/L、氯化f^HAOmg/L、碘化钾 0? 83mg/L、硼酸 6. 2mg/L、硫酸猛 22. 3mg/L、硫酸锌 8. 6mg/ U钼酸钠0? 25mg/L、硫酸铜0? 025mg/L、氯化钴0? 025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37. 3mg/L、硫 酸亚铁27. 8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0?lmg/L、盐酸[!比卩多醇0? 5mg/L、 烟酸 0? 5mg/L。
[0037] 在本发明的一种实施方式中，为了使人参组培苗的组织小块以及诱导获得的不定 根获得更加充分的营养，所述固体诱导培养基中还含有浓度为1. 8-2. 2质量％的蔗糖以及 浓度为〇. 65-0. 75质量％的琼脂。所述液体增殖培养基中含有浓度为1. 8-2. 2质量％的蔗 糖。
[0038] 在本发明的一种实施方式中，所述固体诱导培养基、液体增殖培养基的pH为 5. 8-6. 0〇
[0039] 具体的，所述诱导和增殖的步骤包括：
[0040] 1)将人参组培苗切割成组织小块，利用固体诱导培养基在培养温度为23_25°C的 黑暗条件下诱导培养3-6周获得不定根；
[0041] 2)将步骤1)获得的不定根切割成不定根小块，利用液体增殖培养基在培养温度 为23-25°C的黑暗条件下以50-80rpm的速度震荡培养3-9周。
[0042] 其中在步骤1)中，组织小块在固体诱导培养基中培养14-28天后开始长出不定 根。一般的，在固体诱导培养基中培养结束后诱导获得的不定根的数目可以达到4-13个； 具体的，利用人参组培苗根小块一般能够诱导获得10-13个不定根；利用人参组培苗茎小 块一般能够诱导获得8-12个不定根；利用人参组培苗叶小块一般能够诱导获得4-8个不定 根。
[0043] 在所述诱导培养和增殖培养的过程中，一般需要每3周时间更换一次固体诱导培 养基或液体增殖培养基进行继代培养，并在每次继代时统计观察不定根的诱导和增殖情 况。
[0044] 下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施 例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术 人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0045] 以下实施例中，采用辽宁宽甸县的石柱参品种。以下实施例中人参组培苗通过种 子萌发的方式获得，具体为：取经层积处理后的石柱参裂口种子，剥去外壳，经70%乙醇浸 泡1分钟后，于1 %次氯酸钠中消毒20分钟，无菌水清洗3-4次后，于超净台剥出完整胚，接 种于1/2MS培养基，24 ±2°C黑暗培养3天后，转入光下培养，获得日龄为30天的组培苗。
[0046] 不定根诱导率=(产生不定根的外植体数/接种外植体总数）X100%。
[0047] 第三周不定根增殖率=(增殖第三周收获不定根鲜重-接种不定根鲜重）/接种 不定根鲜重XlOO% ;
[0048] 第六周不定根增殖率=(增殖第六周收获不定根鲜重-增殖第三周收获不定根鲜 重）/增殖第三周收获不定根鲜重Xioo% ;
[0049] 第九周不定根增殖率=(增殖第九周收获不定根鲜重-增殖第六周收获不定根鲜 重）/增殖第六周收获不定根鲜重X100% ;
[0050] 实施例1
[0051] 本实施例用于说明利用人参组培苗根诱导不定根。
[0052] 取人参组培苗的根，用灭菌刀切割成约5mmX5mmX3mm的小段，转入含 l/2MS(-N)+2mg/LIBA的固体诱导培养基上（固体诱导培养基中含2%蔗糖，7g/L琼脂，pH 值为5. 8)，于24±2°C，黑暗条件下诱导培养不定根的产生。每个培养皿接种30个外植体， 诱导培养过程中每三周继代一次，统计不定根诱导率和每个外植体产生的不定根数，试验 重复3次，取平均值，结果列于表1。
[0053] 结果显示，经过三周培养后，所有的根都能诱导出不定根，且每条根上均只诱导出 1条不定根，但经过六周培养后（诱导培养不定根的情况见图1A)，平均每条根上产生的不 定根数为11. 33条（见表1)。
[0054] 实施例2
[0055] 本实施例用于说明人参组培苗根诱导产生的不定根的增殖培养。
[0056] 将实施例1中诱导培养六周后得到的人参组培苗根诱导产生的不定根取出，切成 Icm尺寸的小块，将小块接入含有100mll/2MS(-N)+2mg/LIBA+20g/L蔗糖的液体培养基 的培养瓶中，置于摇床中于24±2°C黑暗条件慢速震荡（60rpm)，进行不定根的增殖培养。 每三周继代一次，并统计不定根的鲜重，试验重复3次，取平均值。将培养得到的不定根取 出，灭菌滤纸吸取表面的培养液，置于天平进行称重，即为鲜重。计算不定根的增殖率，结果 显示（见图2A)，在含有2mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)培养液中培养三周后，增殖率 为17. 73% ;培养六周后，增殖率显著提高，为27. 45% ;当经过九周培养后，增殖率略有下 降，为 25. 88%。
[0057] 实施例3
[0058] 本实施例用于说明人参组培苗根诱导产生的不定根的增殖培养。
[0059] 根据与实施例2相同的方法对人参组培苗根诱导产生的不定根进行增殖培养。区 别仅在于，所使用的液体增殖培养基为含有5mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)液体增 殖培养基。计算不定根的增殖率，结果显示（图2A):增殖培养三周后，增殖率为24. 4%;增 殖培养六周后，增殖率为32. 27%，当经过九周培养后，增殖率为22. 25%。
[0060] 实施例4
[0061] 本实施例用于说明利用人参组培苗茎诱导不定根的方法。
[0062] 取人参组培苗的茎段，用灭菌刀切割成约5mmX5mmX3mm的小段，转入含 l/2MS(-N)+2mg/LIBA的固体培养基上（固体诱导培养基中含2%蔗糖，7g/L琼脂，pH值 为5. 8)，于24±2°C，黑暗条件下培养诱导不定根的产生。每个培养皿接种30个外植体，每 三周继代一次，并统计不定根诱导率和每个外植体产生的不定根数，试验重复3次，取平均 值。结果显示，经过三周培养后，有27. 94%的外植体能诱导能产生不定根，且每条根上均只 诱导出1条不定根，但经过六周培养后，所有的外植体都产生了不定根（诱导培养不定根的 情况见图1B)，平均每条根上产生的不定根数为10. 33条（见表1)。
[0063] 实施例5
[0064] 本实施例用于说明人参组培苗茎诱导产生的不定根的增殖培养方法。
[0065] 将实施例4中培养六周后得到的人参茎诱导产生的不定根取出，切成Icm大小， 接入含有100ml1/2MS(-N) +2mg/LIBA+20g/L蔗糖的液体增殖培养基的培养瓶中，置于摇 床，24±2°C，黑暗条件慢速震荡（60rpm)，进行不定根的增殖培养。每三周继代一次，并统 计不定根的鲜重，试验重复3次，取平均值。将培养得到的不定根取出，灭菌滤纸吸取表面 的培养液，置于天平进行称重，即为鲜重。计算不定根的增殖率，结果显示（见图2B)，在含 有2mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)培养液中培养三周后，增殖率为270% ;培养六周 后，增殖率为188% ;当经过九周培养后，增殖率为142%。
[0066] 实施例6
[0067] 本实施例用于说明人参组培苗茎诱导产生的不定根的增殖培养。
[0068] 根据与实施例5相同的方法对人参组培苗茎诱导产生的不定根进行增殖培养。区 别仅在于，所使用的培养基为含有5mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)液体增殖培养基。 计算不定根的增殖率，结果显示（见图2B)，增殖培养三周后，增殖率为295%;培养六周后， 鲜重增殖率为169%，当经过九周培养后，增殖率为126%。
[0069] 实施例7
[0070] 本实施例用于说明人参组培苗叶诱导不定根的产生。
[0071] 取人参组培苗的叶片，用灭菌刀切割成约5mmX5mmX3mm的小段，转入含 l/2MS(-N)+2mg/LIBA的固体培养基上（固体诱导培养基中含2%蔗糖，7g/L琼脂，pH值 为5. 8)，于24±2°C，黑暗条件下培养诱导不定根的产生。每个培养皿接种30个外植体，每 三周继代一次，并统计不定根诱导率和每个外植体产生的不定根数，试验重复3次，取平均 值。结果显示，经过三周培养后，所有的叶片都没有不定根的产生，但经过六周培养后（诱 导培养不定根的情况见图1C)，有87. 78%的外植体诱导产生了不定根，平均每条根上产生 的不定根数为6. 33条（见表1)。
[0072] 实施例8
[0073] 本实施例用于说明人参组培苗叶片诱导产生的不定根的增殖培养。
[0074] 将实施例7中培养六周后得到的人参叶片诱导产生的不定根取出，接入含 有100mll/2MS(-N)+2mg/LIBA+20g/L蔗糖的液体增殖培养基的培养瓶中，置于摇床， 24±2°C，黑暗条件慢速震荡（60rpm)，进行不定根的增殖培养。每三周继代一次，并统计不 定根的鲜重，试验重复3次，取平均值。将培养得到的不定根取出，灭菌滤纸吸取表面的培 养液，置于天平进行称重，即为鲜重。计算不定根的增殖率，结果显示（见图2C)，在含有 2mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)液体增殖培养基中增殖培养三周后，增殖率为713%; 培养六周后，增殖率为331% ;当经过九周培养后，增殖率为77. 42%。
[0075] 实施例9
[0076] 本实施例用于说明人参组培苗叶诱导产生的不定根的增殖培养。
[0077] 根据与实施例8相同的方法对人参组培苗叶诱导产生的不定根进行增殖培养。区 别仅在于，所使用的培养基为含有5mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)培养液，计算不定 根的增殖率，结果显示（见图2C)，增殖培养三周后，增殖率为638%;培养六周后，增殖率为 216%，当经过九周培养后，增殖率下降为83. 44%。
[0078] 表 1
[0079]
【权利要求】
1. 一种人参不定根诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不 定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固 体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为l-10mg/ L的吲哚丁酸。
2. 根据权利要求1所述的不定根诱导增殖方法，其特征在于，所述固体诱导培养基和 液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为2-5mg/L的吲哚丁酸。
3. 根据权利要求1或2所述的不定根诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将人参组培苗切割成组织小块，利用固体诱导培养基在培养温度为23-25°C的黑暗 条件下诱导培养3-6周获得不定根； 2) 将步骤1)获得的不定根切割成不定根小块，利用液体增殖培养基在培养温度为 23-25°C的黑暗条件下以50-80rpm的速度震荡培养3-9周。
4. 根据权利要求3所述的不定根诱导增殖方法，其特征在于，所述组织小块为人参组 培苗根小块、人参组培苗茎小块或人参组培苗叶小块。
5. 根据权利要求4所述的不定根诱导增殖方法，其特征在于，所述固体诱导培养基和 液体增殖培养基中还含有浓度为1. 8-2. 2质量％的蔗糖。
6. 根据权利要求5所述的不定根诱导增殖方法，其特征在于，所述人参组培苗为经种 子萌发或者外植体离体培养获得的组培苗，组培苗的日龄为28-32天。
7. 根据权利要求1-2,4-6中任意一项所述的不定根诱导增殖方法，其特征在于，所述 人参组培苗的品种为石柱参或大马牙参。
【文档编号】A01H4/00GK104472359SQ201410698528
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】卢善发, 王梅珍 申请人:中国医学科学院药用植物研究所