一种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法

专利名称：一种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法。
背景技术：
目前人们普遍使用PCR方法获得外源基因，首先在克隆载体上进行测序，证实无误后再 亚克隆至表达载体，这增加了分子生物学操作步骤，也增加了基因转移过程中出错的几率， 同时，在亚克隆时对外源基因5'端酶切位点的种类要求严格，它要求克隆载体和表达载体 中外源基因上游存在共同的酶切位点。对酶切位点的限定大大影响了 ATG与SD保守序列之间 距离的选择。而二者之间的距离对基因表达水平有极大的影响。研究结果表明，SD保守序列 与ATG之间以6—12个碱基为最佳，超出此范围会降低蛋白质的表达水平。
目前要在特定宿主细胞表达外源蛋白必须使用与之相适应表达体系。对于原核表达系统 来说，原核表达体系中使用的启动子类型主要有基于lac操纵子的启动子、T7噬菌体启动子、 入噬菌体PL启动子、碱性磷酸酶phoA启动子等。含这些启动子的体系表达外源蛋白时都需 要满足特定的诱导条件。诱导lac启动子需要cAMP激活蛋白，即CAP，而在含葡萄糖的培养 环境中CAP含量很低，外源基因不能表达。也就是说含lac启动子载体必须在无葡萄糖培养 时才能表达外源蛋白，而且还需要补加IPTG诱导。但是IPTG价格昂贵，不能用于大量诱导。 用T7噬菌体启动子时，宿主菌细胞内必须能提供T7噬菌体基因1的产物，即T7噬菌体RNA 聚合酶，要么由感染性入噬菌体提供，要么由插入目的宿主菌染色体的基因产生， 一般采用 的溶源性细菌BL21 (DE3)，其中T7噬菌体基因1是受控于IPTG诱导的了 lac UV5启动子。 用入噬菌体PL启动子时，其受控于温度敏感阻抑物clts857，宿主菌必须携带clts857基因， 阻抑物clts857在低温下启动表达，高温时不能。phoA启动子是碱性磷酸酶启动子，在过量 磷酸盐存在时被抑制，磷酸盐饥饿时被逐渐诱导。
因此，目前没有任何一种表达体系可在无需诱导条件下进行外源基因的表达，更不用说 能在不同宿主细菌中表达。 发明内容-
本发明提供了一种无需诱导，能在多种不同的宿主细菌中高效表达目的蛋白的表达体系 及其构建方法，该表达体系克服现有技术的不足，实现了无需诱导的条件下进行外源基因的 高效表达。
3本发明所述的无诱导高效蛋白表达体系，包括NAD(P)H脱氢酶基因启动子和pMD 18-T simple克隆载体，在启动子序列的3'端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此构建 的片段插入pMD 18-T simple克隆载体的T克隆位点中，形成环状的表达质粒，所述的NAD(P)H 脱氢酶基因启动子的序列如SEQ1所示，所述的SD序列如SEQ2所示。
本发明还可以在目的基因后面接有强终止密码子TGA。
本发明通过以下技术方案实施的
(a) 以希瓦氏菌S12基因组DNA为模板通过PCR方法扩增其NAD(P)H脱氢酶基因启动 子；
(b) 设计引物PCR扩增目的基因，在其5'端加入高效SD序列；
(c) 设计引物桥，将步骤(a)得到的NAD(P)H脱氢酶基因启动子与步骤(b)得到的 含有目的基因的片段连接，连接产物与pMD 18-T simple载体重组，使连接产物 插入pMD 18-T simple载体的T克隆位点，形成环状的表达质粒，即为无诱导高 效蛋白表达体系；
将步骤(c)得到的重组质粒转入受体菌中，表达目的蛋白。
本发明所述的目的基因可以是三苯基甲垸氧化酶基因&历"，受体菌可以是￡c^j'DH5
a，还可以是脱色希瓦氏菌S12。
本发明所述的目的基因可以是荧光蛋白EYFP基因，受体菌可以是￡^乃'S17 — l。 本发明构建的无诱导高效表达体系，转化进入受体菌后，能在无需诱导的情况下，高效
的表达目的蛋白。
利用本发明所构建的无诱导高效表达体系，是利用了在细菌中广泛发挥作用的NAD (P) H脱氢酶基因的启动子，所构建的体系表达目的蛋白无需昂贵的IPTG或者其他诱导物诱导， 不受细菌种类的限制，只要转化进细菌细胞，即可发挥作用，高效表达目的蛋白，其表达量 甚至超过原始基因在原始宿主的表达量，因而大大扩展了应用领域，本发明构建的表达体系 是以pMD 18-T simple克隆载体为基础，因此具有操作容易，拷贝数高的特点，这大大简化 了操作步骤，减少了基因出错的几率。由于未影响LacZ基因片段的a互补功能，蓝白筛选手 段仍然适于对重组子的筛选大大简化了筛选目的转化子的工作，同时可利用载体的通用引物 进行测序验证。利用这一表达体系构建方法不仅节约时间、减轻工作量，而且成功率、可靠 性都比较高。


图1是细菌对染料结晶紫的脱色能力比较图，其中1是￡. coh'DH5a/pMD-18T， 2是￡ coh'
4DH5 a ， 3是￡ co力'DH5 a /pt卿D， ， 4是DN322， 5是￡ c。力.DH5 a /pSPrtpmD';
图2是细菌对染料孔雀石绿的脱色能力比较图，其中1是￡ co力'DH5 a /pMD_18T, 2是￡ co"'
DH5 a ， 3是￡ co乃'DH5 a /ptmpD， ， 4是DN322， 5是￡ co7i DH5 a /pSPrtpmD，；
图3是细菌对染料灿烂绿脱色能力比较图，其中1是￡ co力'DH5 a /PMD-18T， 2是￡ coh'DH5
a ， 3是￡ coh' DH5 a /ptmpD， ， 4是DN322， 5是￡ coh' DH5 a /pSPrtpmD，；
图4是细菌对染料碱性品红的脱色能力比较图，其中1是￡ coh'DH5 a /pMD_18T， 2是￡
DH5 a ， 3是￡ co7i DH5 a /ptmpD， ， 4是DN322， 5是￡ co7i DH5 a /pSPrtpmD ，;
图5是TpinD酶酶谱检测图(结晶紫染色)，其中1是￡ co7/ DH5 a , 2是￡DH5 a /
ptpmD， ， 3是DN322， 4是￡ ca// DH5 a / pSPrtpmD， ， 5是￡ coW DH5 a/pMD18-T;
图6是各细菌提取的粗酶液的SDS-PAGE电泳图，其中1是￡ co力'DH5 a ， 2是￡ coW DH5 a /
pSPrtpmD' ， 3是AcW DH5a/ptpmD，；
图7 ^ffl菌对对染料结晶紫的脱色能力比较图8是细菌对染料孔雀石绿的脱色能力比较图9是细菌对染料灿烂石绿的脱色能力比较图IO是细菌对染料碱性品红的脱色能力比较图ll是大肠杆菌中荧光蛋白基因在启动子控制下的表达，其中l是f co^S17-l， 2是￡ 1/
S17-l/pEYFP， 3是￡ c。2i S17-l/pEYFP-SP;
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制 实施例l
应用无诱导高效蛋白表达体系表达三苯基甲垸氧化酶&历"
(1) 5MV^ro膨"r (S7^的获得 根据幼e『朋e^ssp. ANA-3基因组序列数据，第0316阅读框的Promoter序列，设计上
下游引物为
prometerEF: 5， TTTTTCTTTTTTATGGGCTA 3，； proraeterER: 5' TTTAGACATMTCTGCTCCG 3'。
以脱色希瓦氏菌S12基因组DNA为模板PCR扩增NAD(P〉H脱氢酶基因的Promoter序列， 命名为5"yV"尸ro膨ter f57^ 。 PCR反应条件为94 'C变性4min后进入30个循环94°C变性30s ， 43'C退火30s， 72'C延伸45s;最后延伸7min。扩增产物为98bp。扩增产物用1%琼脂糖凝 胶进行电泳分析并回收纯化。
5(2) t/M /T的获取
tpmD基因的序列如SEQ3所示，根据tpmD基因序列，设计上下引物为 TpmDEF: "aTA46^^(S46^Z47/46M7arATGATGTCAATTGCGGTG TpmDC4ERl: TCACm^L^赢dg^/Orgd6CATTTTCAGGGCTTG
在上游引物5'端含有高效SD序列；下游引物5'端含有强终止密码子PCR扩增反应为 30个循环，94。C预变性5min后进入30个循环94。C变性45s， 52。C退火45s， 72。C延伸lmin30s， 最后72。C延伸10min。 919bp的扩增产物命名为^wZ^ 。
(3) 5Pr和&历圹两片段的融合
设计引物桥bridge: 5' GCCCATAAAAAAGAAAAAGGGGGAGGTATTGAGAAG 3，进行三引物 (p匿terEF， bridge, TpmDC4ERl) PCR扩增，1017bp的PCR产物命名为SPrtpmD， 。
PCR反 应条件为94。C预变性5min后进入30个循环94。C变性lmin, 52。C退火1. 0min， 72。C延伸 2. 0min，最后72'C延伸lOmin，将按此方法构建的5Fr和^M Z^的融合片段命名为SPrtpmD'。
(4) 目的片段的回收 按照上海生工生物工程技术有限公司凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。
(5) 载体pMD18 T simple vector与融合基因SPrtpmD，的连接
目的DNA:5ml，载体DNA: 1 u L， T4连接酶1 u L, 10Xbuffer: 1 u L，无菌水2uL， 16。C恒温过夜，使得载体pMD18 T simple vector与融合基因SPrtpmD，的连接，由此构建 重组质粒pSPrtpmD'。
(6) 转化筛选与验证
重组质粒pSPrtpmD，转化￡. coh' DH5ci感受态细胞。10 u L连接产物分别加入到200 wl感受态细胞中，轻轻摇匀，冰浴30分钟；42"C水浴中热击90秒，然后迅速置于冰上冷 却3-5分钟，加入0. 8mlLB液体培养基(不含Amp)于37。C振荡摇床上90rpm低速振荡培养1 小时，使细菌恢复正常生长状态。4°C, 10000rpm离心10min，弃去部分上清，4'C保存备用。 用X-gal和IPTG筛选阳性重组子菌落一蓝白斑筛选；分别挑取AmpK表型菌株(白色菌落)， 通过PCR与测序鉴定，符合预期构建好的序列为阳性克隆子，命名为Aco力'DH5a/ pSPrtpmD，。
将tpmD'与pMD18-T克隆载体连接，转化进入A cWi DH5 a ，筛选阳性克隆，得到的 阳性克隆子命名为A c。W DH5 a / ptpmD，。
将空载体pMD18-T克隆载体转化进入￡ DH5a ，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆 子命名为E coh' DH5 a /pMD18-T。(7) 菌悬液的制备
将经单菌落纯化的f.co7/ DH5a/ pSPrtpmD'菌株和co 2' DH5 a / ptpmD，菌株与 ￡ coh' DH5 a 、嗜水气单胞菌DN322及￡ coh' DH5 a /pMD18-T分别在LB培养基中培养过夜， 取相同0D值的菌液于6000 r mirT'下离心10min收集菌体，用PBS(pH=8. 0)洗菌体2次， 重悬于PBS(pH-8. O)中。
(8) 脱色实验
将各菌悬液分别接种于30mL染料浓度为100mg/L的染料培养基中，3(TC下静置培养。 染料培养基
酵母抽提物 0.2g KH2P04 2.66g
NaCl 2.5g (NH4)2S04 0.5g
Na2HP04-7H20 4.32g H20 200mL
12rC蒸汽灭菌20min ，按上述浓度加入灭过菌染料贮备液。 每隔lh时间取培养液用8000Xg离心去除菌体，用紫外一可见分光光度计分别在各染料 的最大吸收峰处测定各上清液的吸光值，并以不加菌的染料培养基为对照，按以下公式计算 脱色率"。
;7= (J-5) /JX100% 式1
式中，j为不加菌的染料培养上清液的吸光值，5为加菌的染料培养上清液的吸光值。本次脱
色实验是对染料结晶紫，孔雀石绿，灿烂绿，碱性品红。脱色率测定结果见图l、 2、 3、 4。 由图1、 2、 3、 4可以看出，含有希瓦氏菌启动子SPr的融合基因重组菌株E.coli DH5 a / pSPrtpmD'的脱色速率比只含有嗜水气单胞菌DN322氧化酶基因tpmD的重组菌株E. coli DH5 a / ptpmD'快；脱色效率要高，其脱色效率甚至比嗜水气单胞菌DN322还高。而受体菌株 E. coli DH5 a以及只含有空载体的受体菌株E. coli DH5 a /pMD18-T在脱色速率和效率很低且 随时间的变化很小，由此可以说明本方法构建的表达体系能在无诱导的条件下高效表达目的 蛋白。
(9) 各菌粗酶液酶活测定，PAGE电泳酶谱染色，SDS-PAGE电泳 A.粗酶液的制备
经过纯化的菌株E. coli Z /^a7 pSPrtpmD，和E.coli ZW5a7 ptpraD，与E.coli ZW5a 及E. coli ZW5c/pMD18-T在37。C培养16个小时后各取lml，离心收集菌体使用0. 5mlPBS缓 冲液重悬菌体。于超声波破碎仪上间隔3秒破碎3秒，总破碎时间为15分钟。细胞裂解液经
716000r/min离心15分钟，上清液即为粗酶液。
B. 蛋白质浓度的测定
参照Bradford的方法(Bradford, 1976)。将的待测蛋白样品分别吸入到微孔板， 每个样品中加入4(￥1试剂(Bio-Rad)后完全混匀。室温放置5-10min后在分光光度计上于 595nm测定吸收值。用牛血清蛋白作标准曲线。
C. 酶活力的测定
酶活测定在25'C条件下进行，反应总体积为100uL。 77化的50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7. 5)与的粗酶抽提物混合后，加入5叱5mmol/L的染料(终浓度为0. 25raraol/L)。加入3叱 25mmol/L的NADH(终浓度0. 75mmol/L)后，立即于分光光度计上连续测定染料在最大吸收波 长处0D值随时间的变化。结晶紫的最大吸收波长为590nm。以IO(TC， 30min灭活酶液的反应 混合液为对照，酶活单位定义为以25。C条件下每分种催化lmg染料所需要的酶量为1个酶活 单位(U)。测定结果见表l。
表1各菌株粗酶液酶活力比较
染料￡ c。力.ffl5 a pSPrtpmD，/ JerazKms DN322/7/ahp&7a ￡ca/y ffl5 a ptpmD，/ ￡c。A.鹏 a￡ c。A'ffl5 a /{M18-T
结晶紫48.00U35.29U3. 77U0U0U
孔雀石 绿41. 38U33. 33U2, 85U0U0U
灿烂绿39. 23U32.44U2. 73U0U0U
碱性品 红30.18U25.35U2. 56U0U0U
由表1可见，￡ co乃'DH5 a以及只含有空载体的受体菌株￡ cWi DH5 a /pMD18-T检测 不到酶活，而基因工程菌的三苯基甲烷染料氧化酶活性可测到，工程菌株￡a^'DH5a/ pSPrtpmD'的三苯基甲垸染料氧化酶活性超过了基因供体菌株DN322;这是由于重组菌株转化 进了三苯基甲烷染料氧化酶基因tpmD，并得到了高效表达，提高了工程菌的三苯基甲烷染料 氧化能力。
D. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
按Davis方法进行(何忠效，1999 )，分别配制分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液和电泳缓冲 液，不连续缓冲体系凝胶浓度为10%，电极缓冲液pH值为8.3。电泳在室温条件下进行。
E. 脱色酶酶谱染色
8按上述方法进行电泳，将PAGE电泳完毕的胶立即浸泡于50mL浓度为200mg/L的结晶紫 染料溶液中10rain，随后转入含2mmol/L NADH的磷酸缓冲液(pH 7. 0)中，室温放置10min，观 察脱色带的显现。凝胶背景中深紫色的染料被脱色的透明带区即为脱色酶的位置。酶谱实验 结果见图5，由图5可见，在第2泳道的￡ co7i DH5a / ptpmD，、第3泳道的Zero/z o朋s AK^ro; /^7a DN322和第4泳道的￡ c^i DH5 a / pSPrtpmD，上都具有明显的酶谱条带且酶 谱在胶中的位置相同；而在第1泳道的￡ DH5 a及第5泳道的￡ DH5 a /pMD18-T 胶上同一位置没有呈现出酶谱条带。这一结果说明重组菌株￡ co"' DH5a / pSPrtpmD'和 ￡ co7i DH5a / ptpmD，与亲本^ero历o/ a / ydrop/u7a DN322菌株在脱色功能和酶蛋白表观 分子量上完全一致；同时也证实了脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子序列能够 被大肠杆菌DH5 a识别，以及不需诱导物的条件下高效启动下游基因的转录表达。
F. SDS-PAGE电泳
按Laemmli方法进行(Laemmli， 1970),不连续缓冲体系凝胶浓度为12%，电极缓冲液pH 值为8.3。
G. 考玛斯亮蓝R-250染色方法
参照《蛋白质电泳技术》(郭尧君，1999)中的考玛斯亮蓝R-250染色方法， 将电泳胶浸泡于固定液中至少30min，转移至染色液中，加热至6(TC染色lOmin，倒出 染色液，加入脱色液，多次更换并加热脱色液，直至背景脱净为止。结果见图6，由图6可 以看出，第l， 2， 3泳道都有多条蛋白质带出现，其中2,3泳道在胶上相同位置比第1泳道 多出一条带，且第2泳道的这一条带比第3泳道的要颜色深很多。表明在菌株E.coli /F5" / pSPrtpmD，和￡ cW/DH5 a/ptpmD，粗酶液中存在同一种蛋白质，这一蛋白带是不存在与 菌株E.coli ZW5"的粗酶液中的；且这一蛋白质在相同总量蛋白质的粗酶液中菌株E.coli ZW5ff/ pSPrtpmD，中的含量明显比￡ co7j' ZM a7 ptpmD，多许多。这一结果从蛋白质量的 角度为表1的结论提供了互证，从本实施例可以看出构建的表达体系是能够无诱导的情况下 高效的表达目的蛋白。
实施例2
一种无诱导高效三苯基甲垸氧化酶表达体系(在脱色希瓦氏菌中)的应用
本实施例的重组质粒pSPrtpmD'的构建方法同于实施例l，将重组质粒pSPrtpmD'转化 进入脱色希瓦氏菌中，筛选转入了重组质粒pSPrtpmD'的阳性克隆子，命名为S12/ pSPrtpmD'。
9(1) 菌悬液的制备将经单菌落纯化的S12/ pSPrtpmD'菌株与亲本菌株嗜水气单胞菌 DN322和脱色希瓦氏菌S12分别在LB培养基中培养过夜，取相同0D值的菌液于6000 r min—'下离心10min收集菌体，用PBS(pH=8. O)洗菌体2次，重悬于PBS(PH=8. 0) 中。
(2) 脱色实验将各菌悬液分别接种于30mL染料培养基中，3(TC下静置培养。 染料培养基
酵母抽提物 0.2g KH2P04 2.66g
NaCl 2.5g (NH4)2S04 0,5g
Na2HP047H20 4.32g H20 200mL
12rC蒸汽灭菌20min ，按需加入灭过菌染料贮备液。
每隔lh时间取培养液用8000Xg离心去除菌体，用紫外一可见分光光度计分别在各染料的最 大吸收峰处测定各上清液的吸光值，并以不加菌的染料培养基为对照，按以下公式计算脱色 率 7。
/7= (J-万)〃X100% (1) 式中，力为不加菌的染料培养上清液的吸光值，^为加菌的染料培养上清液的吸光值。本次脱 色实验是对染料结晶紫，孔雀石绿，灿烂绿，碱性品红，脱色率测定结果见图7、 8、 9、 10。 由图7、 8、 9、 IO可以看出，S12菌通过质粒pSPrtpmD'获得了高效的三苯基甲垸染料降解 脱色能力，其脱色能力甚至比嗜水气单胞菌DN322还高。
实施例3
应用无诱导高效蛋白表达体系表达荧光蛋白EYFP 本实施例的启动子序列5MFr，"er^尸rj的获得同于实施例1 (1) EYFP的PCR扩增
根据质粒pEYFP的序列信息设计引物
ey御F: g/L4g&4fi4 7>17M6M7UTATGAGTAAAGGAGAAGAAC;
e/娜TTATTTGTATAGTTCATCCATGCC
上游引物5，端含有SD序列；PCR扩增EYFP条件为94。C预变性4min后进入30个循 环94。C变性45s， 55。C退火45s， 72。C延伸lmin，最后72。C延伸10min。 717bp的扩增产物 命即为eyfp基因。质粒pEYFP可以从商业公司购买到。
10(2) SPr和EYFP两片段的融合
设计引物桥bridge: 5， CCTTTACTCATGGGATGTATATCTCCTTCTTTAGACATMTCTGCTC 3，，并将引 t/^及实施例1中的弓嫩prometerEF和ej^bER加入反应体系进行三弓嫩PCR扩增。PCR反应条件 为94'C预变性4min后进入30个循环94'C变性lmin， 52。C退火1. 0min， 72。C延伸1. 5min， 最后72X:延伸10min。
(3) 目的片段的回收 按照上海生工生物工程技术有限公司凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。
(4) 载体pMD18 T vector与融合基因SPrEYFP的连接
按照目的DNA:5uL,载体DNA: 1 u L， T4连接酶1 u L， 10Xbuffer: 1 u L，无菌水 2ixL配制连接反应体系，16"C恒温过夜连接，获得的pEYFP-SP重组质粒。
(5) 转化筛选与验证
重组质粒pEYFP—SP转化￡ co乃'S17 — l感受态细胞。10uL连接产物分别加入到200 ul感受态细胞中，轻轻摇匀，冰浴30分钟；42'C水浴中热击90秒，然后迅速置于冰上冷 却3-5分钟，加入0. 8mlLB液体培养基(不含Amp)于37。C振荡摇床上90rpm低速振荡培养1 小时，使细菌恢复正常生长状态。4°C， 10000rpm离心10min，弃去部分上清。然后将菌悬液 涂布在含X-gal和IPTG的A卿平板上，37。C过夜培养；挑取An^表型菌株，通过PCR与测序 鉴定符合预期的即为阳性克隆子，命名为^co力'S17 — l/ pEYFP—SP。
将pEYFP基因与克隆载体pMD 18-T simple连接，转化进入￡ co/i S17 — l，筛选阳性 克隆子，命名为co7i S17 — l/pEYFP。
(6) 阳性克隆子荧光蛋白表达分析
将经单菌落纯化的￡ S17—l/ pEYFP—SP菌株与亲本菌株￡ co乃'S17 — l/ pEYFP和 ￡ c。h'S17 — l分别在LB培养基中培养过夜，取相同0D的菌液于6000 r min—下离心10min 收集菌体，用PBS (pH=8. 0)洗菌体2次，重悬于10 u L PBS (pH=8. 0)中。取该菌悬液5 n L在 LB (Amp"平板上划线培养，37'C过夜。取长好的平板放在紫外灯下通过观察荧光强度比较 荧光蛋白表达。由图ll可以看出，实验中的荧光蛋白基因载体pEYFP即使在原始大肠杆菌宿 主中表达效果也不甚理想，而在该荧光蛋白基因前设计加入S12启动子SPr序列后通过初步 在大肠杆菌中表达情况来看，在该启动子作用下大肠杆菌E. colisl7-1/pEYFP-SP菌体荧光明 显增强，因此可以证明本表达体系可以在无诱导的条件下高效的表达荧光蛋白。
由上述实施例可以看出本发明构建的无诱导高效蛋白表达体系无需诱导，且不受细菌种类 的限制，只要转入受体菌就可以高效表达目的蛋白。序列表
<110>广东省微生物研究所
<120>—种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法
<160> 3
<210〉 1
<211>98
<212> DNA
〈213〉脱色希瓦氏菌(幼e丽"e〃a cfeco/ora"'ow!X) S12 <400> 1
TTTTTCTTTT TTATGGGCTA ATAAACTAAG CCCATAGAGT CGAGAGCAAG TTGAAAGACT 60 CTCAAGAATT TCAATTTTCG GAGCAGATTA TGTCTAAA 98
<210>2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列 <400〉 2
GAAGGAGATA TACATCCC 18
<210>3
<211>864
<212>DNA
<213>嗜水气单胞菌DN322 /^dropW/fl subsp. DN322)
<220>
<221>CDS
<400> 3
ATGTCAATTG CGGTGACGGG TGGTACTGGT CCACTCGGTG GGCTTGTGAT TCAACATTTG 60 CTCAAAAAAG TTCCCGCCAG TCAAATCATT GCCATCGTGC GTAATGTTGA AAAAGCCTCT 120 ACTCTTGCCG ATCAAGGCGT GGAAGTTCGC CATGGCGACT ATAATCAACC GGAATCTCTT 180 CAAAAGGCTT TTGCAGGTGT CTCCAAGCTG CTCTTTATCT CAGGTCCGCA TTATGATAAT 240 ACGCTTCTTA TCGTTCAACA TGCAAATGTC GTAAAAGCTG CCAGAGATGC GGGAGTCAAA 300 CATATTGCTT ACACAGGATA TGCCTTTGCT GAGGAATCAA TAATTCCCCT TGCACACGTA 360 CATTTAGCAA CGGAATATGC CATCCGTACG ACCAATATCC CGTATACTTT CCTGCGTAAT 420GCCTTATATA CGGACTTTTT TGTAAATGAG ATTGTTACGA ATGCGGGAAG CGGGATCGTT GCTGCCGCAA CGGTTCTTAC AGAGGAAGGG AATCAACCGT GGACCTTTGA TGAACTTGCC GTCGTGCATC AGCCTGTCTC ATTCGAAGAA CCTGAGCCGT TTGCTGAAAT TACGGCAGCG TCCAAAACAT CAGATGGTCT GCAAAAACTG GTAAAACAAG CCCTGAAAAT GTGA
GGGCTGCGCG CATCCATAGA GTCTGGAGCA 480 AATTCAGTAA CACGCAATGA ACTTGCTTTG 540 CATGAAAACA AAACGTATAA CCTTGTTTCC 600 CAAATTCTCT CCGAGGTTTC CGGCAAAAAA 660 GAGAAAAATT TCCTCGTAAA CGCTGGTGTC 720 ATCTATGACG CGATTTCCAA AGGAGAAGCG 780 ATCGGATCCT TGACCCCTCT GAAGGAAACC 840
86权利要求
1.一种无诱导高效蛋白表达体系，其特征在于所述的表达体系包括NAD(P)H脱氢酶基因启动子和pMD 18-T simple克隆载体，在启动子序列的3’端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此构建的片段插入pMD 18-T simple克隆载体的T克隆位点中，构成环状的表达质粒，所述的NAD(P)H脱氢酶基因启动子的序列如SEQ1所示，所述的SD序列如SEQ2所示。
2. 根据权利要求l所述的表达体系，其特征在于在所述的目的基因后面接有强终止TGA。
3. 根据权利要求2所述的表达体系，其特征在于所述的目的基因为三苯基甲垸氧化酶基因 &威
4. 根据权利要求l所述的表达体系，其特征在于所述的目的基因为荧光蛋白EYFP基因。
5. —种如权利要求l所述表达体系的构建方法，其特征在于包括下列步骤a) 以希瓦氏菌S12基因组DNA为模板通过PCR方法扩增其NAD(P)H脱氢酶基因启动子；b) 设计引物PCR扩增目的基因，在其5'端加入高效SD序列；c) 设计引物桥，将步骤a)得到的NAD(P)H脱氢酶基因启动子与步骤b)得到的含有目的 基因的片段连接，连接产物与pMD 18-T simple载体重组，使连接产物插入pMD 18-T simple载体的T克隆位点，形成环状质粒，即为无诱导高效蛋白表达体系。
全文摘要
本发明公开了一种无诱导高效蛋白表达体系及其构建方法，旨在提供一种无需诱导，能在多种不同的宿主细菌中高效表达目的蛋白的表达体系。本发明所述的无诱导高效蛋白表达体系包括NAD(P)H脱氢酶基因启动子和pMD 18-T simple克隆载体，在启动子序列的3’端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此构建的片段插入pMD 18-T simple克隆载体的T克隆位点中，形成环状的表达质粒。本发明主要用于高效的表达目的蛋白。
文档编号C12N15/74GK101538580SQ20091003743
公开日2009年9月23日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者任随周, 卫晋波, 孙国萍 申请人:广东省微生物研究所