具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物及其筛选方法

专利名称：：具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物及其筛选方法
技术领域：
：本发明涉及具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物及药物的筛选方法。技术背景自吞噬是一类溶酶体依赖的细胞内蛋白或损伤器官降解过程。(Klionsky,D.J.&Emr，S.D.Sde"ce，2000,2卯，1717-21.)在这一过程当中，双膜的自吞噬体包被需要降解的细胞内容物之后，与溶酶体融合行使降解功能，实现氨基酸的再循环。这一降解/再循环系统在进化上高度保守，在发育、生长、衰老、疾病、死亡等过程中至关重要。自吞噬一溶酶体途径与泛素一蛋白酶体途径一起成为真核细胞中的两种主要降解系统，但与蛋白酶体途径分工不同，自吞噬主要降解长寿命蛋白，蛋白聚集体以及细胞器等。因此，除了参与一些重要的生理过程，自吞噬在一些由于特定组织中错误折叠蛋白聚集等因素所导致的疾病例如阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)、帕金森症(Parkinson'sdisease)、肌萎縮侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis)、亨廷顿舞蹈病(Huntington'sdisease,HD)以及脊髓小脑性共济失调的一些类型(spinocerebellarataxiatypes1,2,3,6,7，17)以及传染性蛋白质病(Priondiseases)、致死性家族失眠症(fatalfamilialinsomnia)、a_I型抗胰蛋白酶缺乏症(alpha-1antitrypsindeficiency)、齿状核红核苍白球路易斯核萎縮症(dentatorubral-pallidoluysianatrophy)、客页颞叶失智症(frontaltemporaldementia)、进行性上目艮神经核麻痹症(progressives叩ranuclearpalsy)、x连锁脊延髓肌萎縮症(spinobulbarmuscularatrophy)、神经元核内包涵体病(Neuronalintranuclearhyalineinclusiondisease)等的治疗中显得很有意义，通过化合物(如雷帕霉素，rapamycin)诱导自吞噬降解HD相关蛋白聚集体被证实是一种行之有效的方法(BergerZ,RavikumarB,MenziesFMetal//wwMo/2006,15:433-42)。基于自吞噬在生理和病理过程中的重要作用，目前这一领域己日益成为生物学研究热点。(Lum,J.J.,DeBerardinis，R.J.&Thompson,C.B.iVwTevMo/Ce〃5/o/2005，6,439-48.)。在正常条件下，自吞噬在细胞中仅维持低微的本底水平，而在饥饿或其它压力条件之下，自吞噬水平迅速上调。酵母基因分析业已确定了17个自吞噬相关基因(简称ATG基因)(Klionsky,D.丄，Cregg，J.M"Dunn,W.A.etal.DevCe〃2003,5,539-45.)。这17个基因编码的蛋白可以分为4类，包括参与调节自吞噬上游信号(如mTOR)的几种丝/苏氨酸激酶(Atgl，Atgl3,Atgl7)，参与调节自吞噬起始过程中脂/激酶信号复合物的蛋白(Atg6,Atgl4，Vps34,andVpsl5),参与自噬体形成的2类新型泛素样结合系统(Atg8以及Atgl2系统)，以及帮助自吞噬体形成过程中结合于自吞噬体之上的ATG分子从成熟的自吞噬体上进行解离的蛋白(Atg2,Atg9，Atgl8)。绝大多数酵母^rG基因在高等真核生物细胞中具有同源体(Mizushima，N.&Klionsky,D.J.」""w/evAWr2007,27，19-40.)。例如，在哺乳动物细胞中，雷帕霉素靶蛋白mTOR激酶介导非饥饿等条件下自吞噬抑制通路(Lum，J.J.,DeBerardinis,R.J.&Thompson,C.B.Ato及evMo/Ce〃，2005,6,439-48)。相反，酵母vps34蛋白在哺乳动物细胞中的同源体C3PI3激酶则为自吞噬启动所必需，雷帕霉素因而也成为自吞噬研究和相关应用过程中最常用的诱导剂。为进一步研究自吞噬作用机制，同时寻找更多的真正诱导自吞噬发生的小分子化合物，发明人以LC3—GFP在自吞噬发生时定位于自吞噬体膜这一特性为基础，建立了一种基于图像的高通量筛选自吞噬诱导剂的新方法(Kabeya,Y.，Mizushima，N.，Ueno,T.,etal/，2000,19,5720-8.)。灵长类细胞中LC3蛋白乃是酵母ATG8的同源体，被认为是自吞噬体的特征性蛋白标记。通过与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达，可以通过荧光显微镜方便地观察到自吞噬体的情况。在正常培养的细胞中，LC3-GFP的荧光亮点数量以及荧光强度处于很低的本底水平，而在一些自吞噬诱导条件,例如饥饿或加入自吞噬诱导剂等，以上参数则迅速而显著地升高(Mizushima,N.,Yamamoto，A.，Matsui，M.，etalMb/5/o/Ce//,2004'15,1101-11.)。这为大规模地筛选可能地自吞噬提供了基础。然而，LC3-GFP增加并能不完全等同于自吞噬降解活性的增加，它还有可能源于细胞损伤甚至溶酶体功能遭到破坏导致的自吞噬体过程停滞(抑制)等因素。同时，虽然本发明人筛选的480种化合物(ICCBknownbioactivelibrary,BIOMOL)已经证实有清楚的生物活性，但绝大多数化合物都不会只有单一作用靶点，其本身己知的活性只可能为筛选提供参考，但并不能对以上所述的多种诱导LC3—GFP增加的情况加以区分。多种细胞内、外的诱导因素包括饥饿、营养因子去除、细菌感染、细胞器损伤以及蛋白错配等均可能诱导自吞噬发生。目前只对饥饿诱导的自吞噬机制研究相对清楚。但同时许多细胞内信号分子例如AMPK，mTOR，C3PI3K，MAPK也被证实参与自吞噬调节(12)。此外，Ca2+、Ca2+调节的蛋白酶(calpainsetal,v4Wop;agy,2007，3,235-7)以及calmodulin(Hoyer-Hansen,M.，Bastholm，L.,Szyniarowski，P.,etalMo/Ce〃，2007，25，193-205.)亦可能参与自吞噬调节。由于化合物可能影响多个蛋白靶点，筛选到的增加LC3-GFP的化合物即便不是由于溶酶体功能破坏导致的自吞噬抑制，也需排除细胞死亡带来的影响，从而寻找到通过影响已知甚至未知的自吞噬调控蛋白诱导自吞噬的化合物。III型磷脂酰肌醇—3—磷酸激酶(classIIIphosphoinositide3-kinases(PI-3-kinases)，PI3K)催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositolPI)磷酸化生成磷脂酰肌醇一3—磷酸(Phosphatidylinositol-3-phosphate，Ptdlns(3)P，PI(3)P)，后者在细胞内吞以及自吞噬体膜运输过程中至关重要(Simonsen,A.,Wurmser,A.E.，Emr,S.D.etalC"rOp/wCe〃历o/，2001,13,485-92.)。同时Vps34/bedinl(分别为哺乳动物细胞中酵母III型PI3K同源体Vps34与ATG6同源体beclinl)形成的复合物参与自吞噬起始信号调节(Nobukuni，T.,Kozma，S.C.&Thomas,G.,Cwrqp!'"Ce//5/0/,2007,19，135-41)。因此，在自吞噬发生过程中，PI(3)P水平至少不应当降低太多。FYVEdomain由70个氨基酸残基组成，形成一个锌指蛋白结构，与Ptdlns(3)P特异结合，通常Ptdlns(3)P募集含有FYVEdomain蛋白结合于细胞器膜，参与蛋白运输等过程。因此，荧光标记的FYVEdomain常被用于检测细胞内PI(3)P水平及定位(Stenmark,H.，Aasland，R.&Driscoll,P.C.F五5S丄e",2002,513,77-84)。我们亦利用稳定表达FYVE-RFP融合蛋白的细胞株观察化合物对FYVEdomain的影响，从中间接反映化合物对自吞噬的影响，去除掉FYVE显著减少的化合物。自吞噬过程的实质是蛋白质降解过程，它主要介导细胞器以及细胞内长寿命蛋白的降解(Mizushim^N.&Klionsky,D.J.^朋w/evAtor,2007,27,19-40.)。因此，检测化合物是否促进细胞内长寿命蛋白降解是说明化合物诱导自吞噬的一个重要佐证。另外，错误折叠的蛋白大量聚集是多种神经退行性疾病的一个显著特点，例如，亨廷顿舞蹈病的发病机理即由于含有大量多聚谷氨酸(polyglutamine，polyQ)的蛋白聚集于神经细胞当中无法清理所致。自吞噬在此被认为是polyQ清除机制(Wullschleger，S.,Loew池，R.&Hall,M.N,Ce〃，2006，124，471-84)。例如，自吞噬诱导剂雷帕霉素就常用作清除polyQ聚集体的化合物。所以，polyQ清除与降解实验同样是自吞噬发生的重要佐证。基于此，我们建立了从检测LC3—GFP荧光变化、检测FYVE—RFP荧光变化到检测长寿命蛋白总量或polyQ降解的一系列方法筛选诱导自吞噬的小分子化合物。本发明中涉及的8种自吞噬诱导剂包括7种FDA己经批准的药物以及1种Ca2+通道相关的巳知活性化合物，这些化合物可以增进细胞中长寿命蛋白降解、减少转染细胞中过表达的polyQ水平。这为多种由于错配蛋白聚集导致的神经退行性疾病治疗提供了新的可能。
发明内容本发明的目的是提供一类具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物；本发明要解决的另外一个问题是确定包括具有自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物及其它影响真核细胞发生自吞噬(诱导或抑制)的化合物的筛选方法。为此本发明同时提供一种简捷高效的影响自吞噬的化合物筛选方法，以此为基础进行新的具有自吞噬诱的治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物的筛选。本发明的具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物，其具有如下结构式和命名<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>niguldipine尼古地平a人HCiH6Niguldipinehttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezcmd=search&db=pccompound&term=niguldipinePenitremA青霉震颤素http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezcmd=search&db=pccompound&term=Penitrem%20Apimozide匹莫齐特^^^NPimozideuc>。Hhttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezcmd=search&db=pccompound&term=pimozideTrifluoperazine三氟拉嗪广N"^^^N^p^^CF32HCITrifluoperazinehttp:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/sites/entrezcmd=search&db=pccompound&term=trifluopcrazinc本发明要解决的问题在于确定1类自吞噬诱导剂，为此发明同时提供一种简捷高效的影响自吞噬的治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物的筛选方法，以此为基础进行新的筛选。本发明的筛选方法是将已知的自吞噬分子机理与高通量筛选的先进技术相结合，建立了以图像变化为基础的影响自吞噬的化合物筛选方法，用来确定一些新的自吞噬诱导剂，用于自吞噬机制的分子工具或治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病等自吞噬相关疾病的治疗的药物。本发明提供的简便的化合物高通量筛选途径，包括定量分析细胞中荧光标记的LC3变化一定量分析细胞中荧光标记的FYVE变化，获得自吞噬诱导剂候选化合物，再进行长寿命蛋白降解、polyQ降解等，最终确定新的自吞噬诱导剂和具有自吞噬机制的分子工具或错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病等自吞噬相关疾病的治疗的药物。筛选分3步进行1、对480种已知生物活性的化合物(ICCBknownbioactivelibrary，BIOMOL)处理稳定表达LC3—GFP的细胞株，以二甲基亚砜(DMSO)溶剂为空白对照，已知的自吞噬诱导剂雷帕霉素作为阳性对照，高通量分析化合物作用导致的细胞数目以LC3—GFP荧光变化情况，去除明显减少细胞数目或并不明显增加LC3—GFP的化合物。2、将剩余的明显增加LC3—GFP的化合物处理稳定表达FYVE—RFP的细胞株，以DMSO溶剂为阴性对照，己知的自吞噬诱导剂雷帕霉素作为阳性对照，高通量分析化合物作用导致的FYVE—RFP荧光变化情况，去除FYVE显著减少的化合物。3、将剩余的明显增加LC3—GFP且基本不减少FYVE—RFP的化合物作为候选的自吞噬诱导剂，通过LC3II/LC3I比例分析、长寿命蛋白降解以及polyQ降解实验进一步确证，上述3项指标都较DMSO显著增强的化合物即为筛选出的新的错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病等自吞噬相关疾病的治疗的药物，雷帕霉素在此依然作为阳性对照。确认的新的自吞噬诱导剂包括氟司必林(Fluspirilene)，三氟拉嗪Triflu叩erazine，匹莫齐特(Pimozide)，尼古地平(Niguldipine)，尼卡地平(Nicardipine),胺碘酮(Amiodarone)，洛哌丁胺(Loperamide),青霉震颤素(PenitremA)。氟司必林是FDA批准的一种吩噻嗪类镇静剂(antipsychoticdrug),被用来治疗精神分裂症(Meijer，A.J.&Codogno，P./w〃历oc/je附Ce〃祝o/，2004,36,2445-62,)。其作用机制可能是通过阻断中枢神经中肾上腺素和多巴胺传输而发挥作用(Janssen，P.A.,Niemegeers，C.J.，Schellekens，K.H.，etalJrz"e/w;"e//orsc/m"g，1970,20,1689-98.)。三氟拉嗪是FDA批准的另一种镇静药物，与氟司必林一样可以有效治疗急性精神分裂症(J加ssen,P.A.,Niemegeers,C.J"Schellekens,K.H.，etalJrz"efw/"e//orac^w"g，1970,20，1689-98.)。有趣的是，trifluoroperazine亦被发现可以减轻亨廷顿病人的"舞蹈"症状(Bankier,R.G/C//"尸to/m^/AfewZ)n^，1973，13,44-7.)。此外，三氟拉嗪亦被报道抑制钙调素活性、线粒体通透性(mitochondrialpermeabilitytransition，MTP孔)以及减少亨廷顿舞蹈病相关的多聚谷氨酸盐对细胞的毒害作用(Stokes,H.B.IfeAfervS"M975,36,102-5.)。另外，它还被发现是一种钙例子通道阻滞剂。匹莫齐特则是FDA批准的用于治疗慢性精神分裂症的镇静剂。它可能作用于神经中枢aminergic受体。在高剂量下该化合物亦有可能影响去甲肾上腺素降解。同样，临床研究显示匹莫齐特能够缓解亨廷顿舞蹈病导致的过度痉挛(Tang,T.S.，Slow,E.，Lupu，V.，etal尸rac廳JcWSc/C/5^,20ft5,102，2602-7.)。另外3种自吞噬诱导剂尼古地平，尼卡地平以及胺碘酮都是FDA批准的治疗心血管疾病，包括高血压、心绞痛、心率不齐等的药物。并且这些化合物被用来抑制细胞内Ca2+流。其中，尼古地平在心肌细胞中可作为T型Ca2+流的抑制剂。作为一个二氢嘧啶类(^2+通道阻断试剂，尼卡地平常用于治疗慢性心绞痛、高血压以及Raynaud's症状。胺碘酮是另一种高效的抗心率失常的药物，同样，它能够阻滞Ca2+通道。洛哌丁胺是一种吡啶杂环衍生物。作为一种阿片受体激动剂，它只影响位于胃肠神经丛的p阿片受体，并不影响中枢神经。原因在于该化合物无法穿越血脑屏障。作为一种FDA批准的治疗痢疾的药物，它可以有效改善胃肠道症状。洛哌丁胺能够阻断兔或鼠海马神经元中高电压激活的Ca2十通道(high-voltage-activatedCa2+channels)以及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate)导致的反应(Girotti,F"Carella，F.,Scigliano，G.,etalJiVewo/Afe"m^gi^c/^外，1984,47,848-52.)。此外，洛哌丁胺还可以阻断培养的背根神经节中电压依赖的Ca2+通道(Church,J.，Fletcher,E.J"Abdel-Hamid,K.etalJ.F.A/o/尸/zar附aco/,1994,45，747-57.)。青霉震颤素是一种麦黑草(ryegrass)中发现的真菌神经毒素，可以选择性阻断〔32+激活的K+通路(10nM青霉震颤素即可100%阻滞)。该化合物曾被证明具有明显的神经毒性，可能导致严重的震颤或共济失调(Hagiwara，K.,Nakagawasai，O.,Murata，A.,etali^,2003,46，493-7)，然而我们的结果显示该化合物并不杀伤H4细胞。总之，本方面提供的八种化合物可以促进自吞噬、减少细胞中错配蛋白聚集。有趣的是，除青霉震颤素之外，其它七种FDA药物显示出更低的细胞毒性，甚至优于雷帕霉素和另一种己知的自吞噬诱导剂他莫西酚tamoxifen。以上七种FDA药物可以在一些错配蛋白如多聚谷氨酸聚集导致的神经退行性疾病治疗中发挥作用，能制备并成为更好的由错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病等自吞噬相关疾病的治疗的药物治疗药物。图1八种化合物增加内源性LC3II比率；图2八种化合物增加polyQ降解。符号说明图l中D:DMSO;R:雷帕霉素；3:胺碘酮；4:尼古地平；5:三氟拉嗪；6:洛洛哌丁胺；7:青霉震颤素；8:匹莫齐特;9:氟司必林；10:尼卡地平。图2中从左至右第一列上DMSO;下雷帕霉素处理样品。2—9列分别为氟司必林、匹莫齐特、三氟拉嗪、胺碘酮、洛哌丁胺、尼卡地平、尼古地平、以及青霉震颤素处理的样品，从上至下为不同稀释比例的样品，依次为用筛选浓度，数值见附图1，以及按照l:2.5、1:5以及1:10稀释度稀释的化合物处理的样品。具体实施方式下述的实施例有助于进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。实施例1化合物增加LC3—GFP的表达和聚集试验方法微管相关蛋白轻链3(LC3)是酵母自吞噬蛋白ATG8(Aut7/Apg8)的哺乳动物蛋白同源体，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，为广泛采用的自吞噬体膜标记(MizushimaN./"//历oc/ewCe〃历o/2004;36:2491-502)。本发明通过高内涵显微镜分析统计绿色荧光(GFP)标记的自噬体标记LC3在化合物作用前后的荧光强度以及分布等变化情况具体方法在H4细胞中转入融合蛋白LC3—GFP，构建并筛选获得H4—LC3细胞株作为筛选平台对480种已知生物活性的化合物(ICCBknownbioactivelibrary，BIOMOL)进行高内涵筛选，具体方法将化合物用DMSO稀释溶解配制不同浓度，每浓度重复3次；将H4—LC3细胞按照合适密度种植于96孔板，用化合物处理24小时。设置以下实验组空白对照(DMSO处理)、阳性对照(诱导剂雷帕霉素处理)、实验组(化合物处理)等。如果化合物影响LC3的表达及分布，则可通过图像以及荧光点大小、强弱等数值准确体现。该实验被重复3次，选取在3次实验中LC3—GFP荧光强度大于空白对照组50%以上的72种化合物加以分析，根据统计的细胞数结果去除细胞死亡超过30%(与对照组比较)的化合物，剩余的化合物作为候选分子进一步研究。试验结果对480种化合物进行筛选后确认47种化合物(用*标注)显著增加LC3—GFP且并不导致明显的细胞死亡，可以用来继续筛选可能的自吞噬抑制剂。结果见表l:表1:增加LC3—GFP强度且基本没有细胞毒性的化合物化合物中文名浓度相对细胞数(％)LC3—GFP相对,荧光强度(％)Rap咖ycin雷帕霉素」0.288.62±1.47285.38±9.15Tamoxifen他莫西酚4.491.20±15.79585.87±23.60GrayanotoxinIIP木藜卢素-lll6.0129.36±12.25210.65±18.76Loperamide*洛哌丁胺4.9126.76±6.52666.50±29.17Amiodarone*胺碘酮3.7138.50±1.88327.25±43.47BayK-8644*.7.0134.45±31.56181.32±24.39Niguldipine*尼古地平3.9132.78±18.11777.92±93.57Pimozide*匹莫齐特5.4127.14±5.73447.75±27.40Clozapine*氯氮平7.7139.18±7.07350.13±4.27Monensin*莫能星3.692.38±20.28639.29±131,46Nigericin*尼曰利亚菌素3.4106"0±20.30747.88±59.06Wiskostatin*5.996.96±20.372401.38±69.13E6Berbamine*小檗胺3.313U6±51.612447.47±118.04Paxilline*5.7119.79±14.88205.83±23.642,5-Ditertbutylhydroquinone*2,5-—.叔丁基对苯一酚11.3118.42±15.99326.89±28,36Cyclopiazonicacid*环匹阿尼酸7.4112,62±3,20186.44±24.02Flunarizine*氟桂利嗪5.2104.67±23.55203.66±5.56AM92016*5.2135,28±14.74222.83±4.66FPL-64176*7.2132.45±18.98200.83±6.35Verapamil*维拉帕米5.2132.44±14.80238.60±7.49Bepridil*卡普地尔6.2111.92±36.16168.39±10.81Nicardipine*尼卡地平4.8131.58±2.77229.64±11.37PenitremA*青霉震颤素3.993.08±14.17166.85±12.90Propafenone*普罗帕酮6.699.88±10.80385.97±11邻Quinine*奎宁6.9115.16±3.83165.01±12.20SDZ-201106*5.494.70±8.45329.96±42.81Fluspirilene*氟司必林5.3143.30±17.531593.16±23.32Trifluoperazine*三氟拉嗪8.3105.72±12.841010.35±109.78TMB-8*5.8145.22±28.06229.50±8.36CyclosporinA*环孢素A2.1159.64±24.07178.79±12.89Cypermethrin*氯氰菊酯6.097.45±28.70208.14±50.53NapSul-Ile-Trp-CHO*5.1124.74±15.35199.27±27.78CA-074-Me*6.3132.20±1.87272.48±13.64E-64-d*7.3119.19±21.97244.88±42.95Ac-Leu-Leu-Nle-CHO*6.596.31±6.90495.29±25.66Calpeptin*6.9128.87±13.59232.89±14.22Geldanamycin*格尔德霉素4.581.41±1.67546.80±22.61Chelerythrine*白屈菜赤碱6.5110.26±10.99213.88±27.31BADGE*7.3132.48±3.64182.11±14.16GW-9662*9.0105.38±6.48166.91±16.53Castanospermine*栗树精胺13.2157.35±11.87171.20±10.92Dipyridamole*双嘧达莫5.0l;58.96土20.49213.63±8.98CAPE*8.8146.20±21.95150.18±24.10GM6001*6.4143.94±11.51196.42±24.22H9*7.71%.70±4.54156.16±13.15K252A*0.5101.89±3.64215.29±17.56Indirubin*靛玉红9.5101.26±13.87172.28±37,9224(S)-Hydroxycholesterol*24(S)-羟基胆甾醇6.2108.20±15.82648.90±135.44<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>具体方法:将化合物用DMSO稀释溶解配制不同浓度，每浓度重复3次;将H4—FYVE细胞按照合适密度种植于96孔板，用化合物分别处理2、4、8小时。设置以下实验组空白对照(DMSO处理)、阳性对照(诱导剂雷帕霉素处理)、阴性对照(PI3K抑制剂LY-294002处理)、实验组(化合物处理)等。如果化合物影响FYVE的表达及分布，则可通过图像以及荧光点大小、强弱等数值准确体现。该实验被重复3次，去除显著减少FYVE的化合物，选取在3次实验中RFP—FYVE荧光强度均较对空白照组没有显著减少的各种化合物进行进一步分析。试验结果对47种化合物进行筛选后确认26种化合物并不明显减少FYVE—RFP(包括以上8种化合物)，可以用来继续筛选可能的自吞噬抑制剂，见表2:表2:化合物不减少FYVE—RFP表达和聚集<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例3八种化合物增加长寿命蛋白降解试验方法自吞噬过程的实质是蛋白质降解过程，它主要介导细胞器以及细胞内内长寿命蛋白的降解(5)。因此，检测化合物是否促迸细胞内长寿命蛋白降解是说明化合物诱导自吞噬的一个重要佐证。具体方法将化合物用DMSO稀释溶解配制不同浓度，每浓度重复3次；将H4细胞按照合适密度种植于96孔板，用化合物分别处理其、2、4、24小时。设置以下实验组空白对照(DMSO处理)、阳性对照(诱导剂雷帕霉素处理)、实验组(化合物处理)。于实验前1天将细胞按照合适密度种植于12孔板中在正常条件下(DMEM+10M胎牛血清)进行培养，实验前换不含L-亮氨酸的完全培养液培养lh以去除细胞内内源性L-亮氨酸。接着用含[3H]L-亮氨酸的完全培养液孵育细胞24h，使细胞摄入同位素标记的亮氨酸进行蛋白合成，24h之后换用完全培养液孵育细胞24h降解短寿命蛋白。待短寿命蛋白降解之后换用加入化合物的完全培养液孵育细胞，分别于O、1、2、4、24h检测培养液中放射性强度，24h收集细胞检测细胞中同位素强度，计算化合物作用后不同时间相对于空白对照组长寿命蛋白降解率，通过t检验挑选出增加长寿命蛋白降解的化合物。实验结果找到八种可以增加长寿命蛋白降解(促进自吞噬)的化合物，见表3:表3化合物促进长寿命蛋白降解<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>青霉震颤素92.88±2.83126.09±0.47132.13±10.01141.83±1.25尼古地平71.65±2.68107.42±2.72105.68±2.74117.85±1.98胺碘酮101.32±5.95122.42±9.71110.75±3.68U6,73土5.54实施例4八种化合物增加细胞内源性自吞噬体标记LC3II比率试验方法在化合物筛选平台中使用的自吞噬体标记LC3在胞浆中经过以上加工过程，通常细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC31，分子量为18Kd。自吞噬发生时，后者经泛素样加工修饰过程，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，称为LC311，定位于自吞噬体膜，表乂见分子量为16KD(KabeyaY,MizushimaN，UenoT，etalMi90/2000:19，5720-8)。LC3-II含量的多少在某种程度上反映了细胞的自噬活性，因此通过免疫印记的方法检测细胞中LC3-II的含量能够进一步反映化合物对自吞噬的影响。具体方法将H4—LC细胞按照合适密度种植于6孔板，用化合物处理4h后收集细胞，裂解后收获胞浆中蛋白质进行电泳分离后转膜，用抗体进行免疫印记染色，细胞骨架蛋白actin作为内参照。设置以下实验组空白对照(DMSO处理)、阳性对照(诱导剂雷帕霉素处理)、实验组(化合物作用)。实验结果8种化合物能够诱导LC3II/LC31比率增加。如附图1所示。实施例5八种化合物促进多聚谷氨酸降解试验方法错误折叠的蛋白大量聚集是多种神经退行性疾病的一个显著特点，例如，亨廷顿舞蹈病的发病机理即由于含有大量多聚谷氨酸(polyglutamine，polyQ)的蛋白聚集于神经细胞当中无法清理所致。自吞噬在此被认为是polyQ清除机制(20)。例如，自吞噬诱导剂mTOR常用作清除polyQ聚集体的化合物。所以，polyQ清除与降解实验同样是自吞噬发生的重要佐证。具体方法将筛选到的8种化合物用DMSO溶解，并逐级稀释于完全培养液中。将H4细胞按照合适密度种植于12孔板，用脂质体包裹重组质粒GFP—polyQ—HA转染细胞，4小时后换用上述添加不同浓度化合物的完全培养液继续培养，24小时后拍照并收集细胞，裂解后收获胞桨中蛋白质，用点样器点样至PVDF膜，用抗HA抗体进行免疫印记染色，细胞骨架蛋白actin作为内参照。设置以下实验组空白对照(DMSO处理)、阳性对照(诱导剂雷帕霉素处理)、实验组(化合物处理)。实验结果-八种化合物可以有效诱导polyQ降解并呈较好的剂量依赖关系，能制备并成为更好的由错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病等自吞噬相关疾病的治疗药物。见附图2。权利要求1、一类具有自吞噬诱导的治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物，其具有如下结构式洛哌丁胺胺碘酮尼古地平匹莫齐特尼卡地平青霉震颤素2、如权利要求1所述的具有自吞噬诱导的治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物，其特征是所述的错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病是阿尔茨海默病、帕金森症、肌萎縮侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调以及眼、咽型肌营养不良、传染性蛋白质病、致死性家族失眠症、a—I型抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球路易斯核萎縮症、额颞叶失智症、进行性上眼神经核麻痹症、x连锁脊延髓肌萎縮症、神经元核内包涵体病的疾病。3、一种如权利要求1所述的具有自吞噬诱的治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物的筛选采用下述三步骤(1)将生物活性的化合物进行稳定表达LC3—GFP的细胞株，以二甲基亚砜溶剂为空白对照，已知的自吞噬诱导剂雷帕霉素作为阳性对照，高通量分析化合物作用导致的细胞数目以LC3—GFP荧光变化情况，去除明显减少细胞数目或并不明显增加LC3—GFP的化合物；(2)将(1)剩余的明显增加LC3—GFP的化合物处理稳定表达FYVE—RFP的细胞株，以二甲基亚砜溶剂为阴性对照，已知的自吞噬诱导剂雷帕霉素作为阳性对照，高通量分析化合物作用导致的FYVE—RFP荧光变化情况，去除FYVE显著减少的化合物；(3)雷帕霉素作为阳性对照，将(2)剩余的明显增加LC3—GFP且基本不减少FYVE一RFP的化合物作为候选的自吞噬诱导剂，通过LC3II/LC3I比例分析、长寿命蛋白降解以及polyQ降解实验进一步确证，上述3项指标都较二甲基亚砜显著增强的化合物即为具有自吞噬诱的治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物。全文摘要本发明涉及一类具有自吞噬诱的治疗错误折叠蛋白聚集所导致的疾病的药物及其药物的筛选方法。系将已知的药物化合物进行定量分析细胞中荧光标记的LC3变化，定量分析细胞中荧光标记的FYVE变化获得自吞噬诱导剂候选化合物，再进行长寿命蛋白降解和polyQ降解等，最终确定一类自吞噬诱导性能和新的具有自吞噬诱的治疗错误折叠蛋白聚集因素所导致的疾病的药物。本发明的方法是一种简捷高效的影响自吞噬的化合物筛选方法。文档编号A61K31/445GK101224207SQ20081000857公开日2008年7月23日申请日期2008年1月23日优先权日2007年10月12日发明者佳于,张立红,潘鹤龄,袁钧瑛,马大为申请人:中国科学院上海有机化学研究所