蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物领域重复序列蛋白的优化表达方法，具体是指一种络新 妇属蜘蛛（Nephilaclavipes)的牵引丝蛋白MaSp的表达生产优化。
【背景技术】
[0002] 天然蜘蛛牵引丝蛋白，是由蜘蛛体内大悬壶腺体分泌形成的一种蛋白质多聚体， 素有"蜘蛛生命线"之称；拥有高强度、高弹性、高断裂功的机械性能，同时具有良好的生物 相容性、生物可降解性等优良特性，是自然界中综合性能最好的天然生物材料之一。其主要 由两种蛋白质组成，蜘蛛牵引丝蛋白1和蜘蛛牵引丝蛋白2(MaSpl&2)。这两种牵引丝蛋白 都是高分子量蛋白，分子量主要分布在250 -350kDa之间；之前研宄表明，MaSpl主要负责刚 性性能而MaSp2负责弹性性能。两种蜘蛛牵引丝蛋白都是由三部分构成，N -端的结构域、 大分子量高度重复片段、C-端的结构域，其中的高度重复序列对于其性能起到重要的作用， 络新妇属蜘蛛牵引丝蛋白的全基因序列尚未报道，只有部分cDNA核心序列被解析。天然蜘 蛛丝蛋白富含丙氨酸和甘氨酸，丙氨酸富集区可以形成疏水的b -折叠晶体结构，是蜘蛛丝 蛋白具有高强度的重要原因。然而，由于蜘蛛的强烈自我保护意识和地域攻击性，难以通过 大规模养殖蜘蛛来获得大量蜘蛛丝蛋白。
[0003] 针对这个问题，人们通过设计氨基酸序列并人工合成氨基酸和基因序列，随后导 入到不同的宿主细胞中表达生产重组蜘蛛牵引丝蛋白。特别是从90年代蜘蛛牵引丝蛋白1 和2的cDNA序列被部分解析后，人们对这种由蛋白质构成、具有优良特性的新生物合成材 料探宄和发掘越来越多。随着基因技术和基因化学合成方法的建立和发展，利用活细胞的 合成体系创造新蛋白质的基因工程技术日臻完善；国内外许多实验室已进行了人工合成蜘 蛛丝蛋白的尝试（I. Lewis R. V.，Hinman M.，Kothakota S.，Fournier M. J. Expression and purification of a spider silk protein:a new strategy for producing repetitive proteins.Protein expression and purification. 1996, 7(4) :400 - 406 ；2. Fahnestock S.R.,Bedzyk L.A.Production of synthetic spider dragline silk protein in pichia pastoris. Applied microbiology and biotechnology. 1997,47 (I):33 - 39 ； 3. Arcidiacono S·，Mello C·，Kaplan D·，Cheley S. , Bayley H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology. 1998, 49 (I) :31- 38 ；4.Fahnestock S. R. , Irwin S. L Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology. 1997, 47 (I) :23 - 32; 5. LazarisAnthoulaj Arcidiacono StevenjHuang YuejZhou Jiang-FengjDuguay Francois, Chretien Nathalie, Welsh Elizabeth A. Soares,Jason W. , Karatzas Costas N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295(5554) :472 - 476 和 6. Scheller Jlirgenj Glihrs Karl - Heinz, Grosse Frank,Conrad Udo. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature biotechnology. 2001，19(6):573 - 577)ο
[0004] 专利文献号W02004/016641公布了编码来自Euprosthenopssp的MaSpl蛋白的内 部重复部分的核苷酸序列，但并没有表达蛋白质。专利文献号W02003/057727公开了重组 蜘蛛丝蛋白多肽在哺乳细胞系中的表达，但分子量较低，不能很好的模拟天然蜘蛛牵引丝 的特性。专利文献号EP 2 330 186 Bl公布了在大肠杆菌中生产了与天然蜘蛛牵引丝蛋白 相媲美的重组蜘蛛牵引丝蛋白1并采取了代谢工程的手段提高了胞内gly -tRNA的含量实 现了产量的数十倍的提高，基因操作较为复杂。
[0005] 大肠杆菌具有遗传背景研宄透彻、易于繁殖培养、细胞易于破碎、成本低廉、基因 水平操作简单等特点，是最常用的蛋白表达体系之一。然而，目前已报道的利用大肠杆菌生 产蜘蛛丝蛋白存在产量低的问题，尤其是高分子量高重复序列的蜘蛛牵引丝蛋白的表达量 低。因此探索一种简单、方便，并显著提高蜘蛛牵引丝蛋白产量的策略具有重大的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法， 在大肠杆菌中首先构建高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒并表达生产，通过降低培养温度 提高蛋白产量；随后在发酵罐的水平上结合高密度发酵和降低培养温度的策略，实现了细 胞量和表达水平的双重提高。本发明能够有效克服高度重复的重组蜘蛛牵引丝蛋白在生产 发酵过程中表达量低的缺陷；为蜘蛛丝蛋白及类似高度重复序列蛋白的发酵生产研宄和应 用提供了良好借鉴意义。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明包括以下步骤：
[0009] 步骤1)设计络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，并使用两个同尾酶NheI和SpeI进行无缝 拼接，合成出含有不同长度的蜘蛛牵引丝蛋白的重组质粒，并以大肠杆菌作为宿主表达生 成工程菌；
[0010] 所述的络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，具体是指：络新妇属（Nephilaclavipes)蜘蛛 牵引丝蛋白MaSpl和2,其中MaSpl单体核心序列的氨基酸序列如Seq ID No. 1所示，即： Ν' - GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG - C'，来源于文献 Xu Ming and Randolph V.Lewis*, Structure of a protein superfiber:Spider dragline silk. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990,87,7120 - 7124。
[0011] 人工设计的MaSpl单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No. 2所示，即： 5? -GGTCGCGGCGGTCTGGGTGGCCAGGGTGCAGGTGCGGCTGCGGCTGCAGGCGGTGCTGGCCAAGGTGGCT ACGGCGGCCTGGGTTCTCAGGGT - 3'。
[0012] 其中MaSp2单体核心序列的氨基酸序列如Seq ID No. 3所示，即： Ν' - GPGGYGPGQQGPSGPGSA8GPGGYGPGQQ - C'，来源于文献 Micchael B. Hinman and Randolph V. Lewis*, Isolation of a clone encoding a second dragline silk fibroin. The Journal of Biological Chemistry. 1992,267:19320 - 19324〇
[0013] 人工设计的MaSp2单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No. 4所示，即： 5 ' -GGTCCTGGTGGTTATGGTCCAGGTCAACAGGGTCCATCTGGTCCAGGTAGTGCAGCGGCTGCGGCAGCAG CGGCAGGTCCTGGAGGTTATGGTCCTGGTCAGCAA _ 3'。
[0014] 所述的蜘蛛牵引丝蛋白的核心序列的重复数目在8~96之间
[0015] 步骤2)对步骤1得到的工程菌进行一级种子培养和二级种子培养，然后通过低温 培养实现优化量产，具体步骤包括：
[0016] 2. 1)从冷冻状态下将工程菌接种至培养基中常温旋转培养，获得种子液；
[0017] 所述的培养基为含有抗生素的LB培养基。
[0018] 所述的常温旋转培养是指：在30°C、220rpm条件下培养14h。
[0019] 2. 2)将种子液接种至培养基中进一步进行二级种子培养。
[0020] 所述的接种是指：种子液和培养基的体积比为1 :1〇〇。
[0021] 所述的培养基为LB培养基或R/2培养基。
[0022] 所述的R/2培养基的组分含量：2g/L磷酸氢二铵、6. 75g/L磷酸二氢钾、0. 85g/L 柠檬酸、5mL/L微量金属溶液、10g/L葡萄糖、0. 7g/L七水硫酸镁。
[0023] 所述的微量金属溶液成分为：10g/L七水硫酸亚铁、2. 25g/L七水硫酸锌，lg/L五 水硫酸铜、〇. 5g/L五水硫酸锰、0. 23g/L十水硼酸钠、2g/L二水合氯化钙和0. lg/L钼酸铵。
[0024] 所述的二级种子培养是指：在30 °C、220rpm下培养至对数生长初期OD6tltl= 0. 4~ 2. 0〇
[0025] 2. 3)向菌落中进一步加入诱导剂至终浓度为ImM，然后在不超过25°C、220rpm的 环境下进行低温培养。
[0026] 所述的诱导剂采用异丙基-β - D -硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)。
[0027] 所述的低温培养的温度优选为16°C。
[0028] 所述的低温培养前优选进一步对二级种子进行发酵罐高密度培养。
【附图说明】
[0029] 图1为实施例1示意图；
[0030] 图中：A为构建重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒方法简图；B为部分构建质粒信息示意 图。
[0031] 图2为MaSp2 - 64聚体在不同温度条件下进行表达生产示意图；
[0032] 图中：A为LB天然培养基条件下不同培养温度的生产情况的示意图，B为R/2合成 培养基不同培养温度的生产情况的示意图；其中箭头所指为目标蛋白位置。
[0033] 图3为不同类型的高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白在不同温度进行表达生产的示 意图；
[0034] 图中：A为MaSp2 - 80聚体，B为MaSpl - 96聚体；其中箭头所指为对应目标蛋白 位置。
[0035] 图4为低分子量蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2 - 8聚体和MaSp2 - 16聚体表达生产不意 图；
[0036] 图中箭头所指为对应目标蛋白位置。
[0037] 图5为高密度发酵生产重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2 - 64聚体示意图；
[0038] 图中：A为30°C下表达生产，B为16°C下表达生产示意图；其中箭头所指为目标蛋 白位置。
【具体实施方式】
[0039] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0040] 本实施例中分别构