建重组MaSpl和重组MaSp2两种重组蜘蛛丝蛋白表达载体，其 中采用的菌株、质粒、酶与培养基依次为：表达质粒为pET19b和pET - 28a(+)，表达宿主为 大肠杆菌 Escherichia, coli BL21(DE3)，克隆宿主为大肠杆菌 Escherichia, coli DH5 ;基 因操作工具包括：限制性内切酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶；LB培养基。
[0041] 所述的LB培养基的组分含量为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L氯化钠。
[0042] 如图1所示，本实施例构建重组质粒方式为：采用"首尾拼接"的策略，即使用两 个同尾酶NheI和SpeI，进行无缝拼接，合成出目的蛋白分子量大小在28. 3kDa~256. 5kDa 的蜘蛛牵引丝蛋白，包括MaSp2 - 8聚体、MaSp2 - 16聚体、MaSp2 - 64聚体、MaSp2 - 80 聚体、MaSpl -96 聚体等，具体操作如 Teule 等在 "A protocol for the production of recombinant spider silk - like proteins for artificial fiber spinning"（表达类 重组蜘蛛丝蛋白用以人工纤维纺丝的实验方案）中所记载。 实施例2
[0043] 本实施例是在摇瓶体系中采用不同温度进行重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2 -64聚体 表达生产，其中菌株为实施例1中得到的Escherichia coli BL21 (DE3)/pET28a -MaSp2 -64 聚体
[0044] 本实施例包括以下步骤：
[0045] 1)从-80°C取出冻存菌种，即 Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a -MaSp2 -64 聚体，接种到2mL LB培养基（含有抗生素浓度为：50mg/mL的卡那霉素），在30°C、220rpm 条件下培养14h左右。
[0046] 2)取ImL种子液按照I :100比例接种到含有IOOmL LB培养基或R/2培养基的 250mL摇瓶中，30°C、220rpm下培养至对数生长初期（OD6qq= 0. 4 - 0. 5);
[0047] 所述的R/2培养基的组分含量：2g/L磷酸氢二铵、6. 75g/L磷酸二氢钾、0. 85g/L 柠檬酸、5mL/L微量金属溶液、10g/L葡萄糖、0. 7g/L七水硫酸镁。
[0048] 所述的微量金属溶液成分为：10g/L七水硫酸亚铁、2. 25g/L七水硫酸锌，lg/L五 水硫酸铜、〇. 5g/L五水硫酸锰、0. 23g/L十水硼酸钠、2g/L二水合氯化钙和0. lg/L钼酸铵。
[0049] 3)加入诱导剂IPTG至终浓度为1禮，分装20mL至4个250mL摇瓶后，分别放置到 不同温度条件下摇床下进行培养，具体为：16°C、25°C、30°C、37°C，220rpm。
[0050] 结果检测：选择6h为取样时间点；从不同表达生产条件下取相同细胞量菌体，于 4°C、13000rpm下离心10min，吸去上清，菌体冻存于-20°C用于后期蛋白表达水平检测。
[0051] 取出冻存样品，用pH 7· 40TE缓冲液悬浮后，加入5XLaemmli溶液，沸水煮15分 钟，上蛋白样品至1毫米10%的SDS -PAGE中；最后使用考马斯亮蓝R -250对蛋白胶染色， 脱色后用GS800扫描蛋白胶，分析实验结果。
[0052] 如图2所示，通过降低表达生产时的培养温度，高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白 MaSpII64聚体在复杂LB培养集中，16°C蛋白的产量比30°C的产量提高近5倍；在无机盐合 成培养基中，16°C蛋白的产量比30°C的产量提高近8倍。 实施例3
[0053] 本实施例中采用菌株为 Escherichia coli BL21 (DE3) /pET28a - MaSp2 - 80 聚体 和BL21(DE3)/pET19b -MaSpl -96聚体，种子培养及蛋白生产发酵操作与实施例2相同，其 中MaSpI96的抗生素浓度为lOOmg/mL ;样品处理及检测操作与实施例2相同，结果如下：
[0054] 如图3所示，图3 -A是MaSp2 -80聚体的蛋白表达胶图，图3 -B是MaSpl -96聚体 的蛋白表达胶图。在30°C条件下进行表达生产的重组工程菌在加入IPTG起始表达因子之 后，MaSp2 -80和MaSpl -96蛋白表达量几乎没有；而对比温度培养温度低于25°C (本实施 例中采用16°C和25°C )条件下，高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2 -80聚体和MaSpl -96 聚体的产量却很明显能够看出来，有一个明显的提高，说明低温生产高分子量重组蜘蛛牵 引丝蛋白有显著的效果。 实施例4
[0055] 本实施例中采用菌株为 Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-MaSp2-8 聚体和 BL21(DE3)/pET28a -MaSp2 - 16聚体，种子培养及蛋白生产发酵操作与实施例2相同，样品 处理及检测：取样时间点选取在第6h和第18h两个；其余内容与实施例2相同，结果如下：
[0056] 如图4所示，对于小分子量蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2 - 8聚体（约28kDa)，发现培养 6h后30°C条件下比16°C表达水平略高；随着培养时间延长，在16°C条件下其产量有提高， 而在30°C条件下，蛋白表达水平明显降低。MaSp2 - 16聚体结果显示，经过6h诱导后培养 温度低于25°C (本实施例采用的是16°C )条件下比30°C条件下表达水平提高约30% ;而 诱导时间延长后，16°C条件下其产量提高，而30°C也降低。两个结果都与之前高分子量蜘蛛 牵引丝蛋白实施例结果类似，表明低温表达生产低分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白同样具有较 好的效果。 实施例5
[0057] 本实施例中采用菌株为 Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-MaSp2-64 聚体， 种子及发酵培养为R/2培养基，本实施例步骤如下：
[0058] 1) -级种子培养：将-80°C保存甘油菌种转接到3mL LB培养基（含抗生素浓度 为50mg/mL卡那霉素），在30°C、220rpm条件下培养14h左右。
[0059] 2)二级种子培养：取2mL过夜菌液按照1 :100比例接种到含有200mL R/2合成培 养基的500mL(含有抗生素浓度为：50mg/mL的卡那霉素）摇瓶中，30°C、220rpm下培养至 0D_= 2. 0 附近。
[0060] 3)发酵罐高密度培养：采用美国New Brunswick Scientific的Bioflo 110系 列的3. OL搅拌式反应器，发酵体积为I. 6L。按照1:10比例接种，采用pH - stat补料方式 (即在发酵罐上设置PH电级，通过预设pH值，并在发酵过程中随时补料以维持该pH值，从 而调节发酵过程），手动补料溶液；控制溶解氧40%以上，转速800rpm，培养温度30°C。当 细胞生长至〇D_约等于40时，加入IPTG至终浓度为ImM起始蛋白表达生产；此时，降低发 酵生产温度低于25°C (本实施例中采用的是16°C)或者保持在30°C条件下，进行蛋白生产 过程。
[0061] 所述的补料溶液成分为：700g/L葡萄糖和20g/L七水硫酸镁。
[0062] 样品处理及检测：用于SDS - PAGE表达水平的样品处理和检测方法同实施例2,每 隔2或4h取样一次；
[0063] 细胞生长检测：每隔2或4h，取2mL发酵液细胞于4°C、13000rpm下离心10分钟， 吸去上清后，细胞放置在60°C烘箱中干燥烘干至恒重，计算细胞干重。
[0064] 如图5所示，通过结合细胞高密度发酵和低温表达生产蛋白的策略，目标蛋白在 16Γ下产量明显高于30°C水平。同时，在低温条件下细胞经过更长时间的培养后，干重明显 高于30°C。也就是说，低温诱导策略不仅仅提高了重组高分子蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2 - 64 聚体的表达水平，也提高了细胞量，最终实现了目标蛋白的高效生产。
【主权项】
1. 一种蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法，其特征在于，在大肠杆菌中构建重组蜘蛛牵引 丝蛋白质粒并表达生产获得工程菌，然后通过对工程菌进行低温表达生产的方式实现了细 胞量和表达水平的双重提高，所述的低温培养具体是指： 1) 从冷冻状态下将工程菌接种至培养基中常温旋转培养，获得种子液； 2) 将种子液接种至培养基中进一步进行二级种子培养； 3) 随后向培养液中加入诱导剂，然后在4~25°C环境下进行低温培养。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的构建是指：设计络新妇属重组蜘蛛丝 蛋白，并使用两个同尾酶NheI和SpeI进行无缝拼接，合成出不同长度目的蛋白分子量大小 在28. 3kDa~256. 5kDa蜘蛛牵引丝蛋白的重组质粒，并以大肠杆菌作为宿主表达生产工程 菌。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，具体 是指：络新妇属（Nephilaclavipes)蜘蛛牵引丝蛋白MaSpl和2,其中： MaSpl单体核心序列氨基酸序列如Seq ID No. 1所示； 人工设计的MaSpl单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No. 2所示； MaSp2单体核心序列氨基酸序列如Seq ID No. 3所示； 人工设计的MaSp2单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No. 4所示。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的络新妇属重组蜘蛛丝蛋白MaSpl 和2克隆到p!7启动子、pTac启动子或pTrc启动子。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1中所述的培养基为含有抗生素的LB 培养基。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤2中所述的培养基为LB天然培养基或 R/2无机盐合成培养基； 所述的R/2培养基的组分含量：2g/L磷酸氢二铵、6. 75g/L磷酸二氢钾、0. 85g/L柠檬 酸、5mL/L微量金属溶液、10g/L葡萄糖、0. 7g/L七水硫酸镁； 所述的微量金属溶液成分为：l〇g/L七水硫酸亚铁、2. 25g/L七水硫酸锌，lg/L五水硫 酸铜、0. 5g/L五水硫酸锰、0. 23g/L十水硼酸钠、2g/L二水合氯化钙和0. lg/L钼酸铵。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤3中所述的诱导剂采用异丙基-0 -D -硫代吡喃半乳糖苷，其用量为终浓度为〇. 01~5mM。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤3中所述的低温培养的温度为16°C、 220rpm的环境下培养。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的低温培养前进一步对二级种子进行 发酵罐高密度培养。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征是，所述的发酵罐高密度培养是指：按照1:10 比例接种，采用pH - stat补料方式补料；控制溶解氧40%以上，转速800rpm，培养温度 30。。。11. 根据权利要求10所述的方法，其特征是，所述的补料溶液成分为：700g/L葡萄糖和 20g/L七水硫酸镁。
【专利摘要】一种生物工程领域的蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法，该方法首先在大肠杆菌中构建高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒并表达生产，在蛋白表达生产过程中通过降低培养温度提高蛋白产量；随后在发酵罐的水平上结合高密度发酵和降低培养温度的策略，实现了细胞量和表达水平的双重提高。本发明能够有效克服高度重复的重组蜘蛛牵引丝蛋白在生产发酵过程中表达量低的缺陷；为蜘蛛丝蛋白及类似高度重复序列蛋白的发酵生产研究和应用提供了良好借鉴意义。
【IPC分类】C12P21/02
【公开号】CN104946710
【申请号】CN201510276014
【发明人】夏小霞, 杨雁祥, 钱志刚, 钟建江
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月27日