Exendin4多肽片段的制作方法

专利名称：：Exendin4多肽片段的制作方法
技术领域：
：本发明涉及Exendin4截短的多肽片段，该多肽具有降低血糖的作用，可用于治疗II型糖尿病。
背景技术：
：本发明是申请号为200510040823.8(Exendin4多肽片段，申请日2005.6.29)的分案申请。由于现代的饮食结构和生活方式，世界各国糖尿病患者人数逐年增多，目前中国有5000万患者，印度有6000万，美国有1800万，日本有600万。糖尿病分为两种，胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)，其中11型糖尿病占糖尿病患者的卯％以上。II型糖尿病患者表现了许多特征，如餐后胰岛素分泌量不足、胰岛素分泌时间滞后、高血糖等。肥胖II型糖尿病患者周边细胞胰岛素受体敏感性降低，从而产生血糖高、血液中胰岛素水平也高的情况，糖化血红蛋白HbAlc在8%以上(健康人为4-6%)。接着就会产生糖尿病并发症，如心脏病及肾功能衰退等。降低血糖水平就成为有效治疗II型糖尿病的关键。如今，控制糖尿病有六大类药物，包括促胰岛素分泌类磺酰脲类和melitioneds，非促胰岛素分泌药物胰岛素，a-葡萄糖苷酶抑制剂，双胍类及Thioagolinediones。然而，根据英国UKPDS对数千名1I型糖尿病患者的6年跟踪研究报告，上述六类药物对II型糖尿病患者皆无能为力，不能遏制胰脏e细胞不断进行性的恶化，不能降低HbAlc水平，也不能阻止糖尿病的并发症如心脏病、肾衰竭的发生。因此需要研究新的II型糖尿病治疗药物。1995年，美国专利第5424286号公开了一种从南美产巨蜥蜴(Gilamonster,HelodeSuspectum)的唾液中分离的Exendin4多肽。该肽由39个氨基酸残基组成，其结构与肠激素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在氨基酸序列上有40%的同源性。研究表明，Exendin4作为GLP-1的类似物能够与GLP-1的受体相结合。Exendin4能促进胰岛素原的合成，促胰岛素分泌，能降低血糖，当血糖正常之后不再持续作用，因而不产生低血糖昏迷、休克，安全有效。它能降低HbAic，增加e细胞量，增加II型糖尿病患者胰岛素受体敏感性，抑制胰高血糖素分泌等作用。2005年4月，商品名Byetta的Exendin4获美国FDA批准上市。(参见Diabetes(1997)处433-439;ibid(1995)必1249-1258;Ibid(2002)2796-2803;Ibid(1994)2397-2403;DiabetesCare(2002)21330-336;Ibid(2000)2164-69;ibid(2004)2_2623-2635;JAMA(2002)巡373-379;N.Engl.J.Med.(2002)巡393-436;Lanced(1998)M2837-853;DiabetesEndocrinology(2005)巡(4)2069-2070;J.Clin.EndocrinologyMetab(2004)3469-3473.)许多研究人员积极对Exendin4肽进行改造，以期望获得可供更多选择的、更有效的、更方便生产的Exendin4变体。CN1227567A公开了一种截短的Exendin4肽，其由30个氨基酸残基组成，C末端为Arg或Tyr。美国礼来公司研究了一系列GLP-1类似物，其能长期安全地用于治疗糖尿病(参见WO02047716A)。而且，这些结果都是离体实验得到的，以GLP-1受体结合能力的大小、促胰岛瘤细胞分泌胰岛素的多少和cAMP的形成量来评价，具有局限性(参见J.Biol.Chem(1997)21221201-21206;RegulatoryPeptides(2003)Hi153-158;TrendinPharmacologicalSci.(2003)24377-383;WO03011892A)。为了克服现有技术中的不足，发明人经过艰苦的努力，获得了一种新的C端截短的并且C末端为Pro的Exendin4多肽片段。令人惊讶的是，具有这种结构的多肽不但縮短了Exendin4肽约1/4的肽链长度，大大方便了生产实践，为治疗糖尿病提供了一种新选择，而且这种肽能有效地抵抗羧肽酶的作用，持久地保持降血糖的活性。
发明内容本发明一个方面提供了具有式(I)结构的Exendin4多肽片段及其药学上可接受的盐或酯HGEGTX,TSDLSKQX2EEEAVX3LFIEWLKNGX4PXs(I)其中，表示Phe或Tyr，X2表示Met、lie或Leu,X3表示Lys，X4表示Gly或缺失，X5表示Arg或缺失。式(I)中Exendin4多肽片段第6位的氨基酸残基(X!)优选为Tyr。鉴于药代动力学研究的方便，将分子中的一个Phe换成Tyr，有利于125碘的标记。式(I)中Exendin4多肽片段第14位的氨基酸残基(X2)可以是Met、Ile或Leu中任意一个，优选为Met。式(I)中Exendin4多肽片段第30位的氨基酸残基(X4)优选缺失。更优选的多肽片段为:Xi是Tyr，X2是Met，Xs是Lys，X4缺失,Xs表示Arg或缺失。在本文中，"本发明的Exendin4多肽片段"指的是本发明中截断的Exendin4多肽，其具有式(I)所示的结构。在本文中，这种多肽可以简称为"E4(f)"、"多肽片段"或"本发明的多肽"。式(I)多肽的N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团可以不进行修饰，也可以在基本上不影响本发明多肽的活性的前提下进行修饰，如形成"药学上可接受的酯"。对氨基酸侧链基团的修饰包括但不限于赖氨酸e-氨基基团的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷的脱酰基作用。N末端氨基基团的修饰包括但不限于脱-氨基、N-低级烷基、N-二低级烷基和N-酰基修饰。C末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、低级垸基酰胺、二垸基酰胺和低级烷基酯修饰。优选末端基团用蛋白质化学领域的技术人员己知的保护性基团保护起来，如乙酰基、三氟乙酰基、Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、C,.6烷基、C2.8烯基、C7.9芳垸基等。本发明优选不对式(I)多肽N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团进行修饰，即N末端的化学基团仍旧为第一个氨基酸(His)上的ci-氨基(-NH2)，C末端的化学基团是C末端Pro的羧基(-COOH)。本发明也优选对C末端Pro的羧基进行酰氨化，即是-CONH2。本文中所使用的多肽及氨基酸和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法。其中氨基酸的縮写可参照表1中定义。在本文中，若不特别指出，氨基酸一般指L-型的氨基酸。表1氨基酸縮写表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>"药学上可接受的盐"指一些小分子酸性或碱性化合物与多肽形成的盐，一般能够增加多肽的溶解性，所形成的盐基本上不改变多肽的活性。例如，通常能与本发明多肽形成盐的酸有盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、琥珀酸、马来酸、柠檬酸等；能与本发明多肽形成盐的碱有碱金属或碱土金属的氢氧化物、铵、碳酸盐等。本发明多肽的降糖作用可以通过所属领域常规的实验方法来验证，如细胞学实验、动物实验等。在本发明的具体实施方式中，为了克服离体实验的局限性，优选通过糖尿病动物模型来鉴定多肽的降糖作用。如db/dbll型糖尿病小鼠、GotoKokizakiII型糖尿病大鼠、KK糖尿病小鼠、四氧嘧啶(alloxan)人工诱导糖尿病模型小鼠。通过这些动物试验，发现本发明所涉及的式(I)Exendin4多肽片段都具有持续的体内降糖作用，能够用于糖尿病的治疗。因此，本发明的另一方面提供了含有上述具有式(I)结构的Exendin4多肽片段的药物组合物，其可以用于治疗糖尿病，尤其是治疗II型糖尿病。该组合物可以含有本发明的Exendin4多肽片段中的一种或多种，优选仅含一种Exendin4多肽片段。该组合物可以含有一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释设形式)、粉剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂和乳液剂、消毒的注射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶囊口服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药物学可接受的惰性载体组合在一起，如乙醇，甘油，水或其组合。WO2004035754A和WO2004036186A分别公开了一种可用于包括Exendin4多肽的缓释剂型，本发明式(I)的活性多肽优选使用这种剂型(WO2004035754A和WO2004036186A的全文纳入本文参考)。本发明还提供了上述化合物或药物组合物在制备治疗糖尿病的药物中的用途，优选用于治疗II型糖尿病。本发明的药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的的药物组合物优选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。本发明的药物能够调节胰岛素从而持久地保持血糖水平。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如，病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人，每日需要给药0.1-100昭的量，优选l-20吗的范围内，更优选5-10吗。剂量也可以参考已经商品化的exendin-4多肽药品的剂量来确定。另外，本发明还提供了一种化学合成上述多肽的方法。通过化学方法合成已知结构的多肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的。详细的方案可参照以下文献所述的方法进行，如用固相法合成多肽可参考J.M.Steward和J.D.Young的《SolidPhasePeptideSynthesis》，第二版(PierceChemicalCo.,Rockford,IUinois(1984))禾口J.Meienhofer的《HormonalProteinsandPeptides》，第2巻(AcademicPress,纽约(1973));用液相法合成多肽可参考E.Schroder和K.Lubke的《ThePeptides》，第1巻(AcademicPress,纽约(1965))(这些文献的全文纳入本文参考)。在本发明的一个具体实施方案中，优选通过固相法合成本发明的多肽。在另一个方面，本发明提供了一种编码具有式(II)序列的多肽的核酸HGEGTX!TSDLSKQX2EEEAVX3LFIEWLKNGX4PX5(II)其中，Xj表示Phe或Tyr，X2表示Met、lie或Leu，X3表示Lys，X4表示Gly或缺失，Xs表示Arg或缺失。E4(f)多肽片段的基因采用E.Coli的偏好密码子。例如，如果用大肠杆菌表达该编码本发明多肽的核酸，则该核酸的密码子优选是大肠杆菌的偏好密码子。本发明还提供了一种用基因工程方法制备上述多肽的方法。该方法包括a),发酵能表达本发明多肽的宿主细胞；b)，分离提纯表达产物。该方法可进一步包括裂解所述表达产物的步骤。基因工程方法生产中等程度多肽(20-60个氨基酸残基)时，由于表达水平低，并且表达之后容易降解，所以，一般是将多肽基因连结在载体蛋白上，以融合蛋白方式进行表达，然后以化学或酶的方法将融合蛋白裂解，分离，纯化得到目的多肽。这种方法产量低，工艺繁杂。另一种方法是根据多肽的氨基酸序列，将表达基因多个串联起来，用适当的启动子进行表达，然后将串联多肽裂解，制备目的多肽。用这种方法已经有许多成功生产多肽的例子，如生产人胰岛素(Proc，Natl，Acad，Sci，USA，1984M4627-4631)、降钙素(JP62-226998)、GLP-1(W095/17510)。这种方法产量高。本发明优选采用上述基因串联方法表达本发明的多肽。在串联多肽裂解方面，可以使用所属领域的常用方法，如将Lys残基用拧康酸酐(CitraconicAnhydride)保护后，用胰蛋白酶从串联多肽中间的Arg处将肽链切断，再经酸处理脱去柠康酸(Citraconicacid)基团(参见J.D.Baxter.等，Nature1980456-461;JP62-226998)。如图1所示，在一个优选的具体实施方式中，该方法可以包括a)，发酵能表达本发明多肽的细菌细胞；b)，收集菌体；C),破碎细胞；d)，提取串联多肽；e)，对获得的多肽进行复性；f)，裂解；g),用高压液相层析提纯最终的多肽产品。由于多肽类(20-60个氨基酸残基)的基因工程表达必须与载体蛋白质连结，否则得不到表达产物，一个融合蛋白质分子中只有一个多肽分子，约占融合蛋白质分子的十分之一，产量很低，这样的融合蛋白质裂解后多肽的种类很多，目的多肽分离纯化困难。本发明将使多个多肽基串联后进行表达，表达的融合蛋白分子中全部都是目的多肽，裂解后多肽的种类单一，产量为前者的十倍以上，并且分离纯化容易。本发明的X3为Lyr，融合蛋白裂解时只切断串联分子中间的Arg，这样就保持E4(f)分子的完整。E4(f)C-端为Pro抵抗羧肽酶A、B的作用，有利于保持分子的稳定性。E4(f)Arg作为E4(f)的中间体，事实上E4(f)Arg在血液中迅速被羧肽酶B类水解除去形成E4(f)，二者皆可应用。为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多修改对所属领域技术人员来说都是显而易见了。另外，本申请引用的所有参考文献都纳入本文参考。图1.用基因工程法发酵生产Exendin4多肽片段的生产工艺流程。图2.Exendin4多肽片段的持续降血糖作用与Exendin4的比较。图3.Exendin4多肽片段对db/dbll型糖尿病小鼠的降血糖作用。图4.Exendin4多肽片段对GotoKokizakiII型糖尿病大鼠的餐后降血糖作用。曲线l表示空白对照组，曲线2表示给药组。图5.Exendin4多肽片段对四氧嘧啶(alloxan)人工糖尿病模型小鼠的降血糖作用。图6.Exendin4多肽片段的促胰岛素分泌作用。线条1表示给药组，线条2表示空白对照组。具体实施例方式实施例1固相合成Exendin4变体多肽在购自MultiSynTech公司的多重自动肽合成仪SyRoII上通过固相方法合成。氨基酸的a氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护；并对氨基酸进行侧链保护对Asp、Glu、Ser及Thr的侧链保护基为叔丁基，对Asn、Gln及His的为三苯甲基(Trt)，对Lys及Trp为叔丁氧羰基(Boc)，对Arg为2，2，5,7，8,-5-甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。以1^,^[-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，使保护的氨基酸依次偶联，偶联每次40分钟。在15%乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(1:1:lv/v/v)存在的情况下，肽与三氟乙酸(85%)在室温反应120分钟，从而从聚合体支持物上切割下来，同时脱除保护基。接着用无水乙醚沉淀肽，然后用无水乙醚多次洗涤，充分除去硫醇。在水/叔丁醇(1:l)中沉淀，冷冻干燥，得到粗肽。粗肽在30分钟内以反向HPLC纯化，以37-42%乙晴/0.9XTFA梯度进行。洗脱液浓縮，冻干，得到纯度》97%的白色固体。实施例2Exendin4变体多肽的基因工程生产工艺1),化学合成以下4个基因片段(博彩生物公司):(1)5，AATTCCAGATCTATGCGTCACGGCGAAGGCACCTACACCAGCCATCTGAGCAAACAG(2)5'ATGGAAGAAGAAGCGGTTAAACTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGCGGCCCGCGTGGATCCTAG;(3)5,TCGCTAGGATCCACGCGGGCCGCCGTTTTTCAGCCATTCGATGAACAGTTTAAC:CGCTTCTTCT;(4)5,TCCATCTGTTTGCTCAGATCGCTGGTGATGGTGCCTTCGCCGTGACGCATAGATCTGG。2)，连接基因片段-将四个合成的基因片段(A26加n^2)(1)、(2)、(3)、(4)中各加水5(^1，取(l)、(4)各2^1混合于一支试管中，另一支加(2)、(3)各2^1混合。加10X多聚核苷酸激酶缓冲液lfil、ATP(0.1mol/L)及T4噬菌体多聚核苷酸激酶1^1，37'C保温30分钟，然后在水浴中95°C维持5分钟。降至室温，将二支试管的内容物混合，加10X连接酶缓冲液2pl、ATP(O.lmol/L)lnl及T4连接酶2^1。于16'C保持12小时。然后用DNA分离试剂盒(博彩生物公司，promega公司)分离连接的片段，然后DNA片段用EcoRI、Sall双酶切，然后进行电泳检测验证。3)，克隆取质粒pUC18(博彩生物公司)l吗，力tU0X内切酶缓冲液1^1，加EcoRI、Sall各1^1。37"C维持30分钟，用氯仿-酚试剂处理，离心取水层，再用氯仿洗涤一次，离心除去氯仿后加60%异丙醇沉淀，离心，干燥备用。将步骤2)中获得的EcoRI、SalI双酶切的DNA片段加入到上述双酶切的质粒中，力卩IOX连接酶缓冲液1^1、ATPlpl及T4连接酶2^1，于16i:维持12小时。将EcoliJM109按常规方法制备感受态细胞，将上述连接的样品进行转化，挑取阳性克隆，抽提质粒。4)，串连将步骤3)获得的克隆了变体多肽基因的质粒经BglII+SalI双酶解，提取含有变体多肽的DNA基因片段。另外将步骤3)获得的质粒用BamHI+SalI双酶解，然后与含有变体多肽的DNA基因片段相连接，得含有二个变体多肽串联基因片段的质粒。继续将含二个串连的变体多肽基因片段的质粒经过BglII+SalI双酶切，得2个基因串连的片段，含二个串联基因的质粒经BamHI+SalI双酶切后再与这2个基因串联的片段连接形成4个基因串连的质粒。如此继续可得8个串联基因或16、32个基因串联的质粒。5)，转化将克隆变体多肽的质粒在冰浴中与感受态EcoliJM109混合，在冰浴中维持30分钟，移至42'C水浴中保持2分钟，冰浴中冷却，涂板(含1%琼脂糖，50吗氨苄青霉素/ml)，37°C过夜。挑取菌落，转至LB培养液摇瓶中(含50吗氨苄青霉素/ml)，37'C振荡培养过夜。取培养液0.7ml加50%甘油(无菌)0.31111，充分混含，保在于-85t)冰箱中备用。6)，发酵生产变体多肽的工艺发酵生产工艺如图1所示。首先，LB培养液1000ml(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCI10g)于12(TC灭菌30分钟，冷却后加入氨苄青霉素(最终浓度达到100pg/ml)，接种步骤5)获得的贮藏的甘油管lml，37'C振荡培养过夜。5000rpm离心收集菌体，低温-35'C冻结，融化后，加6M盐酸胍，均浆提取串联多肽，18000rpm离心收集上清液。将此上清液以缓冲液(10mMpH7.2磷酸缓冲液，0.1%巯乙醇)透析复性。离心分离串联多肽。然后按J.D.Baxter等的方法(Nature1980456-461)进行裂解，即将串联多肽溶于水中，加Na2C03粉末，维持PH8.5，滴加柠康酸酐使包涵体(InclusionBody)完全溶解，维持pH8.5,室温继续搅拌2小时，然后，加胰蛋白酶及羧肽酶B。37'C保持2小时，得多肽，然后加3N盐酸调至pH3，搅拌4小时，脱去柠康酸保护基，全过程以HPLC进行监控，最后得纯化的本发明的Exendiri4多肽片段。实施例3Exendin4多肽片段的持续降血糖作用取体重50g的KKII型糖尿病小鼠(中国科学院上海动物中心)，禁食2小时，分成四组，两组注射Exendin4，另两组注射本发明的Exendin4多肽片段(简称E4(f))各2吗，于0，30分，l小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时分别取20nl血液后用血糖测定试剂盒(购自上海生物制品研究所)测定持续降血糖作用。结果如图2所示。实施例4Exendin4多肽片段对db/dbII型糖尿病小鼠的降血糖作用取体重50g的db/dbII型糖尿病小鼠(购自中国科学院上海动物中心和扬州大学)，禁食2小时，皮下注射Exendin4多肽片段2吗，分别于0,30，60，120分钟各取血2(Hd，以血糖测定试剂盒(购自上海生物制品研究所)测定持续降血糖效果。结果如图3所示。实施例5Exendin4多肽片段对GotoKokizakiII型糖尿病大鼠的餐后降血糖作用取5个月龄的体重470g的GotoKokizaki糖尿病大鼠(购自中国科学院上海动物中心)，禁食2小时，腹腔注射20%葡萄糖lml，皮下注射Exendin4多肽片段5tig，对照组只注射葡萄糖。分别于0,30，60，120，分钟各取血20nl，以血糖测定试剂盒(购自上海生物制品研究所)测定其餐后耐糖。结果如图4所示，注射了Exendin4多肽片段的给药组的血糖始终维持在较低水平上，显著区别于没有给药的对照组。曲线l表示空白对照组，曲线2表示给药组。实施例5Exendin4多肽片段对四氧嘧啶(alloxan)人工糖尿病模型小鼠的降血糖作用取8周龄体重20g的小白鼠，分成五组，通过尾静脉注射四氧嘧啶(16mg/ml)O.lml，48小时后，皮下注射Exendin4变体多肽片段2吗，分别于0，30，60，120分钟各取血20W，以血糖测定试剂盒(购自上海生物制品研究所)测定降血糖作用。五组均显示了良好的降血糖效果，结果如图5所示。实施例6，Exendin4多肽片段促胰岛素的分泌作用取6个月龄、体重470g的GotoKokizakiII大鼠，皮下注射Exendin4多肽片段5吗，对照组只注射生理盐水，于0，3,5，10，15，30，45分钟取血20^1，应用ELISA试剂盒(Di肌osticSystemlab.Imc.(U.S.A))测定促胰岛素的分泌作用。结果如图6所示，注射了Exendin4多肽片段的给药组恢复了第一相的胰岛素分泌作用。权利要求1.具有式(I)结构的多肽及其药学上可接受的盐或酯HGEGTX1TSDLSKQX2EEEAVKLFIEWLKNGX4PX5(I)其中，X1表示Phe或Tyr，X2表示Met、Ile或Leu，X4表示Gly或缺失，X5表示Arg或缺失。2.如权利要求1所述的多肽，其中所述的&是Tyr。3.如权利要求1所述的多肽，其中所述的X2是Met。4.如权利要求1所述的多肽，其中所述的X4是缺失的。5.如权利要求1所述的多肽，其中所述的X!是Tyr,X2是Met，X4缺失，Xs是Arg或缺失。6.—种药物组合物，其含有如权利要求1-5中任一项所述的多肽。7.如权利要求6所述的药物组合物，其还含有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述的载体是乙醇、甘油和水中的一种或多种。9.如权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备治疗糖尿病的药物中的用途。10.如权利要求9所述的用途，其中糖尿病是II-型糖尿病。全文摘要本发明涉及一种Exendin4多肽片段，其特征是多肽序列为HGEGTX₁TSDLSKQX₂EEEAVKLFIEWLKNGX₄PX₅，其中X₁表示Phe或Tyr；X₂表示Met、Ile或Leu；X₄表示Gly或缺失；X₅表示Arg或缺失。该多肽具有降低血糖的作用，可用于治疗II型糖尿病。本发明还涉及Exendin4多肽片段的制备方法。文档编号A61P3/00GK101280009SQ200810008419公开日2008年10月8日申请日期2005年6月29日优先权日2005年6月29日发明者奚绍祁,兵王,马晓鹏申请人:常州制药厂有限公司