专利名称：一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法
技术领域：
本发明属于鱼类细胞工程育种技术领域，特别涉及一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法。
背景技术：
雌核发育是单性生殖的一种，是指卵子只依靠本身的遗传物质发育成为个体的生殖行为。在鱼类提纯育种中，一般认为I代雌核发育鱼的纯合效应相当于多代鱼的自交提纯的效应，因此在雌核发育后代中可获得遗传纯度高、抗逆性强、生长速度快等优势个体。人工雌核发育技术作为一种细胞工程技术，在鱼类提纯育种、探讨鱼类性别决定机制、快速建立纯系和鱼类单性养殖方面具有重要理论意义和广阔的应用前景。锦鲤(CyprinuscarpioL.)隶属于鲤形目、鲤科、鲤属，是一种大型名贵观赏鱼类， 被人们称为“水中活宝石”、“会游泳的艺术品”。根据斑纹的颜色可分为三大类，即单色类，如浅黄、黄金、变种鲤等；双色如红白、写、别甲等；三色类如大正三色、昭和三色、衣等。该鱼是由鲤鱼突变品系经人工杂交选育而成，基因高度混杂，遗传性状极不稳定，在养殖过程中主要是以色斑这一表型特征进行挑选，而市场上主要以其花色、斑纹等为主要观赏价值，但目前对于锦鲤的色素遗传机制尚不清楚。经验丰富的育种者即使很仔细地进行锦鲤品系间的交配，仍很难预测其子代的色斑分化，只有通过无数次繁育，十数次挑选，方能从数以万计的苗种中挑选出几条极具观赏价值的个体，这也是目前锦鲤价格随其观赏价值的增长而成指数比例增长的原因。因此，通过人工雌核发育技术获得基因高度纯合的后代，构建一系列具有观赏价值的锦鲤纯系，使育种者能有效地预测和控制花色，为定向培育优良锦鲤新品种奠定基础，对进一步探讨锦鲤色素遗传机制提供研究样本，具有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法。利用本发明技术可快速获得锦鲤纯系，为定向培育优良锦鲤新品种奠定基础，对进一步探讨锦鲤色素遗传机制提供研究样本。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，包括以下步骤首先挑选雌性锦鲤和雄性团头鲂作为亲鱼，然后进行人工催产获得团头鲂精子和锦鲤卵子，将经紫外线灭活的团头鲂精子与锦鲤卵子混合均匀撒在平铺于水中的网片上，经5min后将被激活的锦鲤卵子置于5°C冷水中冷休克处理18 25min，冷休克处理后的胚胎在21V 23°C水温下孵化，按照锦鲤繁殖常规方法进行孵化管理，生产出锦鲤雌核发育
二倍体鱼苗。上述团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法中，所述挑选雌性锦鲤和雄性团头鲂作为亲鱼是指在繁殖前期挑选色斑切边整齐、品种特征强烈、色质优异、体型良好、健康无病、性成熟特征明显的雌性锦鲤和性成熟特征明显、体质健康的雄性团头鲂作为亲鱼进行专池精养，使其性腺良好发育。上述团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法中，所述团头鲂精子与锦鲤卵子混合均匀撒在沉于水中的网片上是指团头鲂精子与锦鲤卵子混合均匀入水后完成卵子的激活，水温保持在22 土 I C。上述团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法中，所述紫外线灭活的具体操作步骤为将所述团头鲂精液用Hank’ s液按体积比1:5的比例稀释后均匀涂铺于培养皿中，精液厚度不超过1_，再将培养皿置于垫有冰盘的摇床上，以紫外线进行照射，确保精液受到均匀处理。辐射源为I支20W的紫外灯管，波长253. 7nm,辐照度90 100 μ W/cm2。紫外灯管与精液面垂直距离为10 12cm。当60% 70%的团头鲂精子仍具有较好的活力时，停止照射，完成紫外线灭活处理。上述团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法中，所述紫外灯照射处理时间优选为
25 35min。本发明利用失活团头鲂精子启动锦鲤卵子雌核发育以及染色体组加倍的措施，所诱导产生的后代只含有雌性亲本的基因，可加速基因纯合化，可用于锦鲤快速育种，同时也是进行锦鲤体色遗传分析与性别控制的有效辅助手段。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明在繁殖季节前2 3个月挑选色斑切边整齐、品种特征强烈、色质优异、体型良好、健康无病、性成熟特征明显的雌性锦鲤和性成熟特征明显、体质健康的雄性团头鲂作为亲鱼，进行专池精养，选用添加Ve的亲鱼配合饲料进行合理投喂，促进性腺良好发育。当水温稳定在20 22°C时，挑选性腺发育良好、体质健壮的上述亲鱼，另选取2 3倍于雌性锦鲤数量的雄性锦鲤(用于刺激雌性锦鲤发情)，进行人工催产，混合注射LRH-A220 μ g/Kg, HCG1000IU/Kg，雄鱼剂量减半，采用胸鳍基部一次注射法。注射催产剂后将雌、雄锦鲤放入同一产卵池，并设置鱼巢，以检测亲鱼的发情产卵情况；雄性团头鲂放入另一产卵池中。当发现锦鲤亲鱼在产卵池中激烈追逐时，将团头鲂雄鱼捞出采集精液。将采集的团头鲂精液用Hank’ s液按体积比1:5稀释均匀涂铺于培养皿中，精液厚度不超过1mm，再将培养皿置于垫有冰盘的摇床上，以紫外线进行照射，确保精液受到均匀处理。辐射源为I支20W的紫外灯管，波长253. 7nm,辐照度92 μ W/cm2。紫外灯管与精液面垂直距离为IOcm0照射时间25 35min，视精子活力情况而定。在紫外线照射过程中，定时用牙签沾一点精液置于载玻片上，用水激活后与显微镜下观察其活性，当60% 70%的团头鲂精子仍具有较好的活力时，停止照射，完成紫外线灭活处理。将每一批紫外线灭活精子都放入小烧杯中，于4°C下在冰箱中黑暗保存。在紫外线处理精子即将完成时，采集锦鲤卵子，并将灭活团头鲂精子与锦鲤卵子混合，用干净羽毛轻轻搅拌均匀，再将卵子均匀撒在平铺于水中的网片上，水温保持在22±1°C。孵育5min后，将粘附有被激活的锦鲤卵子的网片置于恒温培养箱，在5°C冷水中冷休克处理20min，冷休克处理后的胚胎在21°C 23°C水温下孵化。按照锦鲤繁殖常规方法进行孵化管理，生产出锦鲤雌核发育二倍体鱼苗。本实施例所用的Hank’ s液配方如下NaC17. 5g, CaCl2O. 4g, KC10. 2g,加蒸懼水至1000ml, pH7. 0 7· 3。用单个仔鱼染色体倍性检测方法对本实施例中刚孵化出来的雌核发育锦鲤仔鱼的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现用团头鲂精子诱导的雌核发育锦鲤为二倍体(2η=100)。上述实施例中单个仔鱼染色体制备步骤为随机选取处理组仔鱼10 20尾，用载玻片将单个仔鱼压碎，取组织块，用O. 005mol/L秋水仙素处理2h，用O. 075mol/LKCL溶液低渗处理I. 5 2h,再用Carnoy’s固定液固定。用常规空气干燥法制片，Giemsa染色。每个胚胎选择10个左右清晰可数的中期分裂相，在显微镜油镜下镜检并拍照。用本实施例方法选育雌核发育锦鲤，可明显提高人工雌核发育的成功率，表明团头鲂精子是进行锦鲤人工雌核发育的理想材料，在锦鲤体色遗传规律研究和遗传育种方面具有重要的生物学意义。 本发明技术方案所依据的科学原理雌核发育是单性生殖的一种，是指卵子只依靠本身的遗传物质发育成为个体的生殖行为。卵子发育需要同源或异源精子进入卵内，但这些精子只起启动作用，并不参与发育，胚胎发育完全在雌核控制之下进行，得到的子代全部是母性性状，基因型与母本相同或略有差异。以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
权利要求
1.一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，其特征在于，包括以下步骤首先挑选雌性锦鲤和雄性团头鲂作为亲鱼，然后进行人工催产获得团头鲂精子和锦鲤卵子，将经紫外线灭活的团头鲂精子与锦鲤卵子混合均匀撒在平铺于水中的网片上，经5min后将被激活的锦鲤卵子置于5°C冷水中冷休克处理18 25min，冷休克处理后的胚胎在21°C 23°C水温下孵化，按照锦鲤繁殖方法进行孵化管理，生产出锦鲤雌核发育二倍体鱼苗。
2.根据权利要求I所述的团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，其特征在于，所述紫外线灭活的具体操作步骤为将所述团头鲂精液用Hank’ s液按体积比1:5的比例稀释后均匀涂铺于培养皿中，精液厚度不超过1_，再将培养皿置于垫有冰盘的摇床上，以紫外线进行照射，确保精液受到均匀处理，辐射源波长波长253. 7nm,辐照度90 100 μ ff/cm2,紫外光源与精液面垂直距离为10 12cm，当60% 70%的团头鲂精子仍具有的活力时，停止照射，完成紫外线灭活处理。
3.根据权利要求2所述的团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，其特征在于，所述紫外灯照射处理时间为25 35min。
4.根据权利要求1、2或3所述的团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，其特征在于，所述挑选雌性锦鲤和雄性团头鲂作为亲鱼是指在繁殖前期挑选色斑切边整齐、品种特征强烈、色质优异、体型良好、健康无病、性成熟特征明显的雌性锦鲤和性成熟特征明显、体质健康的雄性团头鲂作为亲鱼进行专池精养，使其性腺良好发育。
5.根据权利要求I所述的团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，其特征在于，所述团头鲂精子与锦鲤卵子混合均匀撒在沉于水中的网片上是指团头鲂精子与锦鲤卵子混合均匀入水后完成卵子的激活，水温保持在22±1°C。
6.根据权利要求2所述的团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，其特征在于，所述每1000ml Hank，s 液中含有 NaC17. 5g, CaCl2O. 4g, KC10. 2g，溶质为蒸馏水，pH7. O 7· 3。
全文摘要
本发明公开了一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法，包括以下步骤首先挑选雌性锦鲤和雄性团头鲂作为亲鱼，然后进行人工催产获得团头鲂精子和锦鲤卵子，将经紫外线灭活的团头鲂精液与锦鲤卵子混合均匀撒在平铺于水中的网片上，经5min后将被激活的卵子置于5℃冷水中冷休克处理18～25min，冷休克处理后的胚胎在21℃～23℃水温下孵化，获得二倍体雌核发育锦鲤。本发明利用失活团头鲂精子启动锦鲤卵子雌核发育以及染色体组加倍的措施，所诱导产生的后代只含有雌性亲本的基因，可加速基因纯合化，在锦鲤体色遗传规律研究和遗传育种方面具有重要的生物学意义。
文档编号A01K61/00GK102919185SQ20121049121
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者梁拥军, 张升利, 杨璞, 孙向军, 史东杰, 张欣, 苏建通, 孙砚胜 申请人:北京市水产科学研究所