专利名称：一种包被载体及其在检测精子成熟度和无创分离成熟精子方法中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测体外精子质量、体外辅助生殖领域，特别是涉及一 种包被载体及其在检测精子成熟度和无创分离成熟精子方法中的应用。
背景技术：
透明质酸是卵子和透明带黏液基质的主要成分。精子顶体和胞质膜 中含有透明质酸酶。当精子穿透卵冠丘复合体时，胞质膜中透明质酸酶水
解卵冠丘复合体中的黏液透明质酸，从而穿过黏液；在透明带诱发顶体 反应时精子释放透明质酸酶水解透明质酸，有助于精子穿透透明带完成 受精。在整个过程中，精子与透明质酸结合起到了重要作用。有研究表明 只有成熟的活动精子可以与透明质酸结合，成熟精子遗传物质完整，有 益于成功妊娠和子代健康。
辅助生殖是治疗不孕不育的有效方法，但同时也存在一定的遗传风 险，尤其是采用细胞浆内精子注射(ICSI)技术时，穿入卵细胞的精子 是人为选择的，选择具有一定的随机性，所选精子的成熟度将决定胚胎 的健康状况，不成熟的精子与卵细胞结合后，胚胎会变得不稳定，容易 导致流产、胚胎停止发育以及畸形等严重后果。由于必须保证精子的形 态、结构与活力不受外来破坏，故要选择成熟的精子进行ICSI目前是一 件非常困难的事情
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种透明质酸或透明质酸盐或透 明质酸衍生物包被载体，并应用于检测精子成熟度和分离成熟精子，结 果准确可靠、操作简单快捷、成本低、安全性能好的；还提供应用这种 包被载体来检测精子成熟度和分离成熟精子的方法。
为解决上述问题，本发明提供一种包被载体，其特征在于所述包 被载体为被透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的栽体。
所述包被载体为包被载片或包被容器，或包被的球体或圆柱体或锥 体或立方体或不规则体置于或固定在载片表面或容器内。
所述的包被载体通过如下步骤制备
a. 以乙醇洗涤待包被载体，干燥；
b. 透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物2~6mg/ml,脱乙 酰壳多糖3~8 mg / ml,以0.02 0.10mol/L、 pH = 4.0的柠檬 酸或醋酸緩沖液充分溶解，室温搅拌反应2小时；
c. 包被于载体；
d. 以10~30%丙酮，0.5 3.5% 1,2,7,8-二环氧基辛烷，10~25%异 丙醇，余量为蒸馏水组成的洗涤液洗涤3次，烘干即可；
所述包被载体为无毒性材质；所述包被载体为玻璃材质或塑料材质。 本发明的透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的载体应用
于检测活力精子成熟度。
本发明还提供一种检测精子成熟度的方法，其特征在于，包括如下
步骤
A. 制备活力精子标本；
B. 将活力精子标本加样到透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生 物包^皮载体；
C. 室温反应5-60分钟，使成熟的活力精子与包被物结合；D. 显微镜下观察活力精子头部被包被物捕获的状况，并计数一定数
量的活动精子和其中与包被物结合的活动精子个数；
E. 计算活力精子与透明质酸结合率，公式为活力精子与透明质酸 结合率=与包被物结合的活动精子数/活动精子总数x100。/。。
所述步骤A中标本制备方法为取用液化的新鲜精液，或取用液氮超 低温冻存的解冻精液；
其中，新鲜精液液化方法为
a. 等待新鲜精液在体外自然液化；
若精液在体外60分钟后仍然不能完全自然液化时，则
b. 在精液中加入培养液或商品化的精子洗涤液并以吸管反复吹 打，促进精液完全液化；或
c. 在精液中加入lmg/ml菠萝蛋白酶等蛋白水解酶，37。C孵育 5 20分钟；
所述步骤B中的载体为包被载片或者是表面置有或固定有包被的球 体或圆柱体或锥体或立方体或不规则体的载片，将活力精子标本加样到 包被的载片后盖上盖玻片；
所述步骤D中，计数的活动精子总数大于或等于200个。 所述检测方法中活力精子标本的加样量与透明质酸或透明质酸盐或 透明质酸衍生物在载体上的包被量、包被范围有关；活力精子标本的加 样量越大、标本中活力精子密度越大，要求透明质酸在载体上的包被量 与包被范围越大；载体上包被物结合精子的能力相对于参入反应的精子 总是过量的。该方法中反应时间与室温有关，室温较高、反应时间过长 可能导致结合的精子因活动力增强而挣脱结合； 一般反应时间为5~60分 钟。
由于只有成熟的活动精子才可与透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物结合，故与载体结合的为成熟的活力精子，不能结合的为非成熟
精子，精子透明质酸结合判定标准为精子活动受限，精子头部结合在 载体上不能前向泳动，精子尾部可自由摆动的为与载体结合的活力精子， 即成熟精子；精子头部未与载体结合，精子整体可以自由穿梭泳动的为 非结合精子，即非成熟精子；检测的活动精子总数不低于200个。检测 的活动精子总数包括与透明质酸结合的和非结合的活动精子。
本发明的透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的载体应用 于分离成熟精子。
本发明还提供一种分离成熟精子的方法，其特征在于，包括如下步
骤
A. 活力精子标本制备；
B. 将活力精子标本加样到透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生 物包^皮载体内；
C. 18-37度下反应5-120分钟，使成熟活力精子与包被物结合；
D. 收集与包被物结合的精子。 所述步骤A中，样品制备包括以下步骤
a、 采用液化的新鲜精液或采用液氮超低温冻存的解冻精液；
其中，新鲜精液的液化方法为①等待新鲜精液在体外自 然液化；若新鲜精液在体外60分钟后仍然不能完全液化时， 则②在精液中加入培养液或商品化的精子洗涤液并以吸管反 复吹打；③在精液中加入lmg/ml的菠萝蛋白酶等蛋白水解 酶，37。C孵育5~20分钟；
b、 以上泳法或密度梯度法收集高活力精子；
c、 以培养液或商品化的精子洗涤液调整精子浓度至 0.25 1.0xl06/ml;
9d、在洁净的包被栽体内预先加入培养液覆盖包被区域；或在栽
体包净皮区域内预先加入培养液滴或聚乙烯基吡咯烷酮液滴； 其中，所述步骤b中上泳法收集高活力精子的步骤如下
① 于试管底部加入精液lml,轻轻在试管精液上层加入1.5 ml培 养液，其中精液与培养液体积比值为1:1.5;
② 轻轻将试管置于45度角倾斜试管架上，置37。C、 5%(:02培 养箱中孵育1小时；
③ 小心吸取最上层lml培养液；
④ 500g离心5分钟；
⑤ 吸走精子沉淀团上方的培养液；
⑥ 加入0.2ml培养液。
所述步骤B中的载体为包被容器，或者是内部置有或固定有包被的 球体或圓柱体或锥体或立方体或不规则体的容器；
所述步骤B中的包被载体为无毒无热源型材质；
所述步骤B中的将活力精子标本加样到包被载体内的方法，采用如 下三种方法中的其中一种
直接覆盖包净皮区域；或
当在洁净的包被载体内预先加入了培养液时，则加样到该培养液中；
或
当在载体包被区域内存在预先加入的培养液滴或聚乙烯基吡咯烷酮 液滴时，则加样到上迷液滴内；
所述步骤D的收集与透明质酸结合的精子的方法为直接在显4敖镜 下以细胞浆内精子注射用穿刺针或其他中空细管吸取与载体内包被区域 结合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者
小心倾倒去除未与包被区域结合的精子并立即加入培养液或商品化
10的精子洗涤液；然后直接在显微镜下以细胞浆内精子注射用穿刺针或中 空细管吸取与包被区域结合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者
小心倾倒去除未与载体内包被区域结合的精子后，立即在载体内加 入培养液或商品化的精子洗涤液，并以吸管轻轻吹打透明质酸或透明质 酸盐或透明质酸衍生物包被区域结合的精子，促进结合精子从结合表面 分离，收集分离后的精子，即得到成熟的活力精子。
所述分离方法中捕获精子能力与反应时间和温度有关， 一般反应时 间为5 120分钟，温度为18~37°C。经过试验18 28。C反应时间10~30 分钟；30 35"C反应时间5 10分钟；28°。反应时间30 120分钟，结果发 现28。C反应时间30-120分钟较18~28°(:反应时间10 30分钟可捕获更多 的成熟精子，在此期间，反应时间越长捕获的精子量越多。
所述分离方法中进一步采用上泳法或者密度梯度法不仅提高了高活 力精子的回收率，从而也提高了后续提取成熟活力精子的效率。
本发明中检测和分离方法所用的培养液可以是本领域实验室常少见所 用的培养液，比如可以是HTF培养液或F10培养液或Qui皿，s培养液或 Earle培养液。或由下述组分组成的培养液NaCl重量含量为0.28-1.11%、 KC1重量含量为0.02-0.07%、 CaCl2'2H20重量含量为0.01-0.05%、 KH2P04 重量含量为0.01-0.03%、 MgS04.7H20重量含量为0.01-0.06%、酚红重量 含量为0.0005-0.003%。、 NaHC03重量含量为0.10-0.42%、葡萄糖重量含 量为0.05-0.20%、焦丙酮酸钠重量含量为0.015-0.060%0、 BSA重量含量 为0.17-0.70%、青霉素的含量为10000-20000单位％、硫酸链霉素重量含 量为0.05-0.50%。和乳酸钠糖浆(600 g/L)体积含量为0.18-0.74%,余量为 蒸馏水。该培养液用于调整精子密度，为精子提供能量和适宜的生存与 反应条件，也可用于以上泳法提取高活力精子。
本发明中的活力精子是指有运动力的精子， 一定是活体精子；而活
ii体精子不一定具有运动力。活动精子是指具有泳动能力的精子，与活力 精子同义。
本发明的有益效果为
1、 由于只有成熟的精子头部才具备与透明质酸或透明质酸盐或透明 质酸衍生物结合的受体，因此通过检测活力精子与透明质酸或透明质酸 盐或透明质酸衍生物包被固相结合的状况，便可判定精子的成熟状况； 将结合于包被固相的活力精子通过洗涤或直接选取的方法从包被固相上 分离开，就可以获得成熟、结构完整无损的活力精子。研究表明分别 以免疫组化法、苯胺蓝染色法、荧光染色法、钙离子载体法、巴氏染色 法、计算机辅助分析法检测精子的肌酸激酶、核蛋白、DNA、诱发顶体 反应、形态学和活动力，发现透明质酸结合精子与非结合精子之间、透 明质酸结合法分离之后与分离前精子之间均存在显著性差异(PO.01 ), 与透明质酸结合的精子、透明质酸结合法分离之后的活力精子各项指标 均明显高于非结合精子和分离前的精子，且与这些指标呈正相关。这些 充分说明本发明方法捕获的精子成熟度高，结果准确可靠。
2、 由于采用了预包被方案，试剂组成简单，操作简单快捷；
3、 本发明采用无毒性包被载体，不会杀伤活力精子；采用无毒无热 源性的包被载体、保证了分离后的精子用于辅助生殖的安全性。
本发明可用于评价男性精子质量、精子成熟度及男性不育病因学分 析；并适用于辅助生殖或生殖研究中安全地收集成熟活力精子，从而实 现较大程度改善胚胎质量的目的。
图1是实施例八中，28"条件下反应时间与透明质酸包被载体捕获 精子数量的关系趋势图。
具体实施例方式
实施例一包被载体的制备 按照如下步骤制备包被载体
a. 以乙醇洗涤待包被载体，千燥；
b. 以0.02mol/L的柠檬酸緩冲液(pH 4.0 )充分溶解得到的透明质酸 2mg/ml、脱乙酰壳多糖8mg/ml,室温搅拌反应2小时；
c. 包纟皮于载体；
d. 以10°/。丙酮，0.5% 1,2,7,8-二环氧基辛烷，25%异丙醇，余量蒸馏 水混合而成的洗涤液洗涤3次，烘干。
其中，包被载体可以是包被载片，包被容器，表面置有或固定有包 被的球体或圆柱体或锥体或立方体或不规则体的载片，内部置有或固定 有包被的球体或圆柱体或立方体或不规则体的容器等。
其中，包被载体可以是玻璃载体、塑料载体或其它材质的载体。 其中，包被载体可以是各种培养亚、微孔或微板(microwdl & microplate)、试管、培养管、离心管或其他载体。 '
实施例二包被载体的制备
方法同实施例一，所不同在于，步骤b中采用透明质酸衍生物透 明质酸衍生物6mg/ml，脱乙酰壳多糖6mg/ml，以0.10mol/L的柠檬 酸緩冲液(pH4.0)充分溶解，室温搅拌反应2小时；
步骤d中的洗涤液成分为30%丙酮,3.5% 1,2，7,8-二环氧基辛烷, 10°/。异丙醇，余量蒸馏水。
所述透明质酸衍生物的种类包括在透明质酸分子的羧基、羟基、 N-乙酰基和还原末端4个位点，与其他化合物以酯化、交联、接枝等化 学方式修饰形成的衍生化合物。
13实施例三包被载体的制备
方法同实施例一，所不同在于，所述步骤b中采用透明质酸钠盐和
其他緩沖液透明质酸钠盐4mg/ml,脱乙酰壳多一唐3 mg/ml，以 0.06mol/L的醋酸緩冲液(pH4.0)充分溶解混匀，室温搅拌反应2小时；
所述步骤d中的洗涤液成分为20。/。丙酮，2.0% 1,2，7,8-二环氧基辛 烷，15%异丙醇，余量蒸馏水。
上述透明质酸钠盐可以用透明质酸钾盐替换，其它均同。
实施例四应用包被载体检验活力精子的成熟度 具体步骤如下
1. 活力精子标本准备取男性新鲜精液，由于60分钟仍然不能液化， 故在精液中加入lmg/ml菠萝蛋白酶等蛋白水解酶，37。C孵育5 20分钟 使其液化。
2. 取活力精子标本10ul加样到包被载片，盖上盖玻片；
3. 室温反应IO分钟，使成熟的活力精子与透明质酸结合；
4. 在30分钟内完成结果观察和计数显微镜下观察的活动精子总数 为300个，其中，与透明质酸结合的活动精子为15个。成熟活力精子判 定标准精子活动受限，精子头部结合在载体上不能前向泳动，精子尾 部可自由摆动的为成熟的活力精子；精子头部未与载体结合，精子整体 可以自由穿梭泳动的为非成熟活力精子。
5. 计算活力精子与透明质酸的结合率。活力精子透明质酸结合率=与 透明质酸结合的活动精子数/活动精子总数x100。/。 = 15/300xl00%=5%, 即为精子标本的成熟度。
实施例五应用包被载体检验活力精子的成熟度 具体步骤如下1. 活力精子标本准备取男性新鲜精液，由于60分钟仍然不能液化， 故加入培养液(也可采用其他商品化的精子洗涤液)并以吸管反复吹打 以使其液化。
2. 取上述活力精子标本10ul加样到包被载片，盖上盖玻片；
3. 室温反应30分钟，使成熟的活力精子与透明质酸结合；
4. 在30分钟内完成结果观察和计数。显微镜下观察的活动精子总数 为400个，其中，与透明质酸结合的活动精子为260个。成熟活力精子 判定标准精子活动受限，精子头部结合在载体上不能前向泳动，精子 尾部可自由摆动的为成熟的活力精子；精子头部未与载体结合，精子整 体可以自由穿梭泳动的为非成熟活力精子。
5. 计算活力精子透明质酸结合率。活力精子透明质酸结合率=与透 明质酸结合的活动精子数/活动精子总数><100% =260/400=65%，即为精 子标本的成熟度。
实施例六应用包被载体检验活力精子的成熟度 具体步骤如下
1. 活力精子标本准备取男性新鲜精液，其在体外30分钟时完全自 然液化。
2. 取上述活力精子标本10ul加样到包被载片，盖上盖玻片；
3. 室温反应60分钟，使成熟的活力精子与透明质酸结合；
4. 在30分钟内完成结果观察和计数。显微镜下观察的活动精子总数 为500个，其中，与透明质酸结合的活动精子为450个。成熟活力精子 判定标准精子活动受限，精子头部结合在载体上不能前向泳动，精子 尾部可自由摆动的为成熟的活力精子；精子头部未与载体结合，精子整 体可以自由穿梭泳动的为非成熟活力精子。
5. 计算活力精子透明质酸结合率。活力精子透明质酸结合率=与透明质酸结合的活动精子凄W活动精子总数x100 % = 450/500x100 % =90 % ， 即为精子标本的成熟度。
实施例七应用包被载体检验活力精子的成熟度
方法基本同实施例六，所不同在于，活力精子标本采用超低温冻存 的解冻精液，显微镜下观察的活动精子总数为500个，其中，与透明质 酸结合的活动精子为350个。活力精子透明质酸结合率=与透明质酸结合 的活动精子数/活动精子总数x100。/0 =350/500x100% =70%，即为精子标 本的成熟度。
实施例四 七中，采用的包被载体为包被载片，还可以采用表面置 有或固定有包被的球体或圓柱体或锥体或立方体或不规则体的载片。
实施例八应用包被载体分离、收集成熟的活力精子 具体步骤如下
1.样品制备
1 )取1份男性新鲜精液，在精液中加入lmg/ml的菠萝蛋白酶等
蛋白水解酶，37。C孵育5 20分钟，使其液化。 2)以上泳法收集高活力精子
① 于试管底部加入精液lml,轻轻在试管精液上层加入1.5 ml 培养液(精液与培养液体积比值为1:1.5);
② 轻轻将试管置于45度角倾斜试管架上，置37。C、 5%<:02培 养箱中孵育1小时；
③ 小心吸取最上层lml培养液； 500g离心5分钟；
⑤ 吸走精子沉淀团上方的培养液；
⑥ 加入0.2ml培养液；
163) 上述得到的液体取三份，分别以培养液调整精子浓度至
0.25xl06/ml， 0.5xl06 /ml, l.OxlO6 /ml，调整浓度后每份样品 lOjil;
4) 在洁净的包被容器内预先加入培养液。
2. 将上述3份样品的活力精子标本分别加样到透明质酸或透明质酸 盐或透明质酸衍生物包被容器内的培养液中。
3. 分别于28。C反应15, 30, 45， 60， 75， 90， 105, 120分钟， <吏 成熟活力精子与透明质酸结合。
4. 收集与透明质酸结合的精子直接在显微镜下以细胞浆内精子注 射(ICSI)用穿刺针(也可以用其他中空细管代替)吸取与容器内包被 区域结合的活动精子，即得成熟的活力精子。结果参见附图1所示，随 着时间推移收集成熟精子量增加。
实施例九应用包被载体分离、收集成熟的活力精子 具体步骤如下
1.样品制备
1 )取新鲜精液，加入培养液或商品化的精子洗涤液并以吸管反复 吹打，使其完全液化；
2) 同实施例八，以上泳法收集高活力精子；
3) 以商品化的精子洗涤液，如美国Irvine公司的F10精子洗精 液，调整精子浓度至0.25-1.0xl(^个/ml;(如果在"包被载体检验活 力精子的成熟度"试验中，精子成熟率较高，则此处精子浓度可以 低一点；如果标本中精子成熟率较低，为了可以收集到较多的成熟 精子，则此处精子浓度应调整得高一些。如果收集的精子仅仅是用 于ICSI,则精子数量不需要太多，此处精子浓度无需太高，但如果 并非是ICSI用途，需要的成熟精子越多越好，则此处精子浓度调高一些更好。) 4)在洁净的容器包被区域内加入聚乙烯基吡咯烷酮液滴；
2.将活力精子标本加样到包被区域的聚乙烯基吡咯烷酮液滴中； 3.37。C反应120分钟，使成熟活力精子与透明质酸结合。 4.收集与透明质酸结合的精子小心倾倒去除未与容器内透明质酸 或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被区域结合的精子并立即加入培养液 或商品化的精子洗涤液，容器内即为分离得到的成熟的活力精子，然后 直接在显微镜下以细胞浆内精子注射用穿刺针或中空细管吸取与容器内 透明质酸包被区域结合的活力精子。这样处理去除了未结合的精子，在 最后收集成熟精子时，大大减少非成熟精子混入成熟精子中的机会。
实施例十应用包被载体分离、收集成熟的活力精子 具体步骤如下
1.样品制备
1) 取超低温冻存的解冻精液；
2) 以密度梯度法收集高活力精子。采用瑞典Nidacon公司的密度 梯度液PureSperm40和PureSperm80,密度梯度方法如下
① 临用前制备梯度先在无菌锥形离心管底加入体积约为 PureSperm80密度梯度液2ml，然后其上层轻轻加入体积约为 PureSperm40的密度梯度液2ml，勿混合，待用。
② 在上述已制备好的密度梯度管中加入精液l~1.5ml。 300g离心 20分钟。
③ 用另一支无菌巴氏管吸走上层精液、密度梯度液。
④ 再用另一支无菌巴氏管穿过梯度液，吸取底部精子沉淀物。
将收集到的精子沉淀团加入到另外一支无菌锥形离心管。
⑥加入5ml培养液或商品化的精子洗涤液(如瑞典Nidacon公司PureSpermWash)， 轻丰5〉'昆勻。
⑦ 500g离心IO分钟。
⑧ 用新的巴氏管吸去精子沉淀团上方的液体。
⑨ 力口入0.2 0.4ml培养液。
3 )以培养液调整精子浓度至0.25-1.0xl(^个/ml;(如果在"包^皮载 体检验活力精子的成熟度"试验中，精子成熟率较高，则此处 精子浓度可以低一点；如果标本中精子成熟率较低，为了可以 收集到较多的成熟精子，则此处精子浓度应调整得高一些。如 果收集的精子仅仅是用于ICSI,则精子数量不需要太多，此处 精子浓度无须太高，但如果并非是ICSI用途，需要的成熟精 子越多越好，则此处精子浓度调高一些更好。)
4)在洁净的包被容器内包被区域加入培养液滴。
2. 将活力精子标本加样到上述包被区域的培养液滴中。
3. 18。C反应IO分钟，使成熟活力精子与透明质酸结合。
4. 收集与透明质酸结合的精子小心倾倒去除未与容器内透明质酸 或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被区域结合的精子后，立即在容器内 加入培养液或商品化的精子洗涤液，并以吸管轻轻吹打透明质酸或透明 质酸盐或透明质酸衍生物包被区域结合的精子，促进结合精子从结合表 面分离，收集分离后的精子，即得到成熟的活力精子。这样处理去除了 未结合的精子，在最后收集成熟精子时，大大减少非成熟精子混入成熟 精子中的机会，且能一次性获得数量较多的成熟精子。
其中，实施例八 十中，采用的包被载体为包被容器，还可以釆用 内部置有或固定有包被的球体或圆柱体或锥体或立方体或不规则体的容 器。
其中，实施例四 十的描述中，采用的载体是以透明质酸包被的，也可以采用透明质酸盐和透明质酸衍生物的包^^皮载体，应用的方法相同， 透明质酸盐和透明质酸衍生物与精子结合的有效成份仍是"透明质酸"。
另外，本发明(包括权利要求和各实施例中)所述透明质酸盐包括
钠盐、钾盐等。所述透明质酸衍生物的种类包括在透明质酸分子的羧 基、羟基、N-乙酰基和还原末端4个位点，与其他化合物以酯化、交联、 接枝等化学方式修饰形成的衍生化合物。
本发明的方法中，精子液化的方法也可以采用新鲜精液在体外60分 钟内自然液化，但所需时间较长，如60分钟后仍然不能完全液化时，可 采用实施例八~九的液化方法。
权利要求
1、一种包被载体，其特征在于所述包被载体为被透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的载体。
2、 根据权利要求1所述的包被载体，其特征在于所述包被载体为包被载片或包被容器，或包被的球体或圓柱体或锥体或立方体或不规则体置于或固定在载片表面或容器内。
3、 根据权利要求1或2所述的包被载体，其特征在于，通过如下步骤制备a. 以乙醇洗涤待包被载体，干燥；b. 透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物2 6mg/ml，脱乙酰壳多糖3 8mg/ml，以0.02 0.10mol/L、 pH =4.0的柠檬酸或醋酸緩沖液充分溶解，室温搅拌反应2小时；c. 包^皮于载体；d. 以10 30%丙酮，0.5~3.5% 1，2，7,8-二环氧基辛烷，10 25%异丙醇，余量为蒸馏水组成的洗涤液洗涤3次，烘干即可；所述包被载体为无毒性材质；所述包被载体为玻璃材质或塑料材质。
4、 权利要求1所述的透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的载体应用于检测活力精子成熟度。
5、 一种检测精子成熟度的方法，其特征在于，包括如下步骤A. 制备活力精子标本；B. 将活力精子标本加样到透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被载体；C. 室温反应5-60分钟，使成熟的活力精子与包被物结合；D. 显微镜下观察活力精子头部被包被物捕获的状况，并计数一定数量的活动精子和其中与包被物结合的活动精子个数；E.计算活力精子与透明质酸结合率，公式为活力精子与透明质酸结合率=与包被物结合的活动精子数/活动精子总数x100。/。。
6、 根据权利要求5所述的检测精子成熟度的方法，其特征在于所述步骤A中标本制备方法为取用液化的新鲜精液，或取用液氮超低温冻存的解冻精液；其中，新鲜精液液化方法为a. 等待新鲜精液在体外自然液化；若精液在体外60分钟后仍然不能完全自然液化时，则b. 在精液中加入培养液或商品化的精子洗涤液并以吸管反复吹打，促进精液完全液化；或c. 在精液中加入lmg/ml菠萝蛋白酶等蛋白水解酶，37°。孵育5~20分钟；所述步骤B中的载体为包被载片或者是表面置有或固定有包被的球体或圆柱体或锥体或立方体或不规则体的载片，将活力精子标本加样到包被的载片后盖上盖玻片；所述步骤D中，计数的活动精子总数大于或等于200个。
7、 权利要求1所述的透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的载体应用于分离成熟精子。
8、 一种分离成熟精子的方法，其特征在于，包括如下步骤A. 活力精子标本制备；B. 将活力精子标本加样到透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被载体内；C. 18-37度下反应5-120分钟，使成熟活力精子与包被物结合；D. 收集与包被物结合的精子。
9、根据权利要求8所述的分离成熟精子的方法，其特征在于所述步骤A中，样品制备包括以下步骤a、 采用液化的新鲜精液或采用液氮超低温冻存的解冻精液；其中，新鲜精液的液化方法为①等待新鲜精液在体外自然液化；若新鲜精液在体外60分钟后仍然不能完全液化时，则②在精液中加入培养液或商品化的精子洗涤液并以吸管反复吹打；③在精液中加入lmg/ml的菠萝蛋白酶等蛋白水解酶，37°C孵育5~20分钟；b、 以上泳法或密度梯度法收集高活力精子；c、 以培养液或商品化的精子洗涤液调整精子浓度至0.25~1.0xl06/ml;d、 在洁净的包被载体内预先加入培养液覆盖包被区域；或在载体包被区域内预先加入培养液滴或聚乙烯基吡咯烷酮液滴；其中，所述步骤b中上泳法收集高活力精子的步骤如下① 于试管底部加入精液lml，轻轻在试管精液上层加入1.5 ml培养液，其中4青液与培养液体积比值为1:1.5;② 轻轻将试管置于45度角倾斜试管架上，置37°C、 5%(:02培养箱中孵育1小时；③ 小心吸取最上层lml培养液； 500g离心5分钟；⑤ 吸走精子沉淀团上方的培养液；⑥ 加入0.2ml培养液。
10、根据权利要求8或9所述的分离成熟精子的方法，其特征在于所述步骤B中的载体为包被容器，或者是内部置有或固定有包被的球体或圆柱体或锥体或立方体或不规则体的容器；所述步骤B中的包被载体为无毒无热源型材质；所述步骤B中的将活力精子标本加样到包被载体内的方法，采用如下三种方法中的其中一种直接覆盖包被区域；或当在洁净的包#:载体内预先加入了培养液时，则加样到该培养液中；或当在载体包被区域内存在预先加入的培养液滴或聚乙烯基吡咯烷酮液滴时，则加样到上述液滴内；所述步骤D的收集与透明质酸结合的精子的方法为直接在显微镜下以细胞浆内精子注射用穿刺针或其他中空细管吸取与载体内包被区域结合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者小心倾倒去除未与包^^皮区域结合的精子并立即加入培养液或商品化的精子洗涤液；然后直接在显微镜下以细胞浆内精子注射用穿刺针或中空细管吸取与包被区域结合的活力精子，即得成熟的活力精子；或者小心倾倒去除未与载体内包被区域结合的精子后，立即在载体内加入培养液或商品化的精子洗涤液，并以吸管轻轻吹打透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被区域结合的精子，促进结合精子从结合表面分离，收集分离后的精子，即得到成熟的活力精子。
全文摘要
本发明公开一种包被载体及其在检测精子成熟度和无创分离成熟精子的方法中的应用。该包被载体为被透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物包被的载体。检测方法为标本制备；将标本加样到包被载体，盖上盖玻片；室温反应5-60分钟；显微镜下观察并计数；计算活力精子透明质酸结合率；分离方法为标本制备；将标本加样到包被载体内；18-37度下反应5-120分钟；收集结合的精子。采用上述包被载体，结果准确可靠、操作简单快捷，成本低、安全性能好。可用于评价精子质量、精子成熟度及男性不育病因学分析；并适用于辅助生殖或生殖研究中安全地收集成熟活力精子，从而实现较大程度改善胚胎质量的目的。
文档编号G01N33/544GK101487841SQ20091010543
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者瑜 刘 申请人:瑜 刘