专利名称：一种精子核蛋白组型转换半定量检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明属于体外诊断试剂类，具体适用于精子核蛋白组型转换的半定量检测。
背景技术：
人体的精原细胞核蛋白类型主要为富含赖氨酸残基组蛋白，在精子成熟过程中，与精核DNA结合的碱性蛋白发生组型转换，富含赖氨酸残基的组蛋白逐渐被富含精氨酸与胱氨酸残基的鱼精蛋白所取代，成熟的精子核蛋白类型主要是鱼精蛋白。
而蛋白组型转换缺陷或异常可引起男性不育或胚胎早期夭折流产，其机理为①使精子DNA不稳定，易受损伤而不能受孕；②一旦受精，由于核蛋白组型异常，精子核不能正常解聚，从而影响了雌雄原核的融合；③胚胎不能正常发育，造成胚胎夭折而流产。
精子核蛋白组型转换检测方法有两种，一种是提取核蛋白后电泳定量检测，另一种是利用与赖氨酸残基有亲和力的苯胺蓝染色检测，在酸性条件下，苯胺蓝与赖氨酸残基结合生成蓝色化合物，从而指示富含赖氨酸残基蛋白质的存在。前一方法操作复杂、对人员与设备的要求比较高，不适于临床常规开展；后一方法操作简单，但由于试剂配方不合理造成背景噪声大，特异性不强。
发明内容本发明的主要目的在于提供一种可洗去精液中的非特异性染色、背景噪声低、信噪比大、染色结果准确性、特异性好的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂及检测方法。
本发明的次一目的在于提供一种染色效果一致、便于临床常规应用推广的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂及检测方法。
本发明的次一目的在于提供一种检测结果重复性好、可实现批量化检测的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂及检测方法。
为实现上述目的，本发明提出一种精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，包括染色液、粘合液和洗脱液；所述洗脱液用于洗去精液染色后的非特异性染色；所述粘合液用于使精液易于粘合在载玻片上，免于洗脱。由于本发明提出的检测试剂检测的是不成熟精子的个数，而通常的定量检测精子核蛋白组型转换的试剂应该是检测含赖氨酸残基的组蛋白的绝对量，因此，本发明的检测试剂为精子核蛋白组型转换半定量检测的试剂。
还包括洗涤液，所述洗涤液用于洗去精子表面的粘稠部分。
还包括固定液，所述固定液用于使精子的蛋白质分子形成交联键而使之沉淀，易于染色，同时增加精液在载玻片上的粘合力。
还包括封固液，所述封固液用于使盖玻片与载玻片之间的结合牢固。
所述洗涤液为磷酸盐缓冲液；所述粘合液是含明胶的磷酸盐缓冲液；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液；所述洗脱液是含三羟甲基氨基甲烷的水溶液。
所述洗涤液的PH值为7.2～7.6；所述粘合液的PH值为7.2～7.6，所述粘合液中明胶的重量含量为0.02～0.1％；所述固定液中丙酮的体积含量为45％～50％、甲醇的体积含量为45％～50％、40％甲醛的体积含量为4％～6％；所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的重量含量为1～4％。
进一步的，还提出一种用精子核蛋白组型转换半定量检测试剂进行检测的方法，包括如下步骤1)在精液中加入粘合液，并涂于载玻片上的的染色窗中，使得精液易于粘合在载玻片上；2)在步骤1)所述的精液中加入染色液，对精液进行染色；3)对步骤2)所述的精液进行封片，计数一定个数的精子中头部染蓝色的精子百分率。由于本发明提出的检测方法检测的是不成熟精子的个数，而通常的定量检测精子核蛋白组型转换的方法应该是检测含赖氨酸残基的组蛋白的绝对量，因此，本发明的检测方法为精子核蛋白组型转换半定量检测的方法。
所述步骤1)之前还包括如下步骤用洗涤液洗去精液中精子表面的粘稠部分；在所述步骤1)之后、步骤2)之前还包括如下步骤在精液中加入固定液，使精液中的蛋白质变性，同时增加精液在载玻片上的粘合力；所述步骤2)之后、步骤3)之前还包括如下步骤在精液中加入封固液，用于增加载玻片与盖玻片之间的粘合力。
所述载玻片上有至少一个染色窗，且每个染色窗的大小相同，边界为耐酸、疏水性涂料。
由于上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于1、由于采用洗脱液，将染色完毕的精液中的非特异性染色洗去，只保留特异性染色的物质(染色后的赖氨酸残基)，背景噪声对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，同时结果的准确性、特异性也大大提高了；2、由于调整精子的浓度一定，即在载玻片上的染色窗中的精子密度是一定的，而最终的染色效果是受染色窗中的精子密度影响的，一个载玻片上有若干个染色窗，每个染色窗内精子密度一定，则所有染色窗的染色效果一致，可以同时读取多组数据，便于试验人员的经验积累，也便于临床常规应用的推广；3、由于在一个载玻片上有若干个染色窗，各染色窗中的操作一致，精子密度一定，染色效果一致，从而规范了方法学，可以同时进行多个精子核蛋白组型转换的半定量检测，检测结果重复性好，并可实现批量化检测。
具体实施方式下面通过具体的实施例并结合附图
对本发明作进一步详细的描述。
实施例，一种精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，包括染色液、洗涤液、粘合液、固定液、洗脱液和封固液；由于本发明提出的检测试剂检测的是不成熟精子的个数，而通常的定量检测精子核蛋白组型转换的试剂应该是检测含赖氨酸残基的组蛋白的绝对量，因此，本发明的检测试剂为精子核蛋白组型转换半定量检测的试剂；其中洗涤液用于洗去精子表面的粘稠部分，所述洗涤液在本发明中采用pH7.4的磷酸盐(PBN)缓冲液，所述洗涤液是1000ml蒸馏水中含有磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、十二水磷酸氢钠(Na2HPO4·12H2O)5.8g、叠氮钠(NaN3)0.5g；所述洗涤液中KH2PO4的重量含量为0.03～0.06％、Na2HPO4·12H2O的重量含量为0.4～0.7％、NaN3的重量含量为0.01～0.1％，所述KH2PO4、Na2HPO4·12H2O还可以用别的PBN替换，NaN3还可以用其他的防腐剂替换，而且PBN与防腐剂的含量还可以为其他值，只要能够保证洗涤液的pH值为7.2～7，含量的多少基本不会影响洗涤液用于洗去精子表面的粘稠部分的作用；本发明中的洗涤液还可以用其他可以洗去精子表面的粘稠部分的物质替换。
粘合液使得精液易于粘合在载玻片上，免于被洗脱；所述粘合液在本发明中采用含明胶的PBN缓冲液，所述粘合液在本发明中是1000毫升pH7.4的PBN缓冲液中含有明胶0.5g；所述粘合液中明胶的重量含量为0.02～0.1％，明胶的含量低于0.02％时，精液粘合力不强，容易洗脱，明胶的含量高于0.1％时，染色后的非特异性染色过多，背景噪声过大，使得检测结果的准确性变差；本发明的粘合液还可以用其他能够使精液粘合在载玻片上的物体替换。
固定液使得精子的蛋白质分子形成交联键而使之沉淀，易于染色液的染色，同时还可以增加精液在载玻片上的粘合力；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液，所述固定液中丙酮的体积含量为45％、甲醇的体积含量为45％、40％甲醛的体积含量为5％，丙酮的体积含量还可以在45％～50％之间，甲醇的体积含量还可以在45％～50％之间，40％甲醛的体积含量还可以在5％4％～6％之间，丙酮、甲醇、40％甲醛的体积含量还可以为其它数值，对于精子中蛋白质分子形成交联键从而使之沉淀不会有太大影响；本发明中的固定液还可以用其他能够使精液中的蛋白质变性的物质替换。
本发明所采用的染色液是苯胺蓝的重量含量为1.5％、冰醋酸的体积含量为4％的水溶液，所述苯胺蓝的重量含量还可以在0.4～2％之间、冰醋酸的体积含量还可以在1～5％之间，所述染色液还可以用现有的对精子核蛋白组型转换检测所采用的常见的染色液替换。
洗脱液用于将染色后的非特异性染色物质洗去(苯胺蓝与赖氨酸残基结合后的物质为特异性染色的物质，除了特异性染色的物质，在整个检测过程中其他会与染色液进行反应生成的染色物质通称为非特异性染色物质)，使得检测结果特异性好；所述洗脱液在本发明中采用含有Tris、NaCl的水溶液，所述洗脱液中Tris的重量含量为2％、NaCl的重量含量为0.8％，所述洗脱液中Tris的重量含量还可以在1～4％之间、NaCl的重量含量还可以在0.5～2％之间，Tris、NaCl的含量超过给定范围会使得洗脱不完全，从而背景噪声过大，检测结果不准确；本发明封固液用于使检测过程中载玻片与盖玻片之间粘合牢固，精液不会随意移动，干扰试验人员对数据的读取，使得检测结果的准确性大大增强，特异性好；所述封固液可以为甘油或液体石蜡等常见的封固液。
上述精子核蛋白组型转换半定量检测试剂的制作工艺方法A、洗涤液的制作工艺方法1)称取KH2PO40.5g、Na2HPO4·12H2O 5.8g、NaN30.5g置烧杯，加蒸馏水至900ml，搅拌溶解；或者称取KH2PO40.3～0.6g g、Na2HPO4·12H2O 4～7g、NaN30.1～1.0g置烧杯，加蒸馏水至900ml，搅拌溶解。
2)调pH至7.4，加蒸馏水至1000ml，4℃保存；或者将溶液的调pH调至7.2～7.6。
B、粘合液的制作工艺方法3)称取明胶0.2～1g，置烧杯，加洗涤液400毫升，置60℃水浴搅拌溶解。
4)用洗涤液定容至1000毫升，置4℃保存。
C、固定液的制作工艺方法5)取丙酮90毫升、甲醇90、40％甲醛10毫升，混匀后室温保存；或者取丙酮90～100毫升、甲醇90～100毫升、40％甲醛8～12毫升，混匀后室温保存D、染色液的制作工艺方法6)取冰醋酸3毫升，加蒸馏水至100毫升，调pH至3.5；或者取冰醋酸1～5毫升，加蒸馏水至100毫升，调pH至3.3～3.7。
7)加入苯胺蓝1.5克，搅拌溶解后过滤，置4℃保存；或者加入苯胺蓝0.4～2克，搅拌溶解后过滤，置4℃保存。
E、洗脱液的制作工艺方法
8)称取Tris 2g、NaCl 0.8g，溶于80毫升蒸馏水中，搅拌溶解；或者称取Tris 1～4g、NaCl 0.5～2g，溶于80毫升蒸馏水中，搅拌溶解，9)用1mol/LHCl调pH至7.6，用蒸馏水定容至100毫升，置4℃保存；或者用1mol/LHCl调pH至7.4～7.8，用蒸馏水定容至100毫升。置4℃保存F、封固液的制作工艺方法10)取市售纯甘油(AR)，置室温保存；其中AR表示甘油的纯度为分析纯，还可以用化学纯等纯度的甘油或者液化石腊等其他的封固液替换。
根据需要，可将上述精子核蛋白组型转换半定量检测试剂制作成试剂盒，其中浓缩洗涤液(10×)0.3～0.5ml、粘合液0.5～1.5ml、固定液50～150ul、染色液50～150ul、浓缩洗脱液(5×)10～50ml、封固液40～60ul。
上述试剂盒的优选方案是浓缩洗涤液(10×)0.4ml、粘合液0.1ml、固定液100ul、染色液100ul、浓缩洗脱液(5×)20ml、封固液50ul。
试验例，由于本发明提出的检测方法检测的是不成熟精子的个数，而通常的定量检测精子核蛋白组型转换的方法应该是检测含赖氨酸残基的组蛋白的绝对量，因此，本发明的检测方法为精子核蛋白组型转换半定量检测的方法；用精子核蛋白组型转换半定量检测试剂对精子核蛋白组型转换进行半定量检测的具体步骤如下一、样本准备新鲜液化精液，或-20℃贮存精液标本。
二、试剂准备1、洗涤应用液配制以蒸馏水10倍稀释浓缩洗涤液，4℃贮存。
2、洗脱应用液配制以蒸馏水5倍稀释浓缩洗脱液，4℃贮存。
三、操作步骤1、精液液化并计数，以洗涤液调整精子浓度至40×106/ml；在计数及调节精子浓度之前务必将精液充分混匀，防止精子分布不均，造成精子浓度计数误差过大，精子数量过多容易发生重叠，不利于脱色及结果观察；采用40×106/ml浓度的精子，在0.6cm染色窗内的精子染色强度好；由于最后精子的染色效果受载玻片上染色窗内精子密度的影响，不同数量精子染色后脱色时间差异较大，为保证检测结果的准确性和良好的重复性，在保证一定面积的染色窗内精子数目一定的前提下，不同浓度的精子也会有相似的染色效果，因此，洗涤液对精子浓度的调整也可以调整到其他的浓度；2、取上述调整后的精液1ml，加于Eppendorf管内，1000g离心10min，由于精浆会粘附在玻片上干扰染色，因此去精浆，其中离心的时间只要可以充分分离精浆即可；3、在上述去精浆后的精液中加1ml洗涤液，充分混匀。1000g离心3分钟，由于上清液中含有洗涤液和精浆，因此去上清液，为了要达到精浆除掉至不干扰染色效果为止，需要反复多次采用离心弃上清液的方式进行洗涤，洗涤次数不限，一般在实际试验操作中洗涤3次即可；在精子洗涤过程中可能由于以下原因导致精子过度丢失①相对离心力偏小(计算公式RCF＝(r/min)2×R(cm)×1.118×10-6)；②离心时间过短；③去上清液时不慎将精子沉淀物一并吸弃；4、精液最后一次离心弃上清液后，加1ml粘合液，其中弃上清液要求尽量吸去上层液体、保留下层精子；5、取5ul上述精液涂片，涂片范围必须满布玻片染色窗，空气干燥；涂片前精子悬液必须充分混匀，涂片时应将精子悬液均匀分布于整个染色窗，精子涂片后应水平放置待干，以免悬液倾向一侧造成局部精子过于重叠，导致脱色不均匀；而且玻片洁净度要求很高，最好采用试剂盒配套载玻片，载玻片从冷藏冰箱取出后应平衡至温室后方可开封，并将载玻片置室温长期密封保存，小心勿与载玻片接触，以免污染涂片区；6、加固定液充分固定上述染色窗内的精液，固定的时间要避免精子在染色及洗脱过程中在玻片上脱落，否则会无法在未染色前观察效果，一般在实际试验操作中需要固定90秒，甩去固定液；7、载玻片以自来水轻轻冲洗7次，每次1秒钟，其中冲洗的次数、时间、程度不限于轻轻冲洗7次，每次1秒，而以能够洗净固定液为准；甩去玻片表面积水，加染液覆盖涂片区，染色5min，其中染色时间不限于5秒钟，只需充分染色即可；8、以自来水缓缓冲洗染色后的精液7次，每次1秒钟，其中冲洗的次数、时间不限于冲洗7次，每次1秒钟，而以洗净载玻片上染色窗中未与精子或其他细胞结合的染料为准，以自来水洗涤组织片时，要求水流较缓，且不可正对涂片区域冲洗，若所用自来水水质较差，应使用蒸馏水代替自来水；然后将组织片浸泡至洗脱液中准确脱色18～20min，或至组织片无明显蓝色为止，其中脱色时间必须严格加以控制，时间过长，弱阳性精子过度脱色造成结果假阴性，而脱色时间过短，组织片背景噪声过高结果难以判断；立即甩去脱色液，以自来水快速洗涤7次，洗涤的次数、时间不重要，但脱色完毕后应立即以自来水洗去组织片表面洗脱液，以免脱色时间继续延长；9、甩去组织片表面附着积水，迅速吹干或晾干，由于自来水也有脱色作用，因此以自来水迅速冲洗脱液后，应尽量甩去玻片表面积水，然后将玻片竖起，迅速吹干或晾干，以免自来水在组织片滞留时间过长而继续脱色；10、封片于载玻片检测区域加封固液1滴，当同时对一块载玻片上的若干个染色窗中的精液进行检测时，在各染色窗中各加封固液1滴后以盖片封片，载玻片若不加封固液而直接进行观察，精子会皱缩且背景有噪音干扰，加封固液封片是为了获得色彩鲜艳、对比清晰的观察效果，但封片时间过长(＞6小时)结果有差异，为满足延后观察时间要求，可在临观察前6小时内再加封固液封片；油镜计数200个精子，计数个数不限，主要是保证固定大小的染色窗中的精子数目一定，便于各染色窗中精液染色效果的一致即可，其中镜下结果观察，应选择组织片中央精子分布均匀区域计数，由于精子悬液未充分混匀或分布不均，造成局部精子叠加而不易脱色，因此若出现成团精子染成蓝色，则不应将其作为阳性精子计数；不成熟精子头部呈蓝色，精子核呈明显蓝色为强阳性，精子不染色或极淡蓝色为阴性，由于精子核蛋白存在组蛋白-鱼精蛋白过渡期，因此少数精子染色较浅，染色程度超过组织片中或正常对照精子的阴性精子平均底色2倍者，可计数为阳性精子，精子核局部染蓝色亦应判为阳性；计算头部着色精子百分率，头部着色精子的百分率与精子核蛋白组型转换之间是对应关系，即头部着蓝色精子就是核蛋白组型转换不成熟精子。
四、正常参考值头部染蓝色精子≤30％五、临床适用性可作为评价男性精液质量的一种可靠指标。
权利要求
1.一种精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，包括染色液，其特征是，还包括粘合液和洗脱液；所述洗脱液用于洗去精液染色后的非特异性染色；所述粘合液用于使精液易于粘合在载玻片上，免于洗脱。
2.如权利要求1所述的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，其特征在于还包括洗涤液，所述洗涤液用于洗去精子表面的粘稠部分的。
3.如权利要求2所述的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，其特征在于还包括固定液，所述固定液用于使精子的蛋白质分子形成交联键而使之沉淀，易于染色，同时增加精液在载玻片上的粘合力。
4.如权利要求3所述的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，其特征在于还包括封固液，所述封固液用于使盖玻片与载玻片之间的结合牢固。
5.如权利要求4所述的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，其特征在于所述洗涤液为磷酸盐缓冲液；所述粘合液是含明胶的磷酸盐缓冲液；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液；所述洗脱液是含三羟甲基氨基甲烷的水溶液。
6.如权利要求5所述的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，其特征在于所述洗涤液的PH值为7.2～7.6；所述粘合液的PH值为7.2～7.6，所述粘合液中明胶的重量含量为0.02～0.1％；所述固定液中丙酮的体积含量为45％～50％、甲醇的体积含量为45％～50％、40％甲醛的体积含量为4％～6％；所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的重量含量为1～4％。
7.一种用如权利要求1所述的精子核蛋白组型转换半定量检测试剂进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤1)在精液中加入粘合液，并涂于载玻片上的的染色窗中，使得精液易于粘合在载玻片上；2)在步骤1)所述的精液中加入染色液，对精液进行染色；3)对步骤2)所述的精液进行封片，计数一定个数的精子中头部染蓝色的精子百分率。
8.如权利要求7所述的用精子核蛋白组型转换半定量检测试剂进行检测的方法，其特征在于，所述步骤1)之前还包括如下步骤用洗涤液洗去精液中精子表面的粘稠部分；在所述步骤1)之后、步骤2)之前还包括如下步骤在精液中加入固定液，使精子的蛋白质分子形成交联键而使之沉淀，同时增加精液在载玻片上的粘合力；所述步骤2)之后、步骤3)之前还包括如下步骤在精液中加入封固液，用于增加载玻片与盖玻片之间的粘合力。
9.如权利要求8所述的用精子核蛋白组型转换半定量检测试剂进行检测的方法，其特征在于，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的PH值为7.2～7.6；所述粘合液是含明胶的磷酸盐缓冲液，所述粘合液中明胶的重量含量为0.02～0.1％；所述固定液是丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液，所述固定液中丙酮的体积含量为45％～50％、甲醇的体积含量为45％～50％、40％甲醛的体积含量为4％～6％；所述洗脱液是含三羟甲基氨基甲烷的水溶液，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的重量含量为1～4％。
10.如权利要求7-9其中之一所述的用精子核蛋白组型转换半定量检测试剂进行检测的方法，其特征在于所述载玻片上有至少一个染色窗，且每个染色窗的大小相同，边界为耐酸、疏水性涂料。
全文摘要
本发明公开一种精子核蛋白组型转换半定量检测试剂，包括染色液、粘合液和洗脱液；所述洗脱液用于洗去精液染色后的非特异性染色；所述粘合液用于使精液易于粘合在载玻片上，免于洗脱。进一步的，还提出一种用精子核蛋白组型转换半定量检测的方法，包括如下步骤1)在精液中加入粘合液，并涂于载玻片上的的染色窗中，使得精液易于粘合在载玻片上；2)在步骤1)所述的精液中加入染色液，对精液进行染色；3)对步骤2)所述的精液进行封片，计数一定个数的精子中头部染蓝色的精子百分率。由于采用洗脱液，将染色完毕的精液中的非特异性染色洗去，只保留特异性染色的物质，背景噪声对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，结果准确、特异。
文档编号G01N1/28GK1746658SQ20041004066
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月8日 优先权日2004年9月8日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司