专利名称：：一种固定含氨基化合物的活性载体及其固定方法
技术领域：
：本发明属于含氨基化合物在固相材料表面的固定
技术领域：
，特别是氨基酸或蛋白质在固相材料表面的固定，尤其是将抗原或抗体固定在固相载体，通过特异性免疫反应，进行痕量检测的免疫分析领域。
背景技术：
：免疫分析诊断技术具有灵敏度高，特异性强，标记物稳定等特点外，其检测程序亦简便、快速，只需微量标本，近年来已应用于检测各种激素，肿瘤标志物，药物及其它微量生物活性物质，亦可用于细菌和病毒感染的快速诊断。在目前应用的免疫分析诊断技术中，载体是以聚苯乙烯为主要原料制成的实心珠、管状物、96孔板等，检测的抗体或者抗原通过物理吸附的方式附着在载体表面，在吸附过程中，抗体或者抗原需要比较高的浓度(一般为10iig/mL)，而这种方式的缺点是1.浪费了宝贵的抗体或者抗原，尤其是有的抗体或者抗原价格很贵，造成诊断成本的提高。(因为真正吸附在载体表面的抗体或者抗原只有10%左右)。2.由于抗体或者抗原是吸附在载体表面，随着时间的推移，抗体或者抗原会从载体的表面脱落，因而影响检测结果的可靠性。3.由于抗体或者抗原是吸附在载体表面，使得同批次的均一性差。
发明内容为解决上述现有技术中出现的问题，本发明提供一种固定含氨基化合物的活性载体及其固定方法。该活性载体带有磺酰氯基团，能够与氨基在温和的条件下反应，特别是与含有氨基的具有生物活性的物质如氨基酸、蛋白质、抗原、单克隆抗体、第二抗体、多克隆抗体以及核苷酸等反应。本发明提供的一种固定含氨基化合物的活性载体及其固定方法可用于放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、时间分辨免疫分析、聚合酶链反应、基因工程或多肽的固相合成。其具体技术方案是以具有芳香环的高分子聚合物为固相材料，通过化学方法，即一步法或两步法反应得到带有功能性基团磺酰氯的活性载体，然后通过磺酰氯基团与含有氨基的目标化合物在碱性水溶液中反应，使含有氨基的目标化合物以化学键的形式固定在固相材料表面上。所述的固相材料为用聚苯乙烯制成的实心珠、管状物或者96孔板。—步法的具体步骤为A.以400-800体积份的甲苯为溶剂，80-250体积份的氯磺酸为磺化剂，20-250重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.10-6(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中4.0-12.0小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。4两步法的具体步骤为以400-800体积份的甲苯为溶剂，与80-250体积份的浓硫酸混合均匀后，10-6(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应4.0-12.0小时；向混合液中再加入20-250重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应4.0_12.O小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；所述重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。—步法优选条件一A.以640体积份的甲苯为溶剂，210体积份的氯磺酸为磺化剂，80重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.6(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中6小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；—步法优选条件二A.以780体积份的甲苯为溶剂，160体积份的氯磺酸为磺化剂，220重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.3(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中10.5小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；两步法优选条件一以420体积份的甲苯为溶剂，与230体积份的浓硫酸混合均匀后，3(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应4.5小时；向混合液中再加入180重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应10小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；两步法优选条件二以720体积份的甲苯为溶剂，与90体积份的浓硫酸混合均匀后，2(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应11小时；向混合液中再加入80重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应5小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。所述的含有氨基的目标化合物为无生物活性或者有生物活性的化合物，无生物活性的化合物为C4—18的脂肪族胺或芳香族胺，包括乙二胺、十八胺、苯胺、苄胺，有生物活性的化合物包括氨基酸、蛋白质、抗原、单克隆抗体、第二抗体、多克隆抗体或核苷酸。磺酰氯基团与氨基酸或蛋白质的偶联反应条件为ra值在4-10的水溶液体系，优选ra值在6-9的水溶液体系。本发明提供的一种以化学键的方式固定含氨基化合物的活性载体及其固定方法，其优点有1、节约原料(在免疫分析中经过试验，固定抗体或抗原可节省80%);2、因为是通过化学键连接在一体的，所以具有生物活性的物质不会从载体的表面脱落，稳定性好(只要不失去生物活性，就可以使用)；3、均一性好(将物理吸附变成定量的化学反应)；4、活性载体制作过程简单，费用低。下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，而不是限制本发明的范围。具体实施方式实施例1:在三角瓶中加入氯磺酸160mL，氯化锌40g，甲苯640mL，混匀；将96孔板放入其中，3(TC反应10.5小时；取出96孔板用水冲洗，再用丙酮洗剂，5(TC烘干，密封保存。实施例2:在三角瓶中加入氯磺酸85mL，三氯氧磷80g，甲苯450mL，混匀；将96孔板放入其中，4(TC反应7.5小时；取出96孔板用水冲洗，再用丙酮洗剂，6(TC烘干，密封保存。实施例3:在三角瓶中加入氯磺酸95mL，氯化锌160g，甲苯520mL，混匀；将96孔板放入其中，6(TC反应6小时；取出96孔板用水冲洗，再用丙酮洗剂，4(TC烘干，密封保存。实施例4:在三角瓶中加入氯磺酸105mL，三氯氧磷30g，甲苯640mL，混匀；将直径0.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，55t:反应4.5小时；取出聚苯乙烯珠用水冲洗，再用丙酮洗剂，6(TC烘干，密封保存。实施例5:在三角瓶中加入氯磺酸185mL，氯化锌80g，甲苯600mL，混匀；将直径0.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，45t:反应5.5小时；取出聚苯乙烯珠用水冲洗，再用丙酮洗剂，3(TC烘干，密封保存。实施例6:在三角瓶中加入氯磺酸235mL，三氯氧磷220g，甲苯720mL，混匀；将直径0.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，35t:反应7小时；取出聚苯乙烯珠用水冲洗，再用丙酮洗剂，6(TC烘干，密封保存。实施例7:在三角瓶中加入氯磺酸125mL，氯化锌220g，甲苯750mL，混匀；将直径0.5cm的聚苯乙烯管放入其中，25t:反应9.5小时；取出聚苯乙烯管用水冲洗，再用丙酮洗剂，55t:烘干，密封保存。实施例8:在三角瓶中加入氯磺酸210mL，氯化锌240g，甲苯780mL，混匀；将直径0.5cm的聚苯乙烯管放入其中，15t:反应11小时；取出聚苯乙烯管用水冲洗，再用丙酮洗剂，45t:烘干，密封保存。实施例9:在三角瓶中加入浓硫酸90mL，甲苯420mL，混匀；将直径0.5cm的聚苯乙烯管放入其中，2(TC反应11.0小时；向混合液中再加入180g的氯化亚砜继续反应5.0小时；取出聚苯乙烯管用水冲洗，再用丙酮洗剂，50°C烘干，密封保存。实施例10:在三角瓶中加入浓硫酸180mL，甲苯520mL，混匀；将直径O.5cm的聚苯乙烯珠放入其中，35t:反应8小时；向混合液中再加入80g的三氯化铝继续反应9.5小时；取出聚苯乙烯珠用水冲洗，再用丙酮洗剂，3(TC烘干，密封保存。实施例11:在三角瓶中加入浓硫酸230mL，甲苯720mL，混匀；将96孔板放入其中，55。C反应4.5小时；向混合液中再加入180g的三氯化铝继续反应10小时；取出96孔板用水冲洗，再用丙酮洗剂，60°C烘干，密封保存。实施例12:将15mgC-肽(C_P)抗体加入到3000mL0.1MpH为8.7-8.8的碳酸氢钠的水溶液中，搅棒混匀；向制备实施例2制得的含磺酰氯基团的活性96孔板的每孔加入100iU浓度为5iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小时。向0.01MpH为7.4的3000ml磷酸盐缓冲液中加入蔗糖90g，BSA12g，混匀；每孔加110iU，37t:温浴45分钟；用洗板机洗孔1次，在纸抹布上轻轻拍干。将包被板放在风干机中风干1小时，即可得到化学偶联的C-肽(C-P)抗体包被的活性载体板。实施例13:将制备实施例5所得到的100颗活性载体，加入到2000mL甲胎蛋白(AFP)抗体浓度为10yg/mL、pH为8.7-8.8的0.1M的碳酸氢钠的水溶液中，室温搅拌12小时。向0.OIMpH为7.4的1000ml磷酸盐缓冲液中加入蔗糖30g，BSA4g，混匀；将连接好的活性载体加入其中，37t:温浴45分钟。将连接好的活性载体放在风干机中风干1小时，即可得到化学偶联的甲胎蛋白(AFP)抗体包被的活性载体珠。实施例14:将制备实施例6所得到的100颗活性载体，加入到2000mL人促甲状腺素(hTSH)抗体浓度为10yg/mL、pH为8.7-8.8的0.1M的碳酸氢钠的水溶液中，室温搅拌12小时。向0.01MpH为7.4的1000ml磷酸盐缓冲液中加入蔗糖30g，BSA4g，混匀；将连接好的活性载体加入其中，37t:温浴45分钟。将连接好的活性载体放在风干机中风干1小时，即可得到化学偶联的人促甲状腺素(hTSH)抗体包被的活性载体珠。实施例15:将15mg癌胚抗原(CEA)抗体加入到3000mL0.1MpH为8.7-8.8的碳酸氢钠的水溶液中，搅棒混匀；向制备实施例11制得的含磺酰氯基团的活性96孔板的每孔加入100ii1浓度为5iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小时。向0.01MpH为7.4的3000ml磷酸盐缓冲液中加入蔗糖90g，BSA12g，混匀；每孔加110iU，37t:温浴45分钟；用洗板机洗孔1次，在纸抹布上轻轻拍干。将包被板放在风干机中风干1小时，即可得到化学偶联的癌胚抗原(CEA)抗体包被的活性载体板。免疫分析的效果实验前列腺特异抗原(prostatespecificantigen,PSA)是与前列腺癌(PC)相关的一种抗原。它是公认的诊断PC的较好的肿瘤标志物。PC在男性所有类型癌中占10%20%，是男性最常见的癌肿。该病进展缓慢，是威胁50岁以上男性生命的主要癌症，在西方国家占男性死亡率的第二位，目前我国前列腺癌的发病率也急剧增加。PSA是一种仅由前列腺上皮细胞分泌的糖蛋白，相对分子量为33kD，有独特的组织特异性，患PC时，血清中PSA升高。PSA被公认是90年代诊断PC不可缺少的肿瘤标志物，配合直肠指诊或超声波检查，可明显提高PC诊断的阳性率。前列腺特异抗原包被板制备1、物理吸附的普通板的包被将25mg前列腺特异抗原抗体加入到2500mL0.1MpH为8.7-8.8的碳酸氢钠的水溶液中，搅棒混匀；向96孔物理吸附的普通板的每孔加入100ill浓度为10iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小时。向0.01MpH为7.4的3000ml磷酸盐缓冲液中加入蔗糖90g，BSA12g，混匀；每孔加110iU，37t:温浴45分钟；用洗板机洗孔1次，在纸抹布上轻轻拍干；将包被板放在风干机中风干1小时，即可得到物理吸附的前列腺特异抗原包被的普通板Plate-l.2、含磺酰氯基团的活性载体的包被将15mg前列腺特异抗原抗体加入到3000mL0.1MpH为8.7_8.8的碳酸氢钠的水溶液中，搅棒混匀；向制备实施例1制得的含磺酰氯基团的活性96孔板的每孔加入100iU浓度为5iig/mL的包被液，放入2-8t:冰箱冷藏放置24小时。向0.01MpH为7.4的3000ml磷酸盐缓冲液中加入蔗糖90g，BSA12g，混匀；每孔加110iU，37t:温浴45分钟；用洗板机洗孔1次，在纸抹布上轻轻拍干。将包被板放在风干机中风干1小时，即可得到化学偶联的前列腺特异抗原包被的活性载体板Plate-2.两种不同板子的对照实验操作按照北京市福瑞生物工程公司前列腺特异抗原化学发光免疫测定试剂盒使用说明书进行。结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一种固定含氨基化合物的活性载体，其特征在于该活性载体是带有功能性基团磺酰氯的具有芳香环的高分子聚合物的固相材料。2.—种含氨基化合物的固定方法，其特征在于该方法为以具有芳香环的高分子聚合物为固相材料，通过化学方法，即一步法或两步法反应得到带有功能性基团磺酰氯的活性载体，然后通过磺酰氯基团与含有氨基的目标化合物在碱性水溶液中反应，使含有氨基的目标化合物以化学键的形式固定在固相材料表面上。3.根据权利要求1所述的一种固定含氨基化合物的活性载体，其特征在于，所述的固相材料为用聚苯乙烯制成的实心珠、管状物或者96孔板。4.根据权利要求1或3所述的一种固定含氨基化合物的活性载体的制备方法，其特征在于该方法为一步法或两步法反应所述的一步法具体步骤为A.以400-800体积份的甲苯为溶剂，80-250体积份的氯磺酸为磺化剂，20-250重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.10-6(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中4.0-12.0小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；所述的两步法的具体步骤为以400-800体积份的甲苯为溶剂，与80-250体积份的浓硫酸混合均匀后，10-6(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应4.0-12.0小时；向混合液中再加入20-250重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应4.0-12.0小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。5.根据权利要求4所述的一种固定含氨基化合物的活性载体的制备方法，其特征在于该方法中所述的一步法或两步法具体步骤为所述的一步法具体步骤为A.以640体积份的甲苯为溶剂，210体积份的氯磺酸为磺化剂，80重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.6(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中6小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；所述的两步法的具体步骤为以420体积份的甲苯为溶剂，与230体积份的浓硫酸混合均匀后，3(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应4.5小时；向混合液中再加入180重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应10小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。6.根据权利要求2所述的一种含氨基化合物的固定方法，其特征在于该方法中所述的固相材料为用聚苯乙烯制成的实心珠、管状物或者96孔板；所述的一步法或两步法具体步骤为A.以400-800体积份的甲苯为溶剂，80-250体积份的氯磺酸为磺化剂，20-250重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.10-6(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中4.0-12.0小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；所述的两步法的具体步骤为以400-800体积份的甲苯为溶剂，与80-250体积份的浓硫酸混合均匀后，10-6(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应4.0-12.0小时；向混合液中再加入20-250重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应4.0-12.0小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；重量份与体积份的关系为g/ml或kg/l。7.根据权利要求6所述的一种含氨基化合物的固定方法，其特征在于该方法中所述的一步法或两步法具体步骤为所述的一步法具体步骤为A.以780体积份的甲苯为溶剂，160体积份的氯磺酸为磺化剂，220重量份的三氯氧磷或者氯化锌为催化剂，将上述试剂混合均匀；B.3(TC条件下，将固相材料浸泡于步骤A配制的混合液中10.5小时，用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；所述的两步法的具体步骤为以720体积份的甲苯为溶剂，与90体积份的浓硫酸混合均匀后，2(TC条件下，将固相材料浸泡在甲苯与浓硫酸的混合液中反应11小时；向混合液中再加入80重量份的氯化亚砜或者三氯化铝继续反应5小时；用水冲洗固体表面，再用丙酮洗涤，干燥即可；重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。8.根据权利要求2、6或7所述的一种含氨基化合物的固定方法，其特征在于，所述的含有氨基的目标化合物为无生物活性或者有生物活性的化合物，无生物活性的化合物为C4—18的脂肪族胺或芳香族胺，包括乙二胺、十八胺、苯胺、苄胺，有生物活性的化合物包括氨基酸、蛋白质、抗原、单克隆抗体、第二抗体、多克隆抗体或核苷酸。9.根据权利要求2、6、7或8所述的一种含氨基化合物的固定方法，其特征在于，磺酰氯基团与氨基酸或蛋白质的偶联反应条件为ra值在4-i0的水溶液体系；条件优选ra值在6-9的水溶液体系。10.根据权利要求1或3所述的一种固定含氨基化合物的活性载体，其特征在于该活性载体在放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、时间分辨免疫分析、聚合酶链反应、基因工程或多肽的固相合成中的应用。全文摘要本发明公开了一种固定含氨基化合物的活性载体及其固定方法，特别是氨基酸或蛋白质在固相材料表面的固定方法。该方法是以具有芳香环的高分子聚合物为固体材料，通过化学方法，使其带有功能性基团磺酰氯，通过磺酰氯与含有氨基的目标物反应，使目标物以化学键的形式固定在固体聚合物表面上。该活性载体制作过程简单、费用低，该固定方法节约原料，稳定性好，均一性好，可用于放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析和时间分辨免疫分析、聚合酶链反应、基因工程和多肽的固相合成等领域。文档编号G01N33/545GK101776686SQ20091021755公开日2010年7月14日申请日期2009年12月31日优先权日2009年12月31日发明者仲伟强,沙栩正申请人:沙栩正;仲伟强