专利名称：活体化学诱导鱼类雌核发育方法
技术领域：
人工诱导鱼类雌核发育是由遗传失活的精子启动发育程序，并采用物理或化学方法在体外使雌核染色体加倍成二倍体卵子，最终产生全雌性的子代。它属于鱼类细胞工程育种的技术领域，具体涉及一种活体化学诱变育种的方法。
背景技术：
人工诱导鱼类雌核发育技术包括精子遗传失活和雌核二倍体的诱导。采用x射线、r射线或紫外线辐照处理可使鱼类精子失活，一些化学剂如甲基胺蓝(toluidineblue)、二甲基硫酸盐(dimethylsufate)以及乙烯脲(ethylneurea)等也可以使精子遗传失活。用遗传失活的精子在体外激活卵子发育，然后再使用物理的或化学方法抑制卵子的第二次减数分裂或者抑制第一次有丝分裂，可以产生雌核二倍体。这些物理、化学方法包括低温休克、热休克、静水压力、秋水仙碱、细胞松驰素-B等。自从前苏联科学家(Neyfakh，1956，Golovinskaya and Romashov，1958；Romashov et al 1960)应用r射线处理泥鳅和鲤鱼精子，然后用遗传失活精子激动泥鳅和鲤鱼卵子，获得了雌核发育二倍体泥鳅和鲤鱼以来，已有几十种鱼人工诱导雌核发育获得成功的报道。但是用物理或化学的方法使染色体加倍的雌核发育鱼达到性成熟年龄时的成活率很低(10-20％)，而且大约有80％的性腺不能正常发育。日本Y.Fujioka报道冷休克处理诱导一种颔须鲫鱼类(Gnathopogon caerulescens)在鱼苗孵化后130天雌核发育幼鱼存活率大约为33％，其中有69％性腺发育良好，这是迄今见到的最好的结果。这主要是由于物理或化学的方法人工加倍时使染色体断裂或小片段的丢失导致非整倍体的产生。因此人工雌核发育技术的关键是尽可能的减轻雌核二倍化的损伤，从而提高雌核发育鱼的成活率与性腺正常发育的百分率。
几十年来，国内外关于人工诱导鱼类雌核发育的报道，均是致力于提高雌核二倍化的百分率，一般二倍体出现率在20％左右，个别的高达80％以上，但雌核发育鱼的成活率与性腺发育成熟的百分率不高，其原因是复杂的，除了与各种鱼的遗传背景、卵子成熟度有关外，在体外采用物理或化学处理阻断第二极体的排出，对受精卵子的染色体与细胞质的损伤是十分剧烈的，甚至是致命的不可修复的损伤，尽管雌核二倍体出现率甚至可以高达100％，但能够正常发育的雌核发育二倍体仍然不多。吴清江等(于1981年)用r射线照射过的精液激活鲤鱼卵子发育至2细胞期时以25ppm的秋水仙碱溶液浸泡30分钟，二倍体雌核发育可以从原来的1.35％提高到31.6％，至于雌核发育鱼的成活率与性腺发育是否正常没有进一步观察比较。吴清江采用的秋水仙碱浓度是本发明活体诱导使用的最低浓度的250倍，最高浓度的5倍，可以想像经过25ppm秋水仙碱浸泡30分钟对卵子染色体与细胞质的损害是显而易见的。综上所述可以看出，在体外用各种物理或化学方法使卵子染色体加倍是有效的，但是雌核二倍体的成活率与性腺发育成熟的百分率仍然不够理想，尚待进一步研究解决。
为了进一步检证本技术方案的新颖性，发明人曾进一步进行了专利文献检索，其结果未发现有类同的技术项目向中国专利局提出申请或予以公开。也没有相近的技术设计方案和达到相同技术指标的信息公布于众，这些有助于对本发明设计思路的理解。
发明内容
为了减少物理或化学处理对染色体的损伤，发明人提出一个活体内化学药物抑制第二次减数分裂，然后在体外再经遗传失活精子启动二倍体卵子发育的技术方案。并在模型鱼大鳞副泥鳅的实验中，证明此项技术是可行的，有利于提高人工诱导的雌核发育鱼达到性成熟年龄时的成活率与性腺正常发育成熟的百分率，这就是本发明所要解决的问题。为此，采用了以下的技术方案第一，——产卵亲鱼的选择选择生殖腺处于IV期中成熟期，绝大多数卵母细胞核已偏心，停留在减数分裂前期的腹部膨大、体表无损的健康雌鱼，作为实验鱼。
——体内化学诱导染色体加倍，对所选择的产卵亲鱼注射催产剂，促使雌鱼卵母细胞经过第一次减数分裂进入第二次减数分裂中期，在采卵前4～8小时，对实验鱼注射纺锤丝阻断剂，诱导染色体加倍。
——精子遗传物质灭活，选择性成熟的异种或同种体表无损，轻压腹部可挤出少量精液的健康雄鱼，采精前注射催产剂；取精液，用汉克(Hank)精子保存液稀释；后将其置于培养皿中，在紫外灭菌灯下照射进行辐射处理，并不停地对培养皿进行摇动，精子遗传物质灭活时间是以精子遇水激活时大部分精子仍可缓慢游动为准，即可停止辐射处理过程。
——雌核发育人工诱导，将遗传物质灭活的精子与经化学药物体内诱导染色体加倍成熟鱼卵进行干法授精，当卵子授予灭活精子后，可诱发大部分卵子进行雌核发育，并将受精卵置于培养箱进行孵育，即可孵化出雌核发育的二倍体鱼苗。
——进行倍性鉴定。
第二，所注射的催产剂为绒毛膜促性腺激素(HCG)，或促黄体释放激素(LRH-A)，或鲤鱼脑垂体匀浆，当雌鱼卵细胞经过第一次减数分裂进入第二次减数分裂中期，在采卵前4～8小时对实验雌鱼所注射纺缍丝阻断剂为秋水仙碱或细胞松驰素-B，秋水仙碱剂量为0.1～5μg/g(体重)。催产诱导在22～26℃水温的水箱中进行。
第三，对雄鱼注射催产剂后取出0.5～1.0ml的精液，按1∶4的比例与汉克(Hank)精子保存液稀释，储存在直径为80毫米的培养皿中；将培养皿置入30瓦紫外灭菌灯下照射1小时左右，两者之距离为17厘米，照射过程中不停地摇动培养皿。
第四，取经化学纺锤丝阻断剂诱导染色体加倍的成熟鱼卵与遗传物质经紫外线灭活的精子授精，受精卵置于24～26℃培养箱中孵育60小时左右。
第五，根据不同的发育阶段采用以下的倍性鉴定方法胚胎时期用单个胚胎或混合胚胎染色体滴片法；鱼苗用尾鳍细胞滴片法；成鱼用红细胞核体积测量法或细胞核DNA含量细胞分光光度仪测量法。
对照现有技术本发明具有以下的有益效果(1)首次采用了体内化学诱导方法抑制卵母细胞第二次减数分裂，使染色体不减数而加倍，并在体外用灭活精子诱发卵子雌核发育成为雌核二倍体鱼苗。
(2)在催产剂的作用下，IV期中成熟的卵母细胞进行第一次、第二次减数分裂并停留在第二次减数分裂中期的进程基本上是同步进行的。因此，体内注射适当剂量的纺锤丝抑制剂比体外用量低得多，对染色体或鱼卵的损害较轻，可提高雌核二倍体诱导率。
(3)采用灭活精子直接激发染色体已加倍的卵子雌核发育，不需授精后施用物理或化学方法人工诱导染色体加倍，降低对染色体与卵质的损害，提高了雌核二倍体的存活率与性腺正常发育的百分率。
(4)本发明适用于两性生殖的卵生鱼类的人工雌核发育，在鱼类自交系的创建、单性鱼的研制、性别决定机制和染色体基因作图等技术领域有广泛的应用前景。
(5)以大鳞副泥鳅作为模型鱼的实施例，采用本发明的技术方案进行试验，取得较理想的结果，雌核发育鱼达到性成熟年龄的存活率由10～30％提高到50％左右，而且性腺正常发育成熟的百分率由20-60％提高到90％以上，这些均超过了现已公开的技术指标。
为了进一步的了解本发明技术方案，根据上述内容绘制出活体化学诱导鱼类雌核发育方法工艺流程图。现对该图补充说明如下1、产卵亲鱼选择，选择性成熟腹部膨大、体表无损的健康雌鱼，其生殖腺处于IV期中成熟期，即绝大多数卵母细胞核已经偏心(可用透明液检出)，停留在减数分裂的前期。
2、体内化学诱导染色体加倍，按常规方法先对实验鱼注射催产剂(如绒毛膜促性腺激素等)，促使雌鱼卵母细胞经过第一次减数分裂进入第二次减数分裂中期，并按每种鱼的催产效应时间测算，在采卵前4～8小时，再注射纺锤丝阻断剂(如秋水仙碱等)诱导染色体加倍，秋水仙碱剂量为0.1～5μg/g(体重)，实验应在22～26℃水温的水箱中进行催产与诱导。
3、精子遗传物质灭活，选择性成熟的异种或同种体表无损、轻压腹部可挤出少量精液的健康雄鱼，亦按常规方法注射催产剂(方法同上)，然后取精液0.5～1.0ml，用汉克(Hank)精子保存液稀释，精液与稀释液的比例为1∶4，稀释后的精液置于直径80mm培养皿中，在30W紫外灭菌灯下照射1小时左右，两者之距为17cm，照射过程中应不停地摇动，精子遗传物质灭活的辐射时间以精子遇水激活时大部分精子仍可缓慢游动为宜，此时即可停止辐射处理。
4、雌核发育人工诱导，取经化学药物体内诱导染色体加倍的成熟鱼卵与遗传物质灭活的精子进行干法授精，当卵子授予灭活精子后，可诱发大部分卵子进行雌核发育，并孵化出雌核发育的二倍体鱼苗；此时，受精卵应置于24～26℃培养箱中孵育60小时左右。
5、倍性鉴定，按常规方法进行二倍体鉴定。胚胎时期用单个胚胎或混合胚胎染色体滴片法；鱼苗用尾鳍细胞滴片法；成鱼用红细胞核体积测量法或细胞核DNA含量细胞分光光度仪测量法等。
具体实施例方式
实验对象是大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus sauvage)是鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitfidae)、花鳅亚科(Cobitinae)的一种小型食用鱼类。一周年达到性成熟，每年4～6月份水温在18℃以上时为其产卵季节。雌雄鱼性别可以依据胸鳍的外形加以区别，雌鱼鳍圆钝，雄鱼尖细，并均以性腺第IV成熟期越冬。由于其体型小，便于室内饲养与操作管理，而且只要有适宜的水温与营养条件，每年11月至翌年6月均可人工催情产卵。因此，它也是一种常用的模型鱼，可供生理、毒理、转基因遗传育种各种试验之用。发明人直接从水产市场选购2龄以上野生的大鳞副泥鳅，作为实验对象，按照本发明的技术方案进行活体化学诱导雌核发育的试验，具体方式如下；(1)产卵亲鱼选择选择生殖腺处于IV期中成熟期，绝大多数卵母细胞核已偏心，停留在减数分裂前期的腹部膨大、体表无损的、体重在20～30g之间，二龄以上的健康雌鱼4尾。
(2)体内化学诱导染色体加倍在开始采卵前10小时，按常规方法对每条雌鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)100IU，并在采卵前4小时，对其中两尾雌鱼注射纺缍丝阻断剂秋水仙碱0.5～2.5μg/g(体重)，另两尾作为对照，实验鱼在22℃±1℃塑料水箱中进行催产与诱导。
(3)精子遗传物质灭活选择性成熟的同种体表无损、轻压腹部可挤出少量精液的健康雄鱼4尾，体重在20g左右。按常规方法于开始实验采卵前6小时注射绒毛膜促性腺激素(HCG)50IU，6小时后剖腹取出精巢，将其用眼科剪剪碎，尼龙纱绢过滤、弃去残渣，合并4尾鱼精液。然后取精液2ml，用8ml汉克(Hank)精子保存液稀释，稀释后的精液置于直径为80mm培养皿中，在30W紫外灭菌灯(入＝200-320nm)下照射1小时左右，灯管与培养皿的距离为17cm(520uJmm-2)。照射过程应不停摇动，并随时取微量精液在双筒解剖镜下检查。当精子遇水激活，80％以上仍可缓慢游动时，即可停止辐射处理，灭活后精子应用湿毛巾复盖避光。未经紫外线处理的精液留作正常对照之用。
(4)雌核发育人工诱导取经秋水仙碱活体诱导染色体加倍的成熟鱼卵与遗传物质灭活的精子进行干法授精，灭活精子可诱发大部份卵子正常分裂、发育并孵化出雌核二倍鱼苗，此时，受精卵应在24-26℃培养箱中孵育60小时左右。在原肠期用混合胚胎滴片法检查染色体倍性，统计受精率、孵化率和成活率，并在性成熟前先从胸鳍外形特征鉴别雌雄，然后随机取样30尾剖腹检查性腺发育程度。
(5)活体诱导大鳞副泥鳅雌核发育的实验结果如下表所示
注a正常精子与正常卵子授精，比照卵子成熟度。
b灭活精子与正常单倍体卵子授精。
c发育至原肠中期统计数字。
d孵化鱼苗与授精卵之比。
e检查原肠中期混合胚胎滴片200个分裂相的二倍染色体百分率。
f达到性成熟前的百分率。
g只随机选留500尾养至性成熟前的成活率。
从上述试验数据可知使用该方法诱导鱼类雌核发育的鱼达到性成熟年龄时的成活率与性腺发育成熟率分别为61.9％和100％，与方案设计指标相符合。
权利要求
1.一种活体化学诱导鱼类雌核发育方法，包括化学诱导育种，其特征按以下工序进行(1)产卵亲鱼选择，选择生殖腺处于IV期中成熟期，绝大多数卵母细胞核已偏心，停留在减数分裂前期的腹部膨大，体表无损的健康雌鱼，作为实验鱼；(2)体内化学诱导染色体加倍，对所选择的产卵亲鱼注射催产剂，当雌鱼卵母细胞经过第一次减数分裂进入第二次减数分裂中期，在采卵前4～8小时，对该鱼注射纺锤丝阻断剂，诱导染色体加倍；(3)精子遗传物质灭活，选择性成熟的异种或同种体表无损，轻压腹部可挤出少量精液的健康雄鱼，采精前注射催产剂；取精液，用汉克(Hank)精子保存液稀释；后将其置于培养皿中，在紫外灭菌灯下照射进行辐射处理，并不停地对培养皿进行摇动，精子遗传物质灭活时间是以精子遇水激活时大部分仍可缓慢游动为准，即可停止辐射处理过程；(4)雌核发育人工诱导，将遗传物质灭活的精子与经化学药物诱导染色体加倍成熟鱼卵进行干法授精，当卵子授予灭活精子后，将受精卵置于培养箱进行孵育，即可孵化出雌核发育的二倍体鱼苗；(5)倍性鉴定。
2.按照权利要求1所述的一种活体化学诱导鱼类雌核发育方法，其特征是所注射的催产剂为绒毛膜促性腺激素(HCG)，或促黄体释放激素(LRH-A)，或鲤鱼脑垂体匀浆；当雌鱼卵细胞经过第一次减数分裂进入第二次减数分裂中期，再按每种鱼的催产效应时间测算，在采卵前4～8小时对实验雌鱼所注射纺锤丝阻断剂为秋水仙碱或细胞松弛素-B，秋水仙碱剂量为0.1～5μg/g(体重)；催产诱导在22～26℃水温的水箱中进行。
3.按照权利要求1所述的一种活体化学诱导鱼类雌核发育方法，其特征是对雄鱼注射催产剂后取出0.5～1.0ml的精液，按1∶4的比例与汉克(Hank)精子保存液稀释，储存在直径为80毫米的培养皿中；将培养皿置于30瓦紫外灭菌灯下照射1小时左右，两者之距离为17厘米，照射过程中不停地摇动培养皿。
4.按照权利要求1所述的一种活体化学诱导鱼类雌核发育方法，其特征是取经化学纺锤丝阻断剂诱导染色体加倍的成熟鱼卵与遗传物质经紫外线灭活的精子授精，受精卵置于24～26℃培养箱中孵育60小时左右。
5.按照权利要求1所述的一种活体化学诱导鱼类雌核发育方法，其特征是根据不同的发育阶段倍性鉴定采用以下方法胚胎时期用单个胚胎或混合胚胎染色体滴片法；鱼苗用尾鳍细胞滴片法；成鱼用红细胞核体积测量法或细胞核DNA含量细胞分光光度仪测量法进行染色体倍性鉴定。
全文摘要
活体化学诱导鱼类雌核发育方法属于鱼类细胞工程育种技术范畴，具体涉及到活体化学诱导育种的方法。它可以减少理化处理对染色体的损伤和提高人工诱导的雌核发育鱼达到性成熟年龄时的成活率与性腺正常发育成熟的百分率。其要点是选择IV期中成熟期、卵母细胞核已偏心的腹部膨大、体表无损的健康雌鱼，对其依次注射催产剂和纺锤丝阻断剂，诱导染色体加倍；选择异种或同种体表无损、轻压腹部可挤出少量精液的健康雄鱼，对其注射催产剂，取精液与保存液稀释并加辐射处理，使之灭活；再将其与经诱导染色体已经加倍的鱼卵进行干法授精，即可诱发雌核发育和孵化出雌核发育的二倍体鱼苗；再进行倍性鉴定。本发明适用于两性生殖的卵生鱼类的人工雌核发育。
文档编号A01K67/027GK1559201SQ20041001273
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月19日 优先权日2004年2月19日
发明者陈宏溪, 崔书勤, 徐江, 刘汉勤 申请人:武汉康祥科技发展有限公司