专利名称：冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育的方法
技术领域：
本发明涉及一种多倍体鱼类雄核发育的方法，尤其是一种无需卵子失活及不经染色体加倍处理，可快速、高效生产雄核发育二倍体泥鳅且孵化率高的冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育的方法。
背景技术：
雄核发育(Androgenesis)是指用精子生产只带父系遗传物质个体的繁殖方式。由于雄核发育的遗传物质完全来自父方，没有雌性原核的参与，可用于纯系的建立，同时可冷藏濒危物种的精子，对物种的保护具有特殊的意义。另外，在水产养殖上，由于很多重要经济鱼类不同性别往往表现出不同的生产性能，如体型和体色的差异，生长速度的快慢，性成熟时间的不同等。所以，通过雄核发育控制鱼类的性别，选择具有最佳生长性能的雄性进行单性养殖，具有极为重要的应用价值。 目前，人工诱导鱼类雄核发育的方法有两种一种是用正常精子使经过遗传失活的卵受精，得到雄核发育单倍体胚胎(η)，然后通过抑制第I次卵裂的发生诱导核内有丝分裂，由此使单倍体胚胎的染色体加倍发育成为纯合二倍体个体。另一种方法是用四倍体个体的精子(2η)使遗传失活的卵子“受精”，可以直接得到正常发育的二倍体雄核发育后代。即按照上述两种方法获得鱼类雄核发育后代，必需解决卵子染色体遗传失活或染色体加倍的问题。现有使卵子染色体遗传失活最常用的方法有电离辐射或紫外线(UV)照射等，应用辐射的方法对卵子的遗传物质进行灭活虽然简便易行，但是射线在破坏卵子细胞核的同时，对细胞质和其它细胞器也造成不同程度的破坏，此卵子受精后，单倍体虽能较好地通过胚胎发育，但到孵化期或孵化后数天，就会因“单倍体综合症”而陆续死亡。现有染色体加倍的主要方法为利用温度、压力刺激或化学诱变剂阻止第一次卵裂，但是，所获得二倍体的存活率极低。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种无需卵子失活及不经染色体加倍处理，可快速、高效生产雄核发育二倍体泥鳅且孵化率高的冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育的方法。本发明的技术解决方案是一种冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育的方法，其特征在于依次按如下步骤进行
a.取天然雄性四倍体泥鳅及雌性二倍体泥鳅进行催产，分别取雄性四倍体泥鳅的精液及雌性二倍体泥鳅的卵子，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀释待用；
b.将稀释后的精液与卵子混合形成受精卵，将受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常温水中进行孵化。本发明是取雄性四倍体泥鳅的精液及雌性二倍体泥鳅的卵子形成受精卵，用冷休克处理(3°C冰水，浸泡60min)，受精卵即可快速、高效生产雄核发育二倍体泥鳅，无需卵子遗传失活及染色体加倍处理，避免了繁琐的操作程序，廉价、易操作，缩短了获得纯系泥鳅育种时间，解决了现有理化诱导对受精卵造成伤害的问题，提高了雄核发育二倍体泥鳅孵化率和成活率，有利于大规模生产使用。
图I是本发明实施例所制备的雄核发育二倍体泥鳅染色体(2n=50)的图片。图2是对照组(2n早X 4n ￠)泥鳅染色体(3n=75)的图片。
具体实施例方式实施例依次按如下步骤进行
a.取发育良好的天然雄性四倍体泥鳅(4n=100)及雌性二倍体泥鳅(2n=50)，用现有技术的催产方法进行催产，水温24± I °C,效应时间1(Γ 2小时后，确认排卵后，轻压腹部采集雌性二倍体泥鳅的卵子，并用毛细管采集雄性四倍体泥鳅的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀释待用；Kurokura’ s solution溶液的配制方法是现有技术，即 NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHCO3 20 mg, KCl 20 mg 溶于 100 ml 蒸馏水中；
b.按现有技术的方法将稀释后的精液与卵子混合形成受精卵，与现有技术所不同的是将受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常温水中进行孵化。孵化时按照现有技术的孵化方法经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通，及时用吸管吸出死卵,孵化出的鱼苗放入水槽中饲养。实验
I.倍性检测
通过早期混合胚胎制片法对本发明实施例及对照组的泥鳅体细胞染色体数目进行检测，对照组与本发明实施例的区别是受精卵未经冷休克处理。早期混合胚胎制片法为取本发明实施例及对照组发育眼胞期的胚胎3(Γ50个，用镊子剖去卵膜和卵黄后放入盛有0. 0025%的秋水仙素中处理45min，0. 8%的柠檬酸低渗20min,再用预冷的卡诺固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)固定3次，每次15 201^11，最后_20°C冷冻过夜。冷滴片，10%吉姆萨染色，镜检，拍照。本发明实施例照片如图I所示结果表明雄核发育泥鳅染色体为二倍体(2n=50)。对照组照片如图2所示结果表明染色体为三倍体(3n=75)。
权利要求
1.一种冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育的方法，其特征在于依次按如下步骤进行 a.取天然雄性四倍体泥鳅及雌性二倍体泥鳅进行催产，分别取雄性四倍体泥鳅的精液及雌性二倍体泥鳅的卵子，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀释待用； b.将稀释后的精液与卵子混合形成受精卵，将受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常温水中进行孵化。
全文摘要
本发明公开一种无需卵子失活及不经染色体加倍处理，可快速、高效生产雄核发育二倍体泥鳅且孵化率高的冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育的方法，依次按如下步骤进行取天然雄性四倍体泥鳅及雌性二倍体泥鳅进行催产，分别取雄性四倍体泥鳅的精液及雌性二倍体泥鳅的卵子，所得精液用Kurokura’ssolution溶液100倍稀释待用；将稀释后的精液与卵子混合形成受精卵，将受精卵置于3℃冰水中，浸泡60min，然后置于常温水中进行孵化。
文档编号A01K61/00GK102835338SQ20121034526
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者李雅娟, 姜志强, 王玉生, 高养春, 刘博 申请人:大连海洋大学, 李雅娟