专利名称：一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法
技术领域：
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法。
背景技术：
猪精子冻融后，由于受到一系列冷冻损伤导致精子大量死亡或活力下降，而采用蛋黄作为冷冻保护剂时，猪精子细胞骨架猪中肌动蛋白的表达量及微管蛋白的表达量不尽理想，无法达到实际使用要求。冻融精子受精率低下的主要原因之一是细胞骨架受到损伤。研究显示低密度脂蛋白LDL能改善冻融精子冷冻效率，但它对冻融精子细胞骨架完整性影响方面的研究报道甚少。
发明内容
本发明提供了一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，旨在解决目前猪精子冻融后，由于受到一系列冷冻损伤导致精子大量死亡或活力下降，而采用蛋黄作为冷冻保护剂时，猪精子细胞骨架猪中肌动蛋白的表达量及微管蛋白的表带量不尽理想，无法达到实际使用要求的问题。本发明的目的在于提供一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:利用成 年猪获取猪精液；从鸽子卵中提取LDL ；采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻。进一步，成年健康、性欲旺盛的猪获取猪精液的具体步骤为:采自成年健康、性欲旺盛的猪，镜检精子活力大于80%，精液直接在非获能或获能液稀释到40xl06精子/mL，然后精子在温度38.5°C,5% C02气体条件下孵化。进一步，从鸽子卵中提取LDL的具体步骤为:第一步、手工打破鸽子卵并除去卵清，将卵黄在滤纸上滚动除去卵清和粘连在卵黄膜上的系带，然后在卵黄膜上穿孔，将未损坏的卵黄收集在冰水预冷的烧杯中；第二步、依照McBeeand CotterillP的方法将卵黄分成乳衆和颗粒，用同体积0.17M的NaCl稀释液稀释，4°C条件下搅拌lh，然后在4°C、IOOOOg条件下离心45min，将上清液与沉淀分离；第三步、上清液再次同条件离心彻底除去颗粒，向上清液中加入同体积40%(NH4)2S04，4°C下搅拌lh，然后4°C、IOOOOg条件下离心30min，除去沉淀，上清液在去离子水中透析6h，水每两小时更换一次，6h后再次4°C、IOOOOg条件下离心30min，上层漂浮物即为 LDL。进一步，采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻的具体步骤为:精液取回后PBS洗涤，800g离心lOmin，去上清液，留沉淀备用；Tris_柠檬酸-葡萄糖与9%鸽子蛋LDL混合，稀释至1.5X109个/ml，缓慢降温至4°C制成冷冻剂；按2: I的比例在沉淀中加入含体积分数3%甘油冷冻剂，4°C平衡Ih后以-80°C冻存。进一步，该方法还进一步包括卵母细胞的采集和成熟培养方法，步骤为:用注射器抽吸法采集卵巢表面直径2_8mm卵泡内的卵母细胞，卵母细胞先在含有促卵泡素(FSH)的TCM199成熟培养液中培养20_22h后，换成不含FSH的培养液继续培养至42-46h ;培养条件为38.5°C，体积分数为5%的CO2，饱和湿度环境下培养。进一步，该方法还进一步包括精子获能方法，步骤为:猪精液经离心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培养基中，培养基组分:100mMNaCl, 3.1mM KCl, 1.5mM MgCl2, 25mM NaHCO3,0.29mM KH2P04，21.6mM 乳酸钠，0.1mM sodiumpyruvate, 2m MCaCl2, 20Hepes pH7.4, 50 u g/mlBSA, lOU/ml penicillin 和 20 u g/ml 肝憐脂；精子在获能培养基培养4h，条件为39°C和5% C02。进一步,该方法还进一步包括顶体反应方法,步骤为:顶体反应诱导在添加IOiiM Ca2+离子载体A23187培养20min进行，结合生物素的豌豆凝集素作为探针检测精子顶体反应；引起顶体反应的样本涂抹在显微镜载波片上；精子涂片风干以后，浸入无水甲醇30秒而后快速风干；甲醇固定的涂片和封阻液培养PBSlOmin ;然后置于含1% BSA的PBS培养液中培养30min ;过氧化物酶结合的抗生物素蛋白培养IOmin ;精子顶体帽染成红色的是顶体完整的精子，精子赤道部位染成红色的或无色的是顶体反应的精子。进一步，该方法还进一步包括精子孵化和冷却处理方法，步骤为:精子悬浮在NCM和CM 中，在检测酪氨酸磷酸化或顶体反应前，孵化3h ;所有孵化发生在这些条件下，计算机控制的水浴以冷却率为0.30C min—1，将精子从室温冷却到5°C ；冷却后马上将精子放回恒温箱内孵化IOmin后，进行检测。本发明提供的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，该方法通过添加9%的低密度脂蛋白LDL作为冷冻保护剂，改善猪精子冻融后细胞骨架的完整性，可明显提高猪精子细胞骨架肌动蛋白的表达量，同时也是微管蛋白的表达量更接近于新鲜精液，有效地提高了猪精子冻融后的存活率、活力及受精率，最大限度地满足了现实使用的需要，具有较强的推广及应用价值。
图1是本发明实施例提供的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法的示意图。图2是本发明实施例提供的SDS-PAGE分析结果，图中M是标准蛋白，I是鲜精，2是获能精子，3是-80°C冷冻精液，_196°C冷冻精液；图3是本发明实施例提供的Western blot肌动蛋白分析结果，图中I是鲜精，2是获能精子，3是-80°C冷冻精液，_196°C冷冻精液；图4是本发明实施例提供的Western blot微管蛋白分析结果，图中I是鲜精，2是获能精子，3是-80°C冷冻精液，4是-196°C冷冻精液；图5是本发明实施例提供的SDS-PAGE分析结果，图中M标准蛋白，I是鲜精，2是添加9% LDL作为冷冻保护剂-80°C冻融后的结果，3是蛋黄作为冷冻保护剂冻融后的结果，4是添加9% LDL作为冷冻保护剂_196°C冻融后的结果；图6是本发明实施例提供的Western blot微管蛋白分析结果，I是鲜精，2是添加9% LDL作为冷冻保护剂_80°C冻融后的结果，3是蛋黄作为冷冻保护剂冻融后的结果，4是添加9% LDL作为冷冻保护剂_196°C冻融后的结果；图7是本发明实施例提供的Western blot肌动蛋白分析结果，I是鲜精，2是添加9% LDL作为冷冻保护剂_80°C冻融后的结果，3是蛋黄作为冷冻保护剂冻融后的结果，4是添加9% LDL作为冷冻保护剂_196°C冻融后的结果。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。本发明的目的在于提供一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，该方法包括以下步骤:SlOl:成年健康、性欲旺盛的猪获取猪精液；S102:从鸽 子卵中提取LDL ；S103:采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。本发明通过添加9%的LDL替代蛋黄作为冷冻保护剂，探究9%的LDL对细胞骨架蛋白表达量的影响，结果表明，温度对细胞骨架中微管蛋白的影响较小(图3)，而对肌动蛋白的影响较大(图4)，以9%的LDL替代蛋黄作为冷冻保护剂可明显提高猪精子细胞骨架肌动蛋白的表达量(图6)，同时也是微管蛋白的表带量更接近于新鲜精液(图7)。图1是本发明实施例提供的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法的示意图。图2是本发明实施例提供的SDS-PAGE分析结果，图中M是标准蛋白，I是鲜精，2是获能精子，3是-80°C冷冻精液，_196°C冷冻精液；图3是本发明实施例提供的Western blot肌动蛋白分析结果，图中I是鲜精，2是获能精子，3是-80°C冷冻精液，_196°C冷冻精液；图4是本发明实施例提供的Western blot微管蛋白分析结果，图中I是鲜精，2是获能精子，3是-80°C冷冻精液，4是-196°C冷冻精液；图5是本发明实施例提供的SDS-PAGE分析结果，图中M标准蛋白，I是鲜精，2是添加9% LDL作为冷冻保护剂-80°C冻融后的结果，3是蛋黄作为冷冻保护剂冻融后的结果，4是添加9% LDL作为冷冻保护剂_196°C冻融后的结果；图6是本发明实施例提供的Western blot微管蛋白分析结果，I是鲜精，2是添加9% LDL作为冷冻保护剂_80°C冻融后的结果，3是蛋黄作为冷冻保护剂冻融后的结果，4是添加9% LDL作为冷冻保护剂_196°C冻融后的结果；图7是本发明实施例提供的Western blot肌动蛋白分析结果，I是鲜精，2是添加9% LDL作为冷冻保护剂_80°C冻融后的结果，3是蛋黄作为冷冻保护剂冻融后的结果，4是添加9% LDL作为冷冻保护剂_196°C冻融后的结果。本发明实施例的具体实现方法如下:1、获取猪精液猪精液由吉林延吉市韩吉牧业有限公司提供，采自成年健康、性欲旺盛的猪。镜检精子活力大于80%者方可用于试验。富含精子的精液直接在非获能或获能液稀释到40xl06精子/mL。然后精子在温度38.5°C，湿度5% C02气体条件下孵化。2、LDL 的提取蛋黄中LDL的提取是根据Moussa等所用的方法。手工打破卵并除去卵清。将卵黄在滤纸上小心滚动以除去卵清和粘连在卵黄膜上的系带，然后在卵黄膜上穿孔，将未损坏的卵黄收集在冰水预冷的烧杯中。依照McBeeand CotterillP的方法将卵黄分成乳衆和颗粒。用同体积0.17M的NaCl稀释，4°C条件下搅拌lh，然后在4°C、IOOOOg条件下离心45min。将上清液与沉淀分离。上清液再次同条件离心彻底除去颗粒。向上清液中加入同体积40%硫酸铵，4°C下搅拌lh，然后4°C，IOOOOg条件下离心30min。除去沉淀，上清液在去离子水中透析6h，水每两小时更换一次。6h后再次4°C、IOOOOg条件下离心30min，上层漂浮物即为LDL。3、猪精子冷冻
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精液取回后PBS洗涤，800g离心lOmin，去上清液，取沉淀分两组加入冷冻保护齐U。第一组为TCG(TriS-柠檬酸-葡萄糖)+9%鸽子蛋LDL，对照组TCG+20%卵黄，稀释至1.5X109个/ml。缓慢降温至4°C，分别以2: I的比例加入含体积分数3%甘油的上述2种冷冻剂，4°C平衡Ih后装入0.5ml精细管中，再将各组分别以_80°C和_196°C冻存。4、卵母细胞的采集和成熟培养用注射器抽吸法采集卵巢表面直径2-8_卵泡内的卵母细胞，卵母细胞先在含有促卵泡素(FSH)的TCM 199成熟培养液中培养20_22h后，换成不含FSH的培养液继续培养至42-46h。培养条件为38.50C、C02体积分数为5%的空气、相对饱和湿度。5、精子获能精子体外获能是依据Parrish et al.(1988)描述的方法。猪精液经离心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培养基中(培养基组分:100mM NaCl, 3.1mM KCl, 1.5mM MgCl2, 25mMNaHCO3,0.29mM KH2P04,21.6mM乳酸钠，0.1mMsodium pyruvate, 2m MCaCl2,20Hepes pH7.4,50 u g/ml BSA, lOU/ml penicillin和20 u g/ml肝磷脂。精子在获能培养基培养4h(39°C和 5% CO2)。6、顶体反应:顶体反应诱导在添加IOiiM Ca2+离子载体A23187培养20min进行，结合生物素的豌豆凝集素(pisum sativum agglutinin,PSA)作为探针检测精子顶体反应。引起顶体反应的样本涂抹在显微镜载波片上；精子涂片风干以后，浸入无水甲醇30秒而后快速风干；甲醇固定的涂片和封阻液培养PBS (含1% BSA) IOmin ;然后置于含1% BSA的PBS (含结合生物素的PSA(50 ii g/ml))培养液中培养30min ;过氧化物酶结合的抗生物素蛋白(I: 400)培养lOmin。精子顶体帽染成红色的是顶体完整的精子，精子赤道部位染成红色的或无色的是顶体反应的精子。7、精子孵化和冷却处理
精子悬浮在NCM和CM中。在检测酪氨酸磷酸化或顶体反应前，孵化3h(39°C和5%C02)。所有孵化发生在这些条件下，除非另有说明。计算机控制的水浴以冷却率为.0.3CmirT1，将精子从室温冷却到5°C。冷却后马上将精子放回恒温箱(39°C和5% CO2)内孵化IOmin后,进行检测。8、精子蛋白质提取分别收集新鲜、冻融和获能的猪精液样本,用PBS(phosphate buffered saline)洗涤2次后，冻存于-20°C冰箱，24h内即进行蛋白质提取。用含0.5mol/L的tris_HCl、0.28mol/L2巯基乙醇、5mol/L盐酸胍的裂解液裂解精子；再用三氯乙酸/丙酮法沉淀蛋白质，提取沉淀的蛋白质冻干，将冻干的蛋白质沉淀以裂解缓冲液(8mol/L 尿素、40g/LCHAPS(C32H58N2S07) ,40mmol/LTris)溶解后，在沸水中变性5min，-20 V保存。PBS冲洗固定精子的载玻片，用含3 % BSA的PBS液封闭Ih后，在37°C与一抗G-和F-肌动蛋白(A2668)、血影蛋白(S1515)和a-微管蛋白(T9026)共培养Ih (荧光素抗体用3% BSA水溶液稀释)。用PBS洗涤后，载玻片与含羊抗鼠IgG(F5387)或者羊抗兔IgG(F7512)的二抗(FITC ；P5282)进一步共培养。反复用PBS冲洗，为了使培养的样本在显微镜下观察呈现不同颜色，用含或不含碘化丙啶的复染色剂Vectashield封闭载玻片。载玻片用荧光显微镜作常规检查。显微照片由共聚焦显微镜下观察结果。9、SDS-PAGE 电泳分析SDS-PAGE电泳采用Laemmli电泳缓冲体系，分离胶含量为100g/L，浓缩胶含量为50g/L，上样量为40L。连接电源，使阳极在下，阴极在上。在恒压下(浓缩胶80V，分离胶120V)电泳2h，至指示染料移到凝胶板下口约Iem处时停止。电泳完毕后，取下一板胶片放入考马斯亮蓝染色液中，在摇床上摇动染色0.5-lh，然后置脱色液中脱色至蛋白带清晰为止；另一板胶片做Western blot免疫印迹分析。10> Western blot 免疫印迹(1)将胶片移入转移缓冲液(48mmol/LTris Na0H、39mmol/L 甘氨酸、0.037g/L SDS、200ml/L甲醇)中浸润5min，将转移缓冲液润湿的6张Whatman滤纸、硝酸纤维素膜及凝胶按3层滤纸、硝酸纤维素膜(正面朝上)、凝胶、3层滤纸，按顺序依次铺在半干式电泳凝胶转移仪的石墨平板上，每铺一层，要用玻璃棒赶走每层间的气泡。铺好后，将转印装置接通电源，转印1-1.5h。将蛋白质Marker切下单独染色(考马斯亮蓝染色)；将印迹膜放入封闭液中于室温震荡器上放置过夜，用PBS缓冲液洗3遍后加入一抗(肌动蛋白)于37孵育lh，用15mL 8.5g/LNaCl洗3遍后，加入酶标二抗(HRP标记的兔抗牛IgG)，于37°C孵育lh。洗膜方法同上，然后加底物(DAB)显色。11> Western blot 蛋白质免疫印迹(2)应用SDS-电泳和免疫印记技术检测一抗的生物化学特性。SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳依据Laemmli (1970)的方法、免疫印迹法是依据Towbin et al.(1979)的方法进行。精子样本用PBS洗涤两次，悬浮在非还原裂解液加热到100°C保持5分钟。在SDS-PAGE凝胶孔中点入相当于106个精子细胞的样本。电泳分离的蛋白质转移到硝化纤维膜上，通过与一抗、二抗培养后检测，抗体选择抗鼠IgG (A0168)或抗兔(A0545) IgG过氧化物酶联合物。非特定的部位用PBS封闭液(5%脱脂奶和0.05%吐温-20)封闭，蛋白质条带通过增强化学荧光的方法显现。
12、DNA彗星实验精子单细胞凝胶电泳(彗星实验)将细管冻精解冻后，调整精子密度为“个”，然后根据Haines、Philip等等介绍的方法,适当进行修改后分析精子DNA的损伤情况.
13、体外受精将培养成熟的卵母细胞用移卵管反复吹打，除去卵母细胞外面的卵丘细胞挑选胞质饱满均匀有第一极体的卵母细胞移入到预平衡的获能液(不加肝素)中洗涤3-5次。然后用移卵管移入上盖矿物油并在CO2培养箱中预孵4-6h以上的获能液小滴中，每滴放入10-15枚卵母细胞，置于培养箱(38°C，5% CO2,100%饱和湿度)中，等待受精。对于已经获能的精子，调整精子浓度到1-1.5xl06个/mL左右。然后取50mL加入到等待受精的卵母细胞微滴中，于CO2培养箱(38°C，5% CO2,100%饱和湿度)中，共同孵育6h。14、胚胎培养受精后6h，将卵母细胞移入NCSU23中轻轻吹打，去除附着在受精卵周围的精子，并用NCSU23洗涤3次，然后放入至少平衡2h的微滴(4ug/mLBSA)中，每滴约10枚受精卵，培养条件为38°C，5% CO2,100%饱和湿度。每隔24h检查I次，培养48h统计卵裂率。以上所述 仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 利用成年猪获取猪精液； 从鸽子卵中提取LDL; 采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻。
2.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，成年健康、性欲旺盛的猪获取猪精液的具体步骤为:采自成年健康、性欲旺盛的猪，镜检精子活力大于80 %，精液直接在非获能或获能液稀释到40xl06精子/mL，然后精子在温度38.5°C,5% C02气体条件下孵化。
3.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，从鸽子卵中提取LDL的具体步骤为: 第一步、手工打破鸽子卵并除去卵清，将卵黄在滤纸上滚动除去卵清和粘连在卵黄膜上的系带，然后在卵黄膜上穿孔，将未损坏的卵黄收集在冰水预冷的烧杯中； 第二步、依照McBeeand CotterillP的方法将卵黄分成乳衆和颗粒,用同体积0.17M的NaCl稀释液稀释，4°C条件下搅拌lh，然后在4°C、IOOOOg条件下离心45min，将上清液与沉淀分离； 第三步、上清液再次同条件离心彻底除去颗粒，向上清液中加入同体积40%(NH4)2S04，4°C下搅拌lh，然后4°C、IOOOOg条件下离心30min，除去沉淀，上清液在去离子水中透析6h，水每两小时更换一次，6h后再次4°C、IOOOOg条件下离心30min，上层漂浮物即为 LDL。
4.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻的具体步骤为:精液取回后PBS洗涤，800g离心lOmin，去上清液，留沉淀备用；Tris_柠檬酸-葡萄糖与9%鸽子蛋LDL混合，稀释至1.5X109个/ml，缓慢降温至4°C制成冷冻剂；按2: I的比例在沉淀中加入含体积分数3%甘油冷冻剂，4°C平衡Ih后以-80°C冻存。
5.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法还进一步包括卵母细胞的采集和成熟培养方法，步骤为: 用注射器抽吸法采集卵巢表面直径2-8mm卵泡内的卵母细胞，卵母细胞先在含有促卵泡素(FSH)的TCM199成熟培养液中培养20-22h后，换成不含FSH的培养液继续培养至42-46h ;培养条件为38.5°C，体积分数为5%的CO2，饱和湿度环境下培养。
6.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法还进一步包括精子获能方法，步骤为: 猪精液经离心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培养基中，培养基组分:100mM NaCl,3.1mM KCl, 1.5mM MgCl2, 25mM NaHCO3,0.29mM KH2P04，21.6mM 乳酸钠，0.1mM sodiumpyruvate, 2m MCaCl2, 20Hepes pH7.4, 50 u g/ml BSA, lOU/ml penicillin和 20 u g/ml 肝憐脂；精子在获能培养基培养4h，条件为39°C和5% C02。
7.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法还进一步包括顶体反应方法，步骤为: 顶体反应诱导在添加IOuM Ca2+离子载体A23187培养20min进行，结合生物素的豌豆凝集素作为探针检测精子顶体反应；引起顶体反应的样本涂抹在显微镜载波片上；精子涂片风干以后，浸入无水甲醇30秒而后快速风干；甲醇固定的涂片和封阻液培养PBSlOmin;然后置于含1% BSA的PBS培养液中培养30min ;过氧化物酶结合的抗生物素蛋白培养IOmin ;精子顶体帽染成红色的是顶体完整的精子，精子赤道部位染成红色的或无色的是顶体反应的精子。
8.如权利要求1所述的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法还进一步包括精子孵化和冷却处理方法，步骤为: 精子悬浮在NCM和CM中，在检测酪氨酸磷酸化或顶体反应前，孵化3h ;所有孵化发生在这些条件下，计算机控制的水浴以冷却率为0.30C mirT1，将精子从室温冷却到5°C ;冷却后马上将精子放回恒 温箱内孵化IOmin后，进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，该方法包括以下步骤成年健康、性欲旺盛的猪获取猪精液；从鸽子卵中提取LDL；采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻。本发明提供的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，通过添加9％的低密度脂蛋白LDL作为冷冻保护剂，改善猪精子冻融后细胞骨架的完整性，可明显提高猪精子细胞骨架肌动蛋白的表达量，同时也是微管蛋白的表达量更接近于新鲜精液，有效地提高了猪精子冻融后的存活率、活力及受精率，最大限度地满足了现实使用的需要，具有较强的推广及应用价值。
文档编号C12N5/075GK103190391SQ20131010304
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者金 一, 崔明勋, 尹熙俊, 方南洙, 金花子, 金英海, 吴俊波 申请人:金 一