专利名称：褐牛蜘蛛腿综合征致病位点pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种褐牛疾病的分子检测方法。
背景技术：
家畜遗传疾病(Animal genetic disease)是指由遗传物质变异对家畜个体造成有害影响，表现为身体结构缺陷或功能障碍，这种有害的遗传信息按一定的遗传方式在世代间垂直传递，在某些品种的家系内呈现一定的表达方式，不会延伸到无亲缘关系的个体 (张沅，2001)。动物遗传疾病的爆发给畜牧育种和生产者造成巨大经济损失。由于奶牛和肉牛Al繁育体系的建立，种公牛的优秀生产性能基因在全群内的推广传播效率越来越高， 对全群奶牛的生产性能改良起到巨大的推动作用。奶牛和肉牛遗传种质资源(包括优秀个体、公牛冻精、优质胚胎)世界范围内交换的日益频繁，也加速了有害基因在世界牛群范围内的传播扩散。牛蜘蛛腿综合征(ArachnomeliaSyndrome, AS ；0MIA phene ID 139, Group 000059) 是一种先天性致死性骨骼畸形遗传病，患病个体出生时或出生不久后死亡。该病最早是于 1975年，由德国科学家Rieck和Schade报道的，现除了个别在荷斯坦牛群中散发的患病牛外，该病主要存在于德系西门塔尔牛和瑞士褐牛群体中。虽然在两个品种中，AS症状相似，但遗传基础并不相同。在西门塔尔牛群中，该病是由MOCSl基因外显子11的缺失突变 c. 1224 1225delCA引起的，该突变将造成移码突变产生不成熟的短链蛋白，突变位点发生在一个该蛋白质物种间共同的保守域前，突变导致MoC结构域丢失，蛋白质在二级结构上也发生变异。(Buitkamp等,2011 ;焦士会,2011)在20世纪80年代，欧洲瑞士褐牛中大量报道了蜘蛛腿综合征患病个体(K0nig 等，1987)，2004年，意大利也报道了 4头AS瑞士褐犊牛，并详细描述了其主要的临床症状和病理特征(Testoni，2004)。科学家对历经20年时间收集到的15头患病瑞士褐牛进行
系谱分析，所有个体都能追溯到同一个祖先-来自美国Norvic Larry牛场的瑞士褐公
牛LILAS0N，并且推断AS呈现简单孟德尔隐性遗传病特征(Dr0gemiiller等，2009)。瑞士褐牛群体有可能是由于大量使用这头经高度选育的公牛及其后代的冻精，从而引起该病致病基因的广泛传播，导致发病。2009年，Dr0gemiiller等对瑞士褐牛群AS进行了研究，使用了覆盖牛29对常染色体的240个微卫星标记，对15头患病个体和36头已知确认的AS杂合子进行全基因组扫描， 将基因定位在BTA5上3个连续标记间。进一步精细定位和单倍型分析的结果揭示导致瑞士褐牛蜘蛛腿综合征的致病基因可能存在于BTA5上微卫星标记BMS490和DIK5248之间， 跨度约8cM，物理距离在7. 19Mb范围内。随后，Dr0gemiiller等(2010)报道了瑞士褐牛AS 是由BTA5定位区间内SUOX基因外显子4上的一个G的插入c. 363_364insG突变所致。经预测，插入突变c. 363-364insG会导致SO蛋白的氨基酸序列从124位置发生移码突变并且会由于移码提前产生终止密码子，最终导致发病。在我国，新疆褐牛(Xinjiang Brown)是经长期选育培育出来的优秀的乳肉兼用型品种，于1983年通过新疆自治区畜牧厅组织品种审定。新疆褐牛最初是以当地哈萨克牛为母本，引入瑞士褐牛、阿拉托乌牛及少量的科斯特罗姆牛与之杂交改良经长期选育形成。 19世纪70年代至今，我国曾大量引入西德、奥地利褐牛和美国瑞士褐牛及其遗传物质(包括冻精及活体胚胎等)进行新疆褐牛优良遗传品质及生产性能的巩固和提高(郑丕留等， 1998)。大量外血的引入对新疆褐牛的生产性能提高发挥了重要作用，然而也可能将一些不利的致病基因引入。据文献报道，瑞士和奥地利的瑞士褐牛群体中AS致病等位基因估计频率为O. 16(Dr0gemiiller等，2010)，但该致病突变是否已存在于我国新疆褐牛群体中尚处于未知状态。因此，建立褐牛AS致病位点检测方法具有重要意义。PCR产物测序的方法对于寻找DNA序列上的突变是一种准确性最高的检测方法。 使用PCR产物测序的方法，比对测序结果与参考序列能够快速确定测序个体DNA序列与参考序列的差异。荧光自动化检测分析方法其基本原理就是，通过在引物上标记I个荧光发色基团，经PCR扩增后，再采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行产物分离，利用基于荧光扫描技术的遗传分析仪，结合分子量标准自动计算PCR产物长度大小，是一种常见的用于检测长度多态的技术手段。此法通过直接判定扩增片段的长度，能够实现高通量和自动化的分型。另外，该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、检测实现高通量分型、自动化程度高、无污染性、具实时性、快捷性和准确性等特点，此外，该方法还能够与其他位点检测进行组合，如扩增片段长度不同或者携带不同的荧光发色基团，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种褐牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点的快速检测方法。为了实现本发明目的，本发明提供的一种褐牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点PCR检测用引物，其核苷酸序列如下5，-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3，，5，-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3，。上述引物配合使用的荧光标记引物，其荧光染料为FAM、HEX、TET等。本发明还提供含有上述引物的检测试剂盒，其还包括DNA裂解液、阴性模板和/ 或阳性模板。本发明进一步提供利用上述引物或试剂盒检测褐牛蜘蛛腿综合征的方法，包括以下步骤I)目的基因的扩增以褐牛组织细胞DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；2)基因分型对上述PCR扩增产物直接测序或者利用荧光毛细管电泳或者荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。所述PCR扩增条件优选为95°C预变性5min，然后95°C变性30s、63°C退火30s、 72°C延伸30s，共35个循环，72°C最终延伸IOmin。所述引物用量为I. 5 μ L，引物的终浓度为10 μ Μ。
本发明还提供了上述方法在牛抗病育种中的应用，所述牛为褐牛该检测方法是在已知SUOX基因的c. 363_364insG证位点为褐牛蜘蛛腿综合征 (AS)致病位点的基础上，结合PCR直接测序方法或者荧光引物PCR后电泳检测方法，设计的一种快速准确遗传致病基因检测的方法。对褐牛AS致病突变位点准确有效的分子检测方法的建立，目的在于筛选出我国牛群中的突变携带者个体，进行不利基因的筛查和剔除，对我国进口的褐牛种用动物及遗传物质(冷冻精液，胚胎等)，以及我国褐牛群体和含有褐牛血缘的群体进行检测，防止AS在我国牛群中的传播，对我国牛的遗传改良提供保障。本发明褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物及其试剂盒，检测结果稳定， 成本低，准确可靠，可实现高通量检测，对褐牛AS致病位点可以进行准确的分型，能及时发现褐牛蜘蛛腿综合征携带者个体。
图I为本发明冻精中提取公牛基因组I %琼脂糖凝胶检测结果；图2为本发明不同引物、相同样品PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶检测结果；其中 泳道1-12为引物MOCS扩增产物；泳道19-30为引物SUOX I扩增产物；泳道13-18，31-36 为引物SUOX 2扩增产物；M为IOObp ladder ；图3为本发明中PCR产物突变位点附近测序结果与文献报道的测序结果比较；其中a为本研究测序结果；b、c为文献报道的欧洲瑞士褐牛PCR产物测序结果，黑色箭头位置为报道的瑞士褐牛AS致病突变位点c. 363-364insG ；图4为本发明被检测个体PCR产物测序序列与基因参考序列进行多重比对的结果；其中前5行序列分别为本研究中检测个体；第6行序列为参考序列(NCBI Gene ID 509837)；图5为本发明使用荧光自动化判型法进行SUOX基因突变位点新疆褐牛基因型检测结果；图6 为本发明 SUOX 基因 c. 363-364insG 和 MOCSl 基因 c. dell224_1225CA 位点同时检测结果；其中黑色箭头指示峰图为250bp内标。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I试验材料的准备和DNA的提取本研究采用的试验材料来自两个部分，一部分是我国新疆地区现在推广使用的55 头褐牛公牛，其中50头公牛的冻精来自天山畜牧种公牛站，另外5头来自新疆畜禽繁殖改良总站，共55支细管冷配精液。系谱分析显示55头褐牛公牛不同程度的含有欧洲及美国褐牛血缘(表I)。表155头褐牛种公牛含美国及欧洲瑞士褐牛外血情况
权利要求
1.一种褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物，其核苷酸序列如下5， -CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3，，5’ -ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’。
2.如权利要求I所述引物，其特征在于，还包括与引物配合使用的荧光染料。
3.如权利要求I所述的引物，其特征在于，所述染料为FAM、HEX或TET。
4.含权利要求I 3任意一项所述引物的检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括DNA裂解液、阴性模板和/或阳性模板。
6.一种检测褐牛蜘蛛腿综合征致病位点方法，其特征在于，其具体包括以下步骤1)目的基因的扩增以褐牛组织细胞DNA为模板，利用权利要求I所述引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；2)基因分型对上述PCR扩增产物直接测序或者利用荧光毛细管电泳或者荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为95°C预变性5min，然后 95°C变性30s、63°C退火30s、72°C延伸30s，共35个循环，72°C最终延伸IOmin。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物用量为I.5 μ L，引物的终浓度为 10 μ Μ。
9.权利要求6 8任意一项所述方法在牛抗病育种中的应用。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述牛为褐牛。
全文摘要
本发明涉及一种褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物，其核苷酸序列如下5’-CTCAAGAGTCACCACGCAGAT-3’，5’-ATGGAGGGTGCCTTGTCGTC-3’。本发明还涉及PCR检测试剂盒及其检测方法和应用。本发明褐牛蜘蛛腿综合征致病位点PCR检测用引物及其试剂盒，检测结果稳定，成本低，准确可靠，可实现高通量检测，对褐牛AS致病位点可以进行准确的分型，能及时发现褐牛蜘蛛腿综合征携带者个体。
文档编号C12Q1/68GK102586464SQ20121007691
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者俞英, 初芹, 孙东晓, 张毅, 张沅, 张胜利, 焦士会, 王雅春 申请人:中国农业大学