专利名称：一种中国白酒中耐酸、耐乙醇的产挥发酸的酵母及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中国白酒中耐酸、耐乙醇的产挥发酸的酵母，以及耐酸、乙醇性能的产挥发酸酵母在酒类及食品酿造工业中的应用。
背景技术：
酸类成份是中国白酒的重要口味物质，起到呈香、助香、减少刺激和缓冲平衡的作用。白酒中的挥发酸，其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸等酸对白酒的风味贡献尤其显著。它们与其它香味物质共同组成内酒所特有的口味，同时也是生成酯类物质的前体物质。 适量的酸有助于增强白酒的口感和后味，可使酒体丰满、醇厚，回味悠长。挥发酸含量的多少，对酒的等级、香型等具有重要的影响。酸在白酒中的生成途径，主要来自发酵产生挥发酸的微生物，它们利用糖类等原始物质，通过较复杂的生化反应完成酸类物质的生成与转化。目前对白酒酿造过程中的生酸细菌研究较多，包括己酸菌、丁酸菌等，但这些细菌在白酒生产中只能提供有限的几种酸类物质。但是白酒中还存在其它一些重要的酸类物质，如异丁酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等。 目前，在中国白酒酿造工业中对于这些重要的挥发酸的形成及产生微生物并不清晰。因此寻找合成这些酸类物质的微生物，以及将这些微生物应用于白酒酿造中以提高酸类物质的含量具有重要的意义。目前，国外对葡萄酒、啤酒已有一定的研究，发现酵母对酒的风味贡献较大，尤其在挥发酸类物质产生方面作用较大，但是对于中国白酒酿造过程中的产挥发酸酵母的筛选及其应用相关的研究几乎没有。因此寻找中国特色白酒酿造过程中特定的产酸酵母，不但能够认识白酒中重要酸类物质的产生来源，而且将这些功能产挥发酸酵母应用于白酒酿造工艺中能够有效提高白酒中酸类呈味物质的含量，对于中国特色白酒的理论发展及白酒酿造工业技术水平的提升都具有极其重要的作用。本发明所筛选获得的酵母是从中国白酒酿造大曲、酒醅、酿造原料或酿造环境中筛选所得，具有耐酸、耐乙醇的性能，产挥发酸能力强，是优良的酿酒用功能菌株。菌株能够有效应用于中国白酒的酿造过程中，有效调控白酒酸度、优化酿造酒生产工艺，降低酿造酒生广成本，提闻白酒品质。
发明内容
( I)要解决的技术问题
本发明要解决的一个技术问题是提供耐酸、耐乙醇的产挥发酸酵母菌株。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种产挥发酸酵母在中国白酒酿造工业中的应用。(2)技术方案
一种中国白酒中耐酸、耐乙醇的产挥发酸的酵母，其分类命名为东方伊萨酵母 (Jssatchenkia or !entails'),该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 4741。所述的东方伊萨酵母CGMCC No. 4741，其耐酸范围为pH2. O 5.0 ;耐乙醇范围为0 15%。所述的东方伊萨酵母CGMCC No. 4741，其产酸为乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸挥发性酸，产总挥发酸浓度为400 600mg/L。该产挥发酸酵母的筛选
取O. 5 5g大曲曲样、酒醅或酿造原料溶于15 150mL无菌生理盐水摇床振荡30 150分钟，再稀释，涂布产酸初筛培养基，挑选周围变黄明显的菌落及产酸显著菌株，再将菌株分别转接于酸性和含乙醇的培养基，摇瓶培养进行复筛，挑选酵母，摇瓶发酵培养，经 HS-SPME-GC-MS测定产酸种类及含量，筛选获得产酸能力强的菌株。产挥发酸初筛培养条件为产酸培养基(g/L):酵母粉2. O、蛋白胨2. O、葡萄糖 40. O、磷酸二氢钾O. 25、氯化钾O. 4、氯化钙O. I、硫酸镁O. I、氯化铁O. 002、硫酸锰O. 002、 溴甲酚绿O. 05、琼脂20. 0，用去离子水配制，调pH5. 0，30°C培养2 5天，根据菌落周围变色圈判断产酸性能。摇瓶发酵培养条件为高粱汁、麦芽汁或YPD发酵培养基，高粱汁或麦芽汁培养基制作方式为20 200g高粱或麦芽样品经粉碎后，加I 4倍体积的水，蒸煮l_5h，呈糊状，冷却后加入糖化酶10 50单位/g样品，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，糖度为1(Γ 5°Βχ，pH为3 5，25 35°C，150rpm,摇瓶培养24 120h。产挥发酸种类及浓度测定采用HS-SPME-GC-MS方法测定，15 mL顶空瓶中加入 5 10 mL澄清发酵液，I 5 g NaCl，以4-甲基-2-戊醇为内标，进行顶空固相微萃取。 顶空固相微萃取的条件为三相(Car/DVB/PDMS)萃取头，60 °C预热5 10 min，萃取吸附 30 50 min, GC 解吸 5 10 min。菌株的耐酸、乙醇性能高粱汁液体培养基中，30°C，静止培养48h。利用酶标仪在 600nm处测定菌浓度，利用无菌水调节OD6citlnm=L O。取50 μ L菌液(OD6tltlnm=L O)于pH I 7、乙醇O 20%梯度YPD培养基中，30°C培养24小时，然后利用酶标仪在600nm处测定菌浓。东方伊萨酵母CGMCC No. 4741在各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒的酿造工业和食品工业中的应用。将用东方伊萨酵母CGMCC No. 4741制成液体或固体等一切形式的微生物菌剂，添加于各类酒及食品酿造过程中进行应用，能够有效增加其在酿造酒中的生物量，并有效协调酿造酒中的酸种类及浓度，最终提高产品的品质。(3)有益效果
本发明所筛选获得的酵母是从中国白酒酿造大曲或酿造酒醅中筛选所得，具有耐酸、 耐乙醇的性能，产挥发酸能力强，是优良的酿酒功能菌株。菌株能够有效应用于中国白酒的酿造过程中，有效调控白酒酸度、优化酿造酒生产工艺，降低酿造酒生产成本，提高白酒品质。生物材料样品保藏一种中国白酒中耐酸、耐乙醇的产挥发酸的酵母，其分类命名为东方伊萨酵母该菌株已保藏于北京中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其保藏编号为 CGMCC No. 4741，保藏日期2011年4月6日。
图I :东方伊萨酵母orientalis)CGMCC No. 4741 细胞形态电镜照片。
具体实施例方式实施例I :
产挥发酸酵母的筛选取O. 5g酒醅溶于20mL无菌生理盐水摇床振荡30分钟，再稀释， 涂布产挥发酸初筛培养基，挑选周围变黄明显的菌落即为产酸显著菌株，再将菌株分别转接于产酸培养基摇瓶培养，经HS-SPME-GC-MS测定产挥发酸种类及含量，筛选获得产挥发 Ife能力强的囷株。产酸初筛培养条件为产酸培养基(g/L):酵母粉2. O、蛋白胨2. O、葡萄糖40. O、磷酸二氢钾O. 25、氯化钾O. 4、氯化钙O. I、硫酸镁O. I、氯化铁O. 002、硫酸锰O. 002、溴甲酚绿
O.05、琼脂20. 0，用去离子水配制，调pH5. 0，30°C培养2 5天，根据菌落周围变色圈判断
产酸性能。摇瓶发酵培养条件为麦芽汁培养基，制作方式为20g麦芽样品经粉碎后，加4倍体积的水，蒸煮5h，呈糊状，冷却后加入50单位/g的糖化酶，于40°C保持2h，过滤、离心所得滤液，糖度为l(Tl5°Bx, pH为5，28°C，150rpm,摇瓶培养48h。实施例2
产挥发酸酵母及其分子生物学鉴定对获得的不同的产挥发酸酵母进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物分别扩增菌株的26srDNA片段，经凝胶电泳检测。随后进行测序比对，确定所筛得酵母的种属。将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母种属及保藏编号东方伊萨酵母ori en tali s ) CGMCC No.4741。实施例3
菌株的耐酸性能实验取一环酵母接种于装有3mL高粱汁液体培养基中，30°C，静止培养48h。利用酶标仪在600nm处测定菌浓度，利用无菌水调节OD6tltol=L O。取50 μ L菌液 (OD600nm=L O)于pH梯度YPD培养基中，30°C培养24小时，然后利用酶标仪在600nm处测定菌浓，菌株生长情况如表I所示。表I菌株耐酸性能(OD600值)
权利要求
1.一种中国白酒中耐酸、耐乙醇的产挥发酸的酵母，其分类命名为东方伊萨酵母 (Jssatchenkia orientalis \该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 4741。
2.如权利要求I所述的东方伊萨酵母CGMCCNo. 4741，其特征在于，耐酸范围为 pH2. O 5. O ;耐乙醇范围为0 15%。
3.如权利要求I所述的东方伊萨酵母CGMCCNo. 4741，其特征在于，产酸为乙酸、丙酸、 丁酸、异丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸挥发性酸，产总挥发酸浓度为400 600mg/L。
4.权利要求I所述的东方伊萨酵母CGMCCNo. 4741的培养方法，其特征在于摇瓶发酵培养条件为高粱汁、麦芽汁或YPD发酵培养基，高粱汁或麦芽汁培养基制作方式为20 200g高粱或麦芽样品经粉碎后，加I 4倍体积的水，蒸煮l_5h，呈糊状，冷却后加入糖化酶10 50单位/g样品，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，糖度为1(Γ 5°Βχ， pH 为 3 5，25 35°C，150rpm,摇瓶培养 24 120h。
5.权利要求I所述的东方伊萨酵母CGMCCNo. 4741的应用，其特征在于在各种酿造酒、 蒸馏酒、配制酒的酿造工业和食品工业中的应用。
6.如权利要求5所述的的应用，其特征在于用东方伊萨酵母CGMCCNo. 4741制成液体或固体的微生物菌剂，添加于各类酒及食品酿造过程中进行应用。
全文摘要
一种中国白酒中耐酸、耐乙醇的产挥发酸的酵母及其应用，属于生物工程技术领域。所述菌株为东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)CGMCCNo.4741。菌株是从中国贵州名酒厂的酿造过程中分离得到，其筛选方法是取曲样、酒醅、酿造原料或酿造环境物质，经过稀释涂布产酸初筛培养基，挑选产酸显著的菌落，摇瓶培养进行复筛。菌株经摇瓶发酵培养，经HS-SPME-GC-MS测定产挥发酸种类及含量，筛选获得产挥发酸能力强的菌株。该菌株可应用于各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒的酿造工业和食品工业中。
文档编号C12G3/02GK102604845SQ20121007968
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者吴群, 徐岩 申请人:江南大学