改良型腈水合酶的制作方法
【专利摘要】本发明提供催化活性提高了的改良型腈水合酶，并且提供编码该改良型腈水合酶的DNA、包含该DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。还提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号50(GX1X2X3X4DX5X6R)所示的氨基酸序列的腈水合酶；X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
【专利说明】改良型腈水合酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及改良型(变异型)腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
【背景技术】
[0002]近年发现了酶腈水合酶、即具有将腈基水合并转换为酰胺基的腈水合活性的酶，公开了使用该酶或含有该酶的微生物菌体等通过腈化合物而制造对应的酰胺化合物的方法。已知该制造方法与现有的化学合成法相比较，由腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。
[0003]作为生产腈水合酶的微生物，可列举出例如:属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) Jl株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献I)。
[0004]另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对生成物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异；嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶中，由立体结构信息预测与底物特异性、热稳定性相关的区域，从中取得底物特异性变化了的变异酶(参照专利文献2~4)。另外，本发明人等得到耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献5~9)。
[0005]在利用酶法工业生产丙烯酰胺方面，从催化剂成本等生产成本的观点等出发，开发催化活性提高的腈水合酶是非 常有用的；从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，尤其期望开发而获得活性提高了的酶。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本专利第3162091号公报
[0009]专利文献2:国际公开第2004/056990号小册子
[0010]专利文献3:日本特开2004-194588号公报
[0011]专利文献4:日本特开2005-16403号公报
[0012]专利文献5:国际公开第2005/116206号小册子
[0013]专利文献6:日本特开2007-143409号公报
[0014]专利文献7:日本特开2007-43910号公报
[0015]专利文献8:日本特开2008-253182号公报
[0016]专利文献9:日本特开2010-172295号公报
【发明内容】
[0017]发明要解决的问题
[0018]因此，本发明的目的在于，通过腈水合酶的改良提供催化活性提高了的改良型腈水合酶。另外，本发明的目的在于提供编码该改良型腈水合酶的DNA、包含该DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。进一步，本发明的目的在于提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。
[0019]用于解决问题的方案
[0020]本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究。结果发现，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，催化活性也提高了 ；至此完成本发明。
[0021]即，本发明如下。
[0022](I) 一种改良型腈水合酶，其具有选自下述(a)~(e)中的至少一种特征。
[0023](a) 一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号50所示的氨基酸序列的腈水合酶；
[0024]GX1X2X3X4DX5X6R (序列号 50)
[0025]G表示甘氨酸，D表示天冬氨酸，R表示精氨酸，W X3> X5> X6分别独立地表示任意的氨基酸残基；
[0026]X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
[0027](b) 一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号81所示的氨基酸序列的腈水合酶；
[0028]WEX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18D (序列号 81)
[0029]W表示色氨酸，E表示谷氨酸，D表示天冬氨酸，X1~X6和X8~X18表示分别独立的任意的氨基酸残基；
[0030]X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
[0031](c) 一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号119所示的氨基酸序列的腈水合酶；
[0032]AX1X2X3X4GX5X6GX7X8 (序列号 119)
[0033]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，X1~X7表示分别独立的任意的氨基酸残基；
[0034]X8为选自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸所组成的组的氨基酸。
[0035](d) 一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶；χ7被置换为不同于野生型的氨基酸；
[0036]AX1X2X3X4GX5X6GX7Q (序列号 132)
[0037]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X6表示分别独立的任意的氨
基酸残基；[0038](e) 一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶；χ9被置换为不同于野生型的氨基酸；
[0039]AX1X2X3X4GX5X6GX7QX8X9 (序列号 136)
[0040]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X8表示分别独立的任意的氨
基酸残基。
[0041](2)根据(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号50的X2 SS(丝氨酸)。
[0042](3)根据⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号50的X1为1(异亮氨酸)，X2为S (丝氨酸)，X3为W (色氨酸)，X5为(K赖氨酸)，X6为S (丝氨酸)。
[0043](4)根据(I)~(3)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号50所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号51所示的氨基酸序列。
[0044](5)根据⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号81的X14SG(甘氨酸)。
[0045](6)根据(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号81的&为6(甘氨酸)，父2为1?(精氨酸)，&为1'(苏氨酸)，X4SU亮氨酸)，&为s(丝氨酸)，&为1(异亮氨酸)，^为仪苏氨酸)，X9SW(色氨酸)，Xltl为M(甲硫氨酸)，XnSH(组氨酸)，\2为L(亮氨酸)，X13为K(赖氨酸)，X14为G(甘氨酸)。
[0046](7)根据(I)、(5)和(6)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号81所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号82所示的氨基酸序列。
[0047](8)根据(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号119的X1为M(甲硫氨酸)，x2Sa(丙氨酸)，x3S s(丝氨酸)，x4Sl(亮氨酸)，x5Sy(酪氨酸)，x6Sa(丙氨酸)，x7为E(谷氨酸)。
[0048](9)根据⑴或⑶所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号119所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号120所示的氨基酸序列。
[0049](10)根据(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ7为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
[0050](11)根据⑴或(10)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号132的&为Μ(甲硫氨酸)，X2SA(丙氨酸)，&为s(丝氨酸)，x4SL(亮氨酸)，&为Υ(酪氨酸)，χ6为Α(丙氨酸)。
[0051](12)根据(I)、(10)和(11)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号131所示的氨基酸序列。
[0052](13)根据⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶，X9为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
[0053](14)根据⑴或(13)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号136的&为Μ(甲硫氨酸)，X2SA(丙氨酸)，&为s(丝氨酸)，x4SL(亮氨酸)，&为Υ(酪氨酸)，χ6为Α(丙氨酸)，X7为Ε(谷氨酸)，X8为Α(丙氨酸)。
[0054](15)根据(I)、(13)和(14)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号135所示的氨基酸序列。
[0055](16)根据⑴~(15)的任一项所述的改良型腈水合酶，前述腈水合酶来源于红球菌属细菌或诺卡氏菌属细菌。
[0056](17) 一种DNA，其编码⑴~(16)的任一项所述的改良型腈水合酶。
[0057](18) 一种DNA，其与(17)所述的DNA在严格的条件下杂交。
[0058](19) 一种重组载体，其包含(17)或(18)所述的DNA。
[0059](20) 一种转化体，其包含(19)所述的重组载体。
[0060](21) 一种腈水合酶，为从培养(20)所述的转化体而得到的培养物中提取的。
[0061](22) 一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养(20)所述的转化体，由得到的培养物提取腈水合酶。
[0062](23) 一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使(I)~(16)的任一项所述的改良型腈水合酶或培养(20)所述的转化体而得到的培养物或者该培养物的处理物与腈化合物接触。
_3] 发明的效果
[0064]本发明能够提供催化活性提高了的、新型的改良型(变异型)腈水合酶。催化活性提高的改良型腈水合酶在酰胺化合物的制造上是非常有用的。
[0065]本发明进一步能够提供编码上述改良型腈水合酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造、以及使用了前述蛋白质(改良型腈水合酶)或者使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的 制造方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0066]图1为质粒pSJ034的结构图。
[0067]图2-1为表示已知的腈水合酶的β亚基的比对结果的图。
[0068]图2-2为表示已知的腈水合酶的β亚基的比对结果的图。
[0069]图3为序列号51所示的、本发明的β亚基的氨基酸序列。
[0070]图4为表示SDS-PAGE的结果的照片。
[0071]图5为质粒pER855A的结构图。
[0072]图6-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
[0073]图6-2为表示与图6-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图6-1的氨基酸序列的序列(C末端侧的一部分)。
[0074]图7为序列号82所示的、本发明的β亚基的氨基酸序列。
[0075]图8-1为表示来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
[0076]图8-2为表示与图8-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图8-1的氨基酸序列的序列。
[0077]图9为序列号121所示的、本发明的α亚基的氨基酸序列。
[0078]图10-1为表示来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
[0079]图10-2为表示与图2-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图10-1的氨基酸序列的序列。
[0080]图11为序列号131所示的、本发明的α亚基的氨基酸序列。
[0081]图12-1为表示来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
[0082]图12-2为表示与图12-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图12_1的氨基酸序列的序列。
[0083]图13为序列号135所示的、本发明的α亚基的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0084]以下，详细地说明本发明。
[0085]1.腈水合酶
[0086](a)已知的腈水合酶
[0087]本发明的改良型腈水合酶为已知的腈水合酶的改良型，对于其来源没有特别地限定。只要是例如:美国国立生物技术信息中心(NCBI !National Center for BiotechnologyInformation)所提供的 Gen Bank数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/query,fcgi ? CMD = search & DB = protein)中登录的腈水合酶或公知文献中记载的腈水合酶，就可以参考。可以例示例如专利文献5~9(通过进行参照而引入本说明书中)所述的腈水合酶。专利文献5~9的腈水合酶具有耐热性、丙烯酰胺耐性，可以通过施加本发明的氨基酸置换而附加催化活性提高的性质。具体而言，可列举出具有序列号53~57的氨基酸序列的腈水合酶。
[0088]另外，对于编码 上述氨基酸序列的基因，使用公知的方法导入变异，通过对具有所希望的性能的变异酶进行评价/选拔，能够得到性能进一步提高的改良酶。具体而言，可列举出具有序列号58~61的氨基酸序列的腈水合酶。
[0089]“腈水合酶”采取由α亚基和β亚基的结构域缔合而成的高级结构，具有非血红素铁原子或非咕啉核钴原子作为辅基。这些腈水合酶分别以铁型腈水合酶和钴型腈水合酶的称呼加以区分。
[0090]作为铁型腈水合酶，可列举出来源于红球菌属Ν-771株的腈水合酶作为其代表例。通过进行X射线结晶结构解析，该铁型腈水合酶的立体结构变得明确。结果，该酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys)(序列号48)中的4个氨基酸残基而与非血红素铁结合。
[0091]作为钴型腈水合酶，可列举出来源于玫瑰色红球菌Jl株(以下有时称为“J1菌”)的钴型腈水合酶，或来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的钴型腈水合酶作为代表例。
[0092]来源于Jl菌的钴型腈水合酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(Cys-Thr-Leu-Cys-Ser-Cys)(序列号49)所示的区域而与钴原子结合。需要说明的是，来源于嗜热假诺卡氏菌的钴型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述来源于Jl菌的半胱氨酸簇中的上游侧(N末端侧)起第4位的半胱氨酸(Cys)为半胱亚磺酸(Csi),最下游侧(C末端侧)的第6位的半胱氨酸(Cys)为半胱次磺酸(Cse)。
[0093]如上所述，辅基与α亚基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”(序列号48、49)所示的区域结合。作为包含这样的辅基结合区域的腈水合酶，可列举出例如:具有来源于玫瑰色红球菌 Jl (FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌M8 (SU1731814)、玫瑰色红球菌M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色红球菌ATCC39484(日本特开2001-292772)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)(日本特开平9-248188)、嗜热假诺卡氏菌(日本特开平9-275978)或热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于上述菌的基因序列所编码的腈水合酶。
[0094]另一方面,认为β亚基的功能涉及结构的稳定性。
[0095]例如:来源于玫瑰色红球菌Jl (FERM ΒΡ-1478)的α亚基的氨基酸序列如序列号4所不、喊基序列如序列号3所不。另外，β亚基的氣基酸序列如序列号2所不、喊基序列如序列号I所示、登录号为“Ρ21220”。另外，来源于玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的α亚基的登录号为“ΑΤΤ79340”，β亚基的登录号为“ΑΑΤ79339”。来源于嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinovorans)MW3的腈水合酶基因的登录号为AJ582605、来源于嗜吡唳红球菌S85-2的臆水合酶基因的登录号为AJ582605、赤红球菌RH (Rhodococcus ruber RH)(CGMCC N0.2380)的腈水合酶基因记载于CN101463358。进而，来源于诺卡氏菌.YS-2002的腈水合酶基因的登录号为“X86737”，来源于诺卡氏菌属JBRs的腈水合酶基因的登录号为“AY141130”。
[0096](b-Ι)改良型腈水合酶(β 48)
[0097]将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的β亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对不于图2_1和图2_2中。需要说明的是，在图2_1、2_2中，各氨基酸序列从上方起依次表不序列号2、5~12和42~47。
[0098]进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号50所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有I个或数个(例如I个~10个左右，优选为I个~5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。
[0099]作为本发明的改良型 腈水合酶的一例，可列举出:如图3所示，β亚基具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第44位~第52位存在有序列号50所示的氨基酸序列。
[0100]实施方式之一中，在具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1^X2、X3、X5、X6分别独立地表示任意的氨基酸残基，X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
[0101]另外，在其他的实施方式中，在具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，XpXyXpX6分别独立地表示任意的氨基酸残基，X2为s(丝氨酸)，x4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
[0102]进一步，其他的实施方式中，具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1为I (异亮氨酸)，X2为S (丝氨酸)，X3为W (色氨酸)，X5为K (赖氨酸)，X6为S (丝氨酸)，χ4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
[0103]作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出:在序列号2所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，β亚基的第48位的氨基酸残基(色氨酸)置换为半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸而成的腈水合酶。
[0104]作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出WP 48C、W0 48D、W0 48E、W0 48Η、 481, we 48K、we 48M、WP 48N、WP 48P、WP 48Q、WP 48S、WP 48T。需要说明的是，氨基
酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“48”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
[0105]具体而言，关于序列号2所表示的β亚基的氨基酸序列，标记为“Wi3 48C”的情况下，意味着β亚基的氨基酸序列(序列号2)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第48位的色氨酸(W)置换为半胱氨酸(C)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
[0106]本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换形式可以分别用以下的I~12的标记表示。
[0107]1.W β 48C
[0108]2.ff^48D
[0109]3.ff^48E
[0110]4.W β 48Η
[0111]5.481
[0112]6.ff^48K
[0113]7.ff^48M
[0114]8.ff^48N
[0115]9.ff^48P
[0116]10.ff^48Q
[0117]11.W β 48S
[0118]12.ff^48T
[0119]作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的方式。
[0120]Wi348C:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为TGC(TGG — TGC)。
[0121]Wi348D:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为GAC (TGG — GAC)。
[0122]Wi348E:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为GAG(TGG — GAG)。
[0123]Wi348F:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为TTC (TGG — TTC)。
[0124]Wi348H:优选将碱 基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为CAC (TGG — CAC)。
[0125]481:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为ATC (TGG — ATC)。[0126]Wi348K:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为AAG (TGG — AAG)。
[0127]Wi348M:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为ATG (TGG — ATG)。
[0128]Wi348N:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为AAC(TGG — AAC)。
[0129]Wi348P:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为CCG(TGG — CCG)。
[0130]Wi348Q:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为CAG(TGG — CAG)。
[0131]Wi348S:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为TCC(TGG — TCC)。
[0132]Wi348T:优选将碱基序列TGG(位于序列号I中的第142~144位)置换为ACC(TGG — ACC)。
[0133](b-2)改良型腈水合酶(β 37)
[0134]将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的β亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图6-1和图6-2中。需要说明的是，在图6-1、6-2中，各氨基酸序列从上方起依次表不序列号2、5~12和42~49。
[0135]进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号81所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸 序列中缺失、置换和/或附加有I个或数个(例如I个~10个左右，优选为I个~5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。
[0136]作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出:如图7所示，β亚基具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第29位~第49位存在有序列号81所示的氨基酸序列。
[0137]实施方式之一中，在具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1~X6和X8~X18表示分别独立的任意的氨基酸残基，X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
[0138]另外，其他的实施方式中，在具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1~X6、X8~X13和X15~X18表示分别独立的任意的氨基酸残基，X14为G(甘氨酸)，X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的
氨基酸。
[0139]进一步，其他的实施方式中，在具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X15~X18表示分别独立的任意的氨基酸残基，X1为G(甘氨酸)，X2为R(精氨酸)，X3为T(苏氨酸)，Χ4为L(亮氨酸)，X5为S(丝氨酸)，X6为I (异亮氨酸)，X8为T(苏氨酸)，X9为W(色氨酸)，Xltl为M(甲硫氨酸)，X11为H(组氨酸)，X12为L(亮氨酸)，X13为K(赖氨酸)，X14为G(甘氨酸)，X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
[0140]作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出:在序列号2所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，β亚基的第37位的氨基酸残基(亮氨酸)置换为丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸而成的腈水合酶。
[0141]作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出:Li3 37A、L0 37D、L0 37F、L3 371、LP 37M、37T、37V。需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“37”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
[0142]具体而言，关于序列号2所表示的β亚基的氨基酸序列，标记为“Li3 37Α”的情况下，意味着β亚基的氨基酸序列(序列号2)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第37位的亮氨酸(L)被置换为丙氨酸(A)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
[0143]本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换的形式可以分别用以下的I~7的标记表示。
[0144]1.37Α
[0145]2.L3 37D
[0146]3.L3 37F
[0147]4.L β 371
[0148]5.L3 37M
[0149]6.L3 37T
[0150]7.37V
[0151]作为用于产生上述 氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的表1所示的方式。
[0152][表 I]
[0153]
【权利要求】
1.一种改良型腈水合酶，其具有选自下述(a)~(e)中的至少一种特征: (a)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号50所示的氨基酸序列的腈水合酶；
序列号 50 =GX1X2X3X4DX5X6R G表示甘氨酸，D表示天冬氨酸，R表示精氨酸，X1^ X2> X3、X5、X6分别独立地表示任意的氣基酸残基； X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸； (b)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号81所示的氨基酸序列的腈水合酶；
序列号 81 =WEX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14X15X16X17X18D W表不色氨酸，E表不谷氨酸，D表不天冬氨酸，X1~X6和X8~X18表不分别独立的任意的氣基酸残基； X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸； (C) 一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号119所示的氨基酸序列的腈水合酶；
序列号 119 =AX1X2X3X4GX5X6GX7X8` A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，X1~X7表示分别独立的任意的氨基酸残基； X8为选自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸所组成的组的氨基酸； (d)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ7被置换为不同于野生型的氨基酸；
序列号 132 =AX1X2X3X4GX5X6GX7Q A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X6表示分别独立的任意的氨基酸残基; (e)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ9被置换为不同于野生型的氨基酸；
序列号 136 =AX1X2X3X4GX5X6GX7QX8X9 A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X8表示分别独立的任意的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号50的X2为S、即丝氨酸。
3.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号50的X1为1、即异亮氨酸，X2为S、即丝氨酸，X3为W、即色氨酸，X5为K、即赖氨酸，X6为S、即丝氨酸。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列号50所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号51所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号81的X14SG、即甘氨酸。
6.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号81的X1SG、即甘氨酸，X2为R、即精氨酸，X3为T、即苏氨酸，X4为L、即亮氨酸，X5为S、即丝氨酸，X6为1、即异亮氨酸，X8为T、即苏氨酸，X9为W、即色氨酸，X10为M、即甲硫氨酸，X11为H、即组氨酸，X12为L、即亮氨酸，X13为K、即赖氨酸，X14为G、即甘氨酸。
7.根据权利要求1、5和6的任一项所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列号81所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号82所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号119的X1为1即甲硫氨酸，X2为A、即丙氨酸，X3为S、即丝氨酸，X4为L、即亮氨酸，X5为Y、即酪氨酸，X6为A、即丙氨酸，X7 SE、即谷氨酸。
9.根据权利要求1或8所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列号119所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号120所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ7为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
11.根据权利要求1或10所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号132的X1为Μ、即甲硫氨酸，X2为Α、即丙氨酸，X3为S、即丝氨酸，X4为L、即亮氨酸，X5为Y、即酪氨酸，X6为Α、即丙氨酸。
12.根据权利要求1、10和11的任一项所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号131所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ9为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
14.根据权利要求1或13所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号136的X1为Μ、即甲硫氨酸，X2为Α、即丙氨酸，X3为S、即丝氨酸，X4为L、即亮氨酸，X5为Y、即酪氨酸，X6为Α、即丙氨酸，X7为Ε、即谷氨酸，X8为Α、即丙氨酸。
15.根据权利要求1、13和14的任一项所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号135所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1~15的任一项所述的改良型腈水合酶，其中，所述腈水合酶来源于红球菌属(Rhodococcus)细菌或诺卡氏菌属(nocardia)细菌。
17.—种DNA,其编码权利要求1~16的任一项所述的改良型腈水合酶。
18.一种DNA，其与权利要求17所述的DNA在严格的条件下杂交。
19.一种重组载体，其包含权利要求17或18所述的DNA。
20.一种转化体，其包含权利要求19所述的重组载体。
21.一种腈水合酶，是从培养权利要求20所述的转化体而得到的培养物中提取的。
22.—种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求20所述的转化体，由得到的培养物提取腈水合酶。
23.一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使权利要求1~16的任一项所述的改良型腈水合酶或培养权利要求20所述的转化体而得到的培养物或者该培养物的处理物与腈化合物接触。
【文档编号】C12N1/19GK103635574SQ201280028338
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2011年6月7日
【发明者】渡边文昭, 原爱, 安保贵永, 北原彩 申请人:三菱丽阳株式会社