能耐受氰化物的腈水合酶的制作方法

专利名称：能耐受氰化物的腈水合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及能耐受氰化物的腈水合酶，特别是来自具有增强的氰化物耐受性的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或边缘假单胞菌(Pseudomonas marinalis)菌株的，涉及在有氰化物存在下，它们在从腈制备酰胺中的应用，和编码这些酶的多核苷酸序列。
使用腈水合酶将α-羟基腈(氰腈)和α-氨基腈转化成对应的酰胺，构成合成α-羟酸和α-氨基酸的新方案，因为可以以简单的方式皂化α-羟基酰胺和α-氨基酰胺(Process and catalysts for the productionof methionine.Ponceblanc，Herve；Rossi，Jean-Christophe；Laval，Philip；Gros，Georges.(Rhone-Poulenc Animal NutritionSA，Fr.)，(WO 2001060789)。备选地，α-羟基酰胺也可以与碱金属或碱土金属氢氧化物反应，产生对应的羟酸盐。在这方面，特别优选的反应是4-甲硫基-α-羟基丁酰胺(MHA-酰胺)与氢氧化钙的反应，因为可以直接使用钙-MHA作为甲硫氨酸或MHA的产物替代形式作为饲料添加剂。
但是，α-羟基腈和α-氨基腈能容易地分别分解成醛和氢氰酸或醛、氢氰酸和铵。产生的氢氰酸是几乎所有已知腈水合酶的强抑制剂，例外是来自马红球菌(Rhodococcus equi)XL-1的腈水合酶，其在20mM氰化物时，表现出迄今已知的活性的最小损失(Production ofamides from nitriles by Rhodococcus equi cells having a cyanideresistant-nitrile hydratase.Nagasawa，Tohru；Matsuyama，Akinobu.(Daicel Chemical Industries，Ltd.，Japan)，(EP 1 266962 A)。
约8g酰胺/g静止细胞干生物量的低产量，43小时的长反应时间，和相对较低的产物浓度75g/l，导致对改良的腈水合酶的寻求。
因此，本文所述的发明的目的是，提供一种生物催化剂，其不受这些限制。另外，该生物催化剂对氰化物的更强的耐受性是有利的，因为制备了α-羟基腈和α-氨基腈，为确保醛的迅速且彻底的反应，优选地使用1-3％过量的氢氰酸，其中的一部分保留在产物中。因而，在生物转化过程中，氰化物浓度可能超过20mM。副产物和试剂如作为辅助碱使用的胺同样不允许抑制腈水合酶活性。
本发明的一个目的是，提供腈水合酶，其在将腈转化成酰胺的过程中，对存在于反应溶液中的氰离子具有增强的稳定性。
本发明涉及分离的多核苷酸，尤其是来自假单胞菌属的微生物的，其编码与包含在序列SEQ ID NO2，3，5，7，8，10中的氨基酸序列90-100％一致的氨基酸序列的多肽，其中包含序列SEQ ID NO2，3，5或7，8，10的多肽，在每种情况下，都具有能耐受氰化物的腈水合酶的活性，或能形成这种腈水合酶。
多核苷酸优选地源自恶臭假单胞菌或边缘假单胞菌。
本发明还涉及选自下组的多核苷酸a)多核苷酸，其包含来自SEQ ID NO1，4，6，9的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，或由其组成，b)多核苷酸，其在遗传密码的简并性范围内，包含与a)的序列相对应的核苷酸序列，c)多核苷酸，其包含如a)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列包含功能上中性的有义突变，d)多核苷酸，其能在严格条件下，与a)或c)的互补序列杂交，其中该多核苷酸编码耐受氰化物的腈水合酶。
本发明也涉及这些多核苷酸编码的多肽，其具有序列SEQ ID NO2，3，5或7，8，10，具有来自假单胞菌属微生物的耐受氰化物的腈水合酶的活性，其可以在微生物中富集，或以分离的形式存在。SEQ IDNO2和7编码腈水合酶的α-亚基，SEQ ID NO3和8编码腈水合酶的β-亚基，SEQ ID NO5和10编码激活蛋白，所述激活蛋白的共表达是腈水合酶活性所必需的(Nojiri等，1999，Journal ofBiochemistry，125696-704)。
优选地，根据本发明使用已经用本发明的多核苷酸转化或转染的宿主细胞。
宿主细胞可以考虑已知其稳定的表达系统的真核细胞或原核细胞，更具体地，优选地使用的宿主生物是其中存在表达系统的微生物，例如假单胞菌属、毕赤酵母属、各种酵母、Saccaromyces、曲霉属或链霉菌科，尤其大肠杆菌。红球菌属的微生物也是合适的。
通过已知的转化或转染技术，可以将载体DNA导入真核或原核细胞。
“转化”、“转染”、“接合”和“转导”涉及现有技术已知的用于导入外来DNA的方法。
本发明也涉及多核苷酸，其基本上由一个多核苷酸序列组成，后者可以通过下述方法得到通过含有完整基因或其一部分的边缘假单胞菌或恶臭假单胞菌的相应基因库与包含根据本发明的来自SEQ IDNo1，4或6，9的多核苷酸序列或其片段的探针杂交来进行筛选，并分离所述多核苷酸序列。
根据本发明含有序列的多核苷酸适合用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以便分离编码本发明的蛋白的全长核酸和多核苷酸或基因，或用于分离其序列具有与本发明的基因序列高度相似性的核酸和多核苷酸或基因。它们也可以作为探针，应用于所谓的“阵列”、“微阵列”或“DNA芯片”，用于检测和确定对应多核苷酸或源自它们的序列，例如RNA或cDNA。
根据本发明含有序列的多核苷酸也适合用作引物，其可以与聚合酶链反应(PCR)一起，辅助制备编码本发明的蛋白的基因的DNA。
这些用作探针或引物的寡核苷酸含有至少25或30、优选至少20、非常特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸长度的寡核苷酸同样适用。视情况，具有至少100，150，200，250或300个核苷酸的寡核苷酸也适用。
“分离”指从它的自然环境分离。
通常，“多核苷酸”指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。
本发明的多核苷酸包括如SEQ ID No.1，4，6，9所述的多核苷酸，或其中包含的片段，以及与SEQ ID No.1，4，6，9的多核苷酸或其中包含的片段至少90％，93％，95％，97％或99％一致的那些。
“多肽”指含有2个或多个通过肽键相连的氨基酸的肽或蛋白。
本发明的多肽包括序列SEQ ID NO2，3，5，7，8，10的多肽，以及与序列SEQ ID NO2，3，5，7，8，10的多肽至少90％、特别优选至少91％，95％，97％或99％一致的多肽。
然后，使用已知的算法或序列分析程序，例如Staden(NucleicAcids Research 14，217-232(1986))的，von Marck(Nucleic AcidsResearch 16，1829-1836(1988))的，或Butler(Methods ofBiochemical Analysis 39，74-97(1998))的GCG程序，可以检查从需要的基因库得到的DNA序列。
通过遗传密码的简并性，从SEQ ID No.1，4，6，9包含的序列产生的编码DNA序列，同样会形成本发明的一个方面。以相同的方式，与这些序列或其一部分杂交的DNA序列，是本发明的一个方面。而且，本领域中已知，蛋白中的保守氨基酸取代，例如用丙氨酸替代甘氨酸，或用谷氨酸替代天门冬氨酸，是“有义突变”，其不会导致蛋白活性的根本变化，即是功能中性的。还已知，蛋白的N末端和/或C末端的变化，不会显著损害或者甚至会稳定它的功能。尤其在Ben-Bassat等(Journal of Bacteriology 169751-757(1987))，O’Regan等(Gene77237-251(1989))，Sahin-Toth等(Protein Sciences 3240-247(1994))，和Hochuli等(Bio/Technology 61321-1325(1988))和已知的遗传学和分子生物学教科书中，本领域的技术人员可以发现这方面的细节。
最后，使用源自SEQ ID NO1，4，6，9的引物，通过聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列，也是本发明的一个方面。这些寡核苷酸典型地具有至少15、尤其是20、30或40个核苷酸的长度。
尤其在Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，Germany，1993)的手册“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”和Liebl等(International Journal of Systematic Bacteriology(1991)41255-260)中，可以发现关于通过杂交鉴别DNA序列的说明。杂交在严格条件下进行，即仅仅形成这样的杂合体，其中探针和靶序列(即用该探针处理的多核苷酸)是至少90％一致的。已知通过改变缓冲液组成、温度和盐浓度，可以影响或决定杂交的严格性，包括洗涤步骤。优选地，以与洗涤步骤相比相对较低的严格性，进行杂交反应(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，可以使用5×SSC缓冲液，在约50℃-68℃的温度，进行杂交反应。在该情况下，探针也可以与能表现出与探针序列小于70％一致性的多核苷酸杂交。这样的杂合体不太稳定，可以通过在严格条件下洗涤来去除。这可以如下实现例如，通过将盐浓度降低至2×SSC，视情况，随后降至0.5×SSC(The DIG System User’s Guide for FilterHybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，将温度设定在约50℃-68℃。视情况，可以将盐浓度降低至0.1×SSC。通过以约1-2℃的步长，使杂交温度从50℃逐步增加至68℃，可以分离与采用的探针序列具有例如至少90％-95％一致性的多核苷酸片段。可以以试剂盒的形式，在市场上得到其它杂交说明(例如RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany供应的DIG Easy Hyb，目录号1603558)。
尤其在Gait的手册Oligonukleotide synthesisA PracticalApproach(IRL Press，Oxford，UK，1984)和in Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中，本领域的技术人员可以发现在聚合酶链反应(PCR)的辅助下扩增DNA序列的说明。
通常，该方法是，将能高水平表达的基因克隆进具有低拷贝数的载体中，将具有较低表达效率的基因克隆进具有更高拷贝数和/或强启动子的载体中。用这些载体转化宿主细胞，以便使它们在每种情况下，与起始生物相比，都含有能编码形成腈水合酶的核苷酸序列的至少一个额外的拷贝。
以该方式制备的转化的或重组的微生物，特别是假单胞菌属，同样是本发明的一部分。
已经发现，在微生物中增强编码本发明的腈水合酶和辅助蛋白P47K的基因，会导致腈水合酶的生产提高，或者还导致腈水合酶的活性提高。
在这方面，术语“增强”描述了在微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性的增加，这可以如下实现例如，增加该一个或多个基因的拷贝数，使用强启动子，或使用编码具有高活性的对应酶的基因，和视需要组合这些方法。
为了实现过表达，可以突变位于结构基因上游的启动子区和调节区或核糖体结合位点。整合在结构基因上游的表达盒以相同的方式起作用。另外，使用诱导型启动子，可以增加氨基酸发酵生产过程中的表达。通过用于延长m-RNA的寿命的方式同样提高表达。
另外，通过预防酶蛋白的降解同样增强酶活性。基因或基因构建体可以存在于具有不同拷贝数的质粒中或可以整合在染色体中并扩增。备选地，通过改变培养基的组成和培养操作可以实现相关基因的过表达。
本发明也涉及1)从腈酶促制备酰胺的方法，其包含下述步骤a)使用具有腈水合酶活性的微生物酶，转化包含一个或多个腈基团的化合物，和
b)去除形成的酰胺，其中c)本发明的腈水合酶用于将腈转化成酰胺。在有20mM(mM＝mmol/l)氰离子存在下，在20℃转化甲基丙烯腈30min后，其剩余活性优选相对于在没有氰离子、其它条件都相同时用相同酶进行转化的剩余活性的至少90％。
2)根据1)的方法，其特征在于，在有50mM氰离子存在下，转化后的剩余活性是至少60％。
3)根据1)或2)的方法，其特征在于，使用能生产和含有该酶的微生物，或其裂解产物。
4)根据3)的方法，其特征在于，使用微生物的静止细胞。
5)根据1)或2)的方法，其特征在于，使用纯化的酶。
6)根据1)-5)的方法，其特征在于，该酶源自假单胞菌属的微生物，尤其是恶臭假单胞菌或边缘假单胞菌，7)根据6)的方法，其特征在于，该酶源自在保藏号DSM 16275和DSM 16276下保藏的假单胞菌属的微生物，且其具有序列SEQ ID NO2，3，5，7，8，10的氨基酸序列。
8)根据第1)-7)点中的一项或多项的方法，其特征在于，将下述通式的化合物转化成对应的酰胺 R″-CN (II)其中含义是XOH，H，具有1-4个C原子的烷基，NH2；RH，任选地被NH2取代的、分支的或不分支的、具有1-12个C原子的饱和的烷基，分支的或不分支的、具有双键和1-12个C原子的不饱和烷基，具有3-6个C原子的环烷基，用烷硫基取代的亚烷基，其中烷基对应着C1-C3基团，且亚烷基对应着双价的C3-C8-基团，R′H，如果R不是H，具有1-3个C原子的烷基，R″单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地被1个或2个烷基(C1-C3)，Cl，Br，F取代；具有1-6个C原子的单价烷基腈基团。
9)根据8)的方法，其特征在于，在有氢氰酸或氢氰酸盐存在下，转化通式(I)的化合物。
10)根据9)的方法，其特征在于，在有0.1mol％氰化物-3mol％氰化物(基于使用的腈)、优选地＞2-3mol％存在下，进行转化。这对应着当1mol的腈的情形下，3mol％为30mMol氰化物的终浓度。
11)根据第1)-10)点中的一项或多项的方法，其特征在于，使用甲硫氨酸腈作为腈。
12)根据第1)-10)点中的一项或多项的方法，其特征在于，使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为腈。
优选地，使用如在有根据现有技术的辅助碱例如三乙胺存在下，反应氢氰酸、3-甲硫基丙醛得到的反应混合物。
有利地，可以不经纯化地使用。
这暗示着本发明的酶对醛和胺的额外的稳定性。
13)一种方法，其中使用2-羟基-2-甲基丙腈作为甲基丙烯酰胺的前体。
14)本发明也涉及分离的和纯化的假单胞菌属微生物，其在保藏号DSM 16275(MA32，边缘假单胞菌)和DSM 16276(MA113，恶臭假单胞菌)下保藏，和15)从假单胞菌属菌株、尤其从在保藏号DSM 16275和DSM 16276下保藏的恶臭假单胞菌和边缘假单胞菌菌株分离的能耐受氰化物的腈水合酶。
根据布达佩斯条约，于2004年3月9日保藏在DSMZ，DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkul turen in Braunschweig。
该菌株特别适用于生产本发明的酶。
“分离的和纯化的微生物”指以比天然发现的浓度更高的浓度存在的微生物。
本发明也涉及制备如上所述的能耐受氰化物的腈水合酶的方法，其中a)在能在微生物中形成酶的条件下，发酵能生产该腈水合酶的微生物，尤其是边缘假单胞菌或恶臭假单胞菌，和b)在结束对数生长期后，尽早收获细胞，随后，采用a)静止细胞形式的包含该酶的微生物，在适当时，在增加细胞膜的渗透性后，或b)细胞的裂解物，或c)使用已知方法，从微生物细胞分离的酶，进行根据本发明的腈向酰胺的转化。
腈水合酶可以是用非重组微生物产生的酶，或重组地产生的酶。
另外，本发明涉及重组制备本发明的多肽的方法，其中，培养能生产这些多肽的微生物，视情况，诱导有关多核苷酸的表达，且视情况，从培养物分离酶。
通常，该方法是这样的，其中a)发酵微生物，尤其是边缘假单胞菌或恶臭假单胞菌，其中增强、尤其重组地过表达从假单胞菌科微生物分离的多核苷酸，其能编码具有与包含在SEQ ID NO2，3和5或7，8和10中的序列的氨基酸序列90-100％一致的氨基酸序列的多肽，其中该多肽在每种情况下共同地具有能耐受氰化物的腈水合酶的活性，
b)视情况，从这些微生物分离具有腈水合酶活性的酶，或制备包含该酶的蛋白级分，和c)将根据a)的微生物或根据b)的酶或包含后者的级分，转移进介质，其包含具有通式(I)和(II)的腈基团的化合物。
使用的培养基必须合适地满足每种情况下菌株的要求。培养不同微生物的培养基的描述，见美国细菌学学会(Washington D.C.，USA，1981)出版的手册“Manual of Methods for General Bacteriology”。
可以使用的碳源是糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇例如甘油和乙醇，和有机酸例如乙酸。这些物质可以单独地或作为混合物使用。
作为氮源可以有利地使用有机腈或酰胺如乙腈、乙酰胺、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、异丁腈、异丁酰胺或尿素，还可以与其它含氮化合物组合，如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽浸膏、玉米浆、豆粉和或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。可以单独地或作为混合物使用这些氮源。
可以使用的磷源是磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。另外，培养基必须含有生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质外，可以采用基本的生长物质如氨基酸和维生素。上述原料可以以仅仅一次的混合物形式加入培养基，或以合适的方式，在培养过程中补料。
以合适的方式，使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物，例如磷酸或硫酸，控制培养物的pH。可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，控制泡沫形成。通过将氧或含氧的气体混合物(例如空气)导入培养物，以维持有氧条件。培养温度通常是10℃-40℃，优选10℃-30℃。连续培养，直到已经经过对数生长期。该目的通常在10小时-70小时内实现。此后，优选地收获细胞，洗涤，并转入pH6-9、尤其是6.8-7.9的缓冲液中，制成悬浮液。静止浓度通常是1-25％、尤其是1.5-15％(湿重/体积)。使用物理或化学方法，例如用Wilms等，J.Biotechnol.，Vol 86(2001)，19-30所述的甲苯，可以增加细胞的渗透性，以便使要转化的腈可以穿透细胞壁，且酰胺可以离开。
优选地，转化下述腈饱和的单腈乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈、戊腈、异戊腈和己腈，饱和的二腈丙二腈、丁二腈、戊二腈和己二腈，芳族未取代的和取代的单腈和二腈苯基腈、2，6-二氟苯基腈、邻苯二腈、间苯二腈和对苯二腈，α-氨基腈α-氨基丙腈，α-氨基甲硫基丁腈，α-氨基丁腈，氨基乙腈，所有天然氨基酸衍生的腈，α-氨基-3，3-二甲基丙腈和α-氨基-2，3-二甲基丙腈含有羧基的腈氰基乙酸β-氨基腈氨基-3-丙腈不饱和的腈丙烯腈、甲基丙烯腈、烯丙基腈和丁烯腈α-羟基腈α-羟基-正丙腈、α-羟基-正丁腈、α-羟基异丁腈、α-羟基-正己腈、α-羟基-正庚腈、α-羟基-正辛腈、α，γ-二羟基-β，β-二甲基丁腈、丙烯醛氰腈、甲基丙烯醛氰腈、3-氯乙腈、4-甲硫基-α-羟基丁腈和α-羟基-苯基丙酰。
要转化的腈在反应溶液中的浓度，不限于特定范围。
为了避免酶活性受到底物的抑制，通常将腈的浓度保持在0.02-10w/w％、尤其是0.1-2w/w％，基于作为干细胞量(Zellmasse)的生物催化剂的量。可以在反应开始时，加入所有底物，或在反应过程中，连续地或不连续地加入底物。
使用MA45湿度分析仪(Sartorius)，确定干重。
如果腈化合物在水性反应系统中的溶解度太低，可以加入增溶剂。
但是，作为替代方案，可以在水/有机溶剂两相系统中进行反应。
当将微生物细胞用作酶活性材料时，采用的细胞的量相对于底物量优选地是0.02-10w/w％，作为干细胞量。
也可以使用众所周知的技术，固定化分离的酶，然后采用该形式的酶。
通常，在-5℃至50℃、尤其是0℃至30℃的温度，反应0.1-100小时。
要维持的反应混合物的pH不限于特定值，只要酶活性不受损害即可。转化后，可以以已知的方式，从反应溶液中取出形成的酰胺，并纯化。
本发明也涉及一种方法，其中，从例如生物量的细胞分离酰胺或含有酰胺的溶液，并将酰胺皂化产生对应的酸，或在有加入的碱金属或碱土金属氢氧化物存在下，转化成对应的酸盐。优选地，用氢氧化钙皂化MHA-酰胺，并分离对应的钙盐。
实施例实施例1培养条件在30℃、摇动下，在5ml体积的玻璃试管中，培养预培养物24h。用1ml预培养物接种100ml主培养物，并在25℃，在1000ml总体积的锥形瓶中摇动42h。

实施例2微生物的分离和鉴别通过检测在有2mM氰化钾存在下，静止细胞的腈水合酶活性，选择2个菌株MA32和MA113。
MA32的性质细胞形状 小棒宽度 0.6-0.8μm长度 1.5-3.0μm活动力+鞭毛 极性＞1革兰氏反应-被3％KOH裂解+氨肽酶(Cerny) +氧化酶+过氧化氢酶+在41℃生长-底物利用己二酸盐 -柠檬酸盐 +苹果酸盐 +苯乙酸盐 -D-葡萄糖 +麦芽糖-甘露醇+阿拉伯糖 +甘露糖+海藻糖+山梨糖醇 +
硝酸戊四醇酯+柠康酸盐+肌醇+ADH +脲酶-明胶的水解 +七叶灵的水解+来自蔗糖的果聚糖+反硝化作用 +卵磷脂酶+荧光+绿脓菌素-细胞脂肪酸的特征是典型的I组假单胞菌。
16SrRNA的484碱基对长片段的分析，揭示了与边缘假单胞菌的序列100％的一致。
考虑所有的数据，可以将MA32鉴别为边缘假单胞菌。
MA113的性质细胞形状 小棒宽度 0.6-0.8μm长度 1.5-3.0μm活动力+鞭毛 极性＞1革兰氏反应-被3％KOH裂解+氨肽酶(Cerny) +氧化酶+
过氧化氢酶 +在41℃生长 -底物利用己二酸盐-柠檬酸盐+苹果酸盐+苯乙酸盐+D-葡萄糖+麦芽糖 -甘露醇 -阿拉伯糖-甘露糖 -海藻糖 -肌醇-β-丙氨酸 +α-酮戊二酸盐 +苄胺+马尿酸盐+壬二酸盐+D-扁桃酸盐 +ADH +脲酶-明胶的水解 -七叶灵的水解-来自蔗糖的果聚糖-反硝化作用 -卵磷脂酶-荧光+
绿脓菌素-细胞脂肪酸的特征是典型的I组假单胞菌。
16S rRNA的476碱基对长片段的分析，揭示了与恶臭假单胞菌的序列100％的一致。
考虑所有的数据，可以将MA113鉴别为恶臭假单胞菌。
实施例3酶活性的测定如实施例1所述，培养细胞，通过离心从培养基中分离，并重新悬浮于标准缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5)。将50μl细胞悬浮液加700μl标准缓冲液，并加入250μl 200mM腈在标准缓冲液中的溶液启动反应。在这方面，测量细胞悬浮液中的细胞浓度，以便在20℃、10min后，转化5-30％的腈。在20℃、10min后，通过加入20μl半浓缩的磷酸终止反应，并通过离心分离细胞。
将一单位(U)的活性定义为，能在1分钟内将1μmol甲基丙烯腈转化成酰胺的酶的量。如果除了酰胺外，还生成酸，将一单位(U)定义为，能在1分钟内将1μmol甲基丙烯腈转化成酰胺和酸的酶的量。
菌株MA32和MA113的相对活性显示在

图1和图2中。
实施例4氰化物对腈水合酶活性的影响将50μl以类似于实施例3的方式制备的细胞悬浮液加入700μl标准缓冲液，其包含0、21.4、53.6和107.1mM氰化钾(终浓度0、20、50、100mM氰化物)。通过加入200μl 200mM腈在标准缓冲液中的溶液开始反应，其在每种情况下，具有与剩余的反应溶液中相同的氰化物浓度。在该情况下，细胞悬浮液中的细胞浓度是，在20℃、10min后，在没有氰化物时，混合物中的腈被16％转化。在20℃、10min后，通过加入20μl半浓缩的磷酸终止反应，并以类似于实施例2的方式测定转化。
随氰化物浓度而变化的转化甲基丙烯腈的相对活性，显示在图3和图4。
实施例5用边缘假单胞菌MA32的静止细胞转化2-甲基2-羟基丙腈如实施例1所述培养边缘假单胞菌MA32细胞，并离心。用pH 8.0的50mM磷酸钾缓冲液，稀释包含1.16g干生物量的细胞量至50ml终体积。另外，将0.02mM 2-甲基-1-丙烷二羟基硼(propaneboronicacid)加入反应混合物。在4℃，在剧烈搅拌下，以在反应过程中的任何时间的浓度都不超过5g/l的速度，连续加入新蒸馏的2-甲基2-羟基丙腈。将pH维持恒定在7.5。如实施例3所述，通过HPLC，监视反应。140min后，10.0g腈已经完全转化成10.7g酰胺和1.4g酸。
图5描述了用菌株MA113实现的反应的时间进程。
实施例6用边缘假单胞菌MA32的静止细胞转化粗MHA-腈如实施例1所述培养边缘假单胞菌MA32细胞，并离心。用pH 8.0的50mM磷酸钾缓冲液，稀释包含0.34g干生物量的细胞量至70ml终体积。另外，将0.02mM 2-甲基-1-丙烷二羟基硼加入反应混合物。在4℃，在剧烈搅拌下，以在反应过程中的任何时间的浓度都不超过10g/l的速度，连续加入粗MHA-腈。将pH维持恒定在8.0。如实施例2所述，通过HPLC，监视反应。510min后，10.05g腈已经完全转化成11.13g酰胺和0.31g酸。这对应着139g酰胺/l的终浓度。
已经从3-甲硫基丙醛和轻微过量的氢氰酸，直接制备了MHA腈。50mM该MHA-腈在水中的溶液含有0.5mM氰化物(Spektroquant，Merck)。
图6描述了用菌株MA32实现的反应的时间进程。
实施例7从边缘假单胞菌MA 32克隆腈水合酶基因簇和构建表达载体使用导入了限制酶NdeI和HindIII的剪切位点的引物1F和1R，通过PCR，扩增腈水合酶的基因簇，该酶包含α-亚基、β-亚基和腈水合酶激活蛋白，它们的共表达是腈水合酶的活性所必需的(Nojiri等，1999，Journal of Biochemistry，125696-704)。将以该方式得到的PCR产物连接进用NdeI和HindIII切口的载体，导入的基因在鼠李糖启动子的控制下。以该方式生产的表达载体称作pKE31。
图7给出了限制图谱，SEQ ID NO1给出了序列。
将表达质粒转化进大肠杆菌菌株DSM 14459，其于2001年8月22日保藏在Deutschen Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)。
引物
1FSEQ ID NO11
1RSEQ ID NO12基因位于SEQ ID NO1的下述片段α-亚基的基因 核苷酸25-609β-亚基的基因 核苷酸650-1312激活蛋白的基因核苷酸1309-2577实施例8从恶臭假单胞菌MA113克隆腈水合酶基因簇使用引物1F和1R，通过PCR扩增腈水合酶的基因簇，该酶包含α-亚基、β-亚基和腈水合酶激活蛋白，它们的共表达是腈水合酶的活性所必需的(Nojiri等，1999，Journal of Biochemistry，125696-704)序列见SEQ ID NO6。
引物
2FSEQ ID NO132RSEQ ID NO14基因位于SEQ ID NO5的下述片段α-亚基的基因 核苷酸1-582β-亚基的基因 核苷酸624-1286激活蛋白的基因核苷酸1283-2360实施例9在大肠杆菌DSM 14459中异源表达来自边缘假单胞菌MA 32的腈水合酶大肠杆菌DSM 14559的保藏与DE 101 55 928相关。
在37℃、摇动下，在含有2mM柠檬酸铁(III)和100μg/ml氨苄西林的LB培养基(LB Bouillon nach，Miller，VWR)中，培养用pKE31转化的细胞。12-16小时后，将预备培养物接种进主培养物中，使后者具有0.1的OD600。尽管主培养物的培养基与预培养物的培养基相对应，它另外含有2g/l L-鼠李糖。在30℃培养22小时后，收获细胞。
实施例10酶活性的测定如实施例9和实施例3所述培养细胞和测定活性。
用质粒pKE31转化的大肠杆菌菌株DSM 14459细胞具有17U/mgDBM的比活。
实施例11测定在有100mM氰化钾存在下的酶活性如实施例9和实施例4所述，培养细胞和测定在有100mM氰化钾存在下的活性。
用质粒pKE31转化的大肠杆菌菌株DSM 14459细胞具有11U/mgDBM的比活。
根据布达佩斯特条约的用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏国际表格Degussa AGProjekthaus BiotechnologieRodenbacher Chaussee63457Hanau依据条例7.1由下述国际保藏单位出具的第一次保藏的接收证明
根据布达佩斯特条约的用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏国际表格Degussa AGProjekthaus BiotechnologieRodenbacher Chaussee63457Hanau依据条例10.2由下述国际保藏单位出具的存活证明




VOM ANMELDEAMT AUSZUFLLEN
VOM INTERNATIONALEN BRO AUSZUFLLEN
序列表<110>Degussa AG<120>氰化物耐受的腈水合物<130>040061<160>14<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>6828<212>DNA<213>边缘假单胞菌<220>
<221>CDS<222>(25)..(609)<223>α-亚基的编码区基因<220>
<221>CDS<222>(650)..(1312)<223>β-亚基的编码区基因<220>
<221>基因<222>(1309)..(2577)<223>激活子蛋白的基因<400>1aattcttaag aaggagatat acat atg agt aca gct act tca acg ccc ggc 51Met Ser Thr Ala Thr Ser Thr Pro Gly1 5gaa aga gcc tgg gca ttg ttt caa gtc ctc aag agc aag gaa ctc atc99Glu Arg Ala Trp Ala Leu Phe Gln Val Leu Lys Ser Lys Glu Leu Ile10 15 20 25ccg gag ggc tat gtc gag cag ctc acg caa ttg atg gag cac ggc tgg147Pro Glu Gly Tyr Val Glu Gln Leu Thr Gln Leu Met Glu His Gly Trp
30 35 40agc ccc gag aac ggc gcc cgt gtg gtg gcc aag gcg tgg gtc gat ccg195Ser Pro Glu Asn Gly Ala Arg Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp Pro45 50 55cag ttc cgg gca ctg ttg ctc aag gac ggc acc gcg gcc tgc gcc cag243Gln Phe Arg Ala Leu Leu Leu Lys Asp Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gln60 65 70ttc ggc tac acc ggc ccc cag ggc gaa tac atc gtt gcc ctg gag gat291Phe Gly Tyr Thr Gly Pro Gln Gly Glu Tyr Ile Val Ala Leu Glu Asp75 80 85acg ccg acg ctg aag aac gtg att gtc tgc agc ctg tgc tcc tgc acc339Thr Pro Thr Leu Lys Asn Val Ile Val Cys Ser Leu Cys Ser Cys Thr90 95 100 105aac tgg ccg gtc ctc ggc ctg cca ccg gag tgg tac aag ggt ttc gag387Asn Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Phe Glu110 115 120ttc cgc gca cgc ctg gtc cgg gag ggg cgc acg gta ctg cgc gag ctg435Phe Arg Ala Arg Leu Val Arg Glu Gly Arg Thr Val Leu Arg Glu Leu125 130 135ggg acg gag ttg ccc cgg gac atg gtg gtc aag gtc tgg gac acc agc483Gly Thr Glu Leu Pro Arg Asp Met Val Val Lys Val Trp Asp Thr Ser140 145 150gcc gaa agc cgc tac ctg gtg ctg ccg gtc agg ccg gaa ggc tca gaa531Ala Glu Ser Arg Tyr Leu Val Leu Pro Val Arg Pro Glu Gly Ser Glu155 160 165cac atg agc gaa gag cag ctt caa gcg ctg gtg acc aaa gac gtg ctg579His Met Ser Glu Glu Gln Leu Gln Ala Leu Val Thr Lys Asp Val Leu170 175 180 185atc ggc gtc gcc ctg ccc cgc gtg ggc tga gaacaacacc tcatcatcgt 629Ile Gly Val Ala Leu Pro Arg Val Gly190tcactcccgg agttttgatt atg gat ggc ttt cac gat ctc ggc ggt ttc caa 682
Met Asp Gly Phe His Asp Leu Gly Gly Phe Gln195 200 205ggc ttt gga aaa gtc cct cac acc atc aac agc ctg agc tac aaa cag730Gly Phe Gly Lys Val Pro His Thr Ile Asn Ser Leu Ser Tyr Lys Gln210 215 220gtg ttc aag cag gac tgg gag cat ctg gcc tac agc ttg atg ttc atc778Val Phe Lys Gln Asp Trp Glu His Leu Ala Tyr Ser Leu Met Phe Ile225 230 235ggt gcc gac cac ttg aaa aag ttc agc gtg gac gaa gtg cgt cac gcc826Gly Ala Asp His Leu Lys Lys Phe Ser Val Asp Glu Val Arg His Ala240 245 250gtc gaa cgc ctg gat gtg cgc cag cat gtc ggc acc cag tac tac gaa874Val Glu Arg Leu Asp Val Arg Gln His Val Gly Thr Gln Tyr Tyr Glu255 260 265cgc tac gtc atc gcg acc gcc acc ctg ctg gtc gaa acc ggc gtg atc922Arg Tyr Val Ile Ala Thr Ala Thr Leu Leu Val Glu Thr Gly Val Ile270 275 280 285acc cag gcg gag ctt gat cag gcc ttg ggc tcc cac ttc aag ctg gcg970Thr Gln Ala Glu Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ser His Phe Lys Leu Ala290 295 300aat ccc gcc cat gcc gag ggc cgc ccg gcg att acg ggg cgg ccg ccc1018Asn Pro Ala His Ala Glu Gly Arg Pro Ala Ile Thr Gly Arg Pro Pro305 310 315ttc gag gtg ggg gat cgg gtg gtg gtg cga gac gaa tat gtg gct gga1066Phe Glu Val Gly Asp Arg Val Val Val Arg Asp Glu Tyr Val Ala Gly320 325 330cac atc cgc atg ccc gcc tac gtg cgc ggc aag gaa ggc gtg gtc ctg1114His Ile Arg Met Pro Ala Tyr Val Arg Gly Lys Glu Gly Val Val Leu335 340 345cac cgc acg tca gag aaa tgg ccg ttc ccc gac gca atc ggg cat ggc1162His Arg Thr Ser Glu Lys Trp Pro Phe Pro Asp Ala Ile Gly His Gly350 355 360 365
gat gta agc gca gcc cat caa ccc acc tac cac gtc gag ttc gcc gtg1210Asp Val Ser Ala Ala His Gln Pro Thr Tyr His Val Glu Phe Ala Val370 375 380aag gac ctg tgg gga gat gcc gcc gat gag ggt ttt gtg gtg gtc gac1258Lys Asp Leu Trp Gly Asp Ala Ala Asp Glu Gly Phe Val Val Val Asp385 390 395ctg ttc gaa agc tac ctg gac aag gcc gcc ggc gcg cgc gcg gtg aac1306Leu Phe Glu Ser Tyr Leu Asp Lys Ala Ala Gly Ala Arg Ala Val Asn400 405 410cca tga cagacggcgc ccaggcaagc cgactgccgg tgacggtcct ttcgggcttc 1362Proctcggcgccg gcaagaccac cctgctcaac cacatcctgc gcaatcgcga aggcctgcgc 1422gtggccgtca tcgtcaatga catgagcgaa gtcaatatcg atgccgaaga ggtgcagcgc 1482gatgtcgcgc tgcaccgtgg tcgcgatgag ctgatcgaga tgagcaacgg gtgcatctgc 1542tgcaccctgc gcgccgattt gctcgagcag atcagcatgc tcgcacgcca acagcgtttc 1602gattacctgc tgattgaatc cacggggatc tccgagccga tgccggtcgc ggagacgttc 1662gccttccttg acgctgatgg cttcagcctc agcgaactgg cgcgcctgga caccttggtg 1722acggtggtcg atggcagtcg tttccaggaa ctgctcgaat cgccgcacac cgttgaccag 1782gatgacgcca cgccagacgc acccaagcgc cacctggccg atctgctgat cgaacaggtg 1842gagtacgcca acgtcattct cgtcaataag ctggatctga tcgatgcagc gcagtatcag 1902gccgtgcagg cgatcctcac aggccttaac ccgacggcgc ggatcatgcc gatggcccac 1962ggtaacatcc catcagccag cctgctcggc acccatctgt ttgatttacc cagcctcgcg 2022gcgtcgccgg gctggatgcg gaaaatggag gcggcagacg cgccggcctc cgagtcggac 2082acctatggcg tgacgtcctg ggtgtaccgt gagcgcgcac ctttccaccc gcaacggttg 2142ctcgactttc tccagcagcc ctggtgcaac gggcggttgc tgcgcagcaa aggttacttc 2202
tggcttgcca gccgccacct ggaaaccggc ctgctggtgc aaagcggcaa gcggttccag2262tgggactatg tcgggcgctg gtggaacttc atcgagccgt cgcaatggcc ccgggacgaa2322taccggctgc agggcatcag ggccaaatgg gacagcgtgg tcggcgactg ccggcaggag2382ttggtgttta tcggccaggg cctcgacacc gacgcgttac agcgcgagct cgaccactgc2442ctgctgagcg cccaggaaat cgccgccggc ccactggcct ggcaagcgct gccaggggcg2502accgcctttg accgacagac ccttgcccgc cccccacaca gcccatggcg attgccccca2562tttgatccga gatagaagct tctgttttgg cggatgagag aagattttca gcctgataca2622gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc2682ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag2742tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc2802agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta2862ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg2922caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg2982gcctttttgc gtttctacaa actcttttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat3042ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg3102agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt3162tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga3222gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa3282gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt3342gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt3402gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc3462agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga3522
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat3582cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct3642gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc3702cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg3762gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc3822ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg3882acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca3942ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta4002aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc4062aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa4122ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca4182ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta4242actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc4302caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca4362gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta4422ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag4482cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt4542cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc4602acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac4662ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac4722gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc4782tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat4842
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ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg6222catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt6282cgcgaacgcc agcaagacgt agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg6342cttctcgccg aaacgtttgg tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa6402gattccgaat accgcaagcg acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc6462gccgaaaatg acccagagcg ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac6522agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt6582gaaggctctc aagggcatcg gtcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca6642gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcatcga6702tcaccacaat tcagcaaatt gtgaacatca tcacgttcat ctttccctgg ttgccaatgg6762cccattttcc tgtcagtaac gagaaggtcg cgaattcagg cgctttttag actggtcgta6822atgaac 6828<210>2<211>194<212>PRT<213>边缘假单胞菌<400>2Met Ser Thr Ala Thr Ser Thr Pro Gly Glu Arg Ala Trp Ala Leu Phe1 5 10 15Gln Val Leu Lys Ser Lys Glu Leu Ile Pro Glu Gly Tyr Val Glu Gln20 25 30Leu Thr Gln Leu Met Glu His Gly Trp Ser Pro Glu Asn Gly Ala Arg35 40 45
Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp Pro Gln Phe Arg Ala Leu Leu Leu50 55 60Lys Asp Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gln Phe Gly Tyr Thr Gly Pro Gln65 70 75 80Gly Glu Tyr Ile Val Ala Leu Glu Asp Thr Pro Thr Leu Lys Asn Val85 90 95Ile Val Cys Ser Leu Cys Ser Cys Thr Asn Trp Pro Val Leu Gly Leu100 105 110Pro Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Phe Glu Phe Arg Ala Arg Leu Val Arg115 120 125Glu Gly Arg Thr Val Leu Arg Glu Leu Gly Thr Glu Leu Pro Arg Asp130 135 140Met Val Val Lys Val Trp Asp Thr Ser Ala Glu Ser Arg Tyr Leu Val145 150 155 160Leu Pro Val Arg Pro Glu Gly Ser Glu His Met Ser Glu Glu Gln Leu165 170 175Gln Ala Leu Val Thr Lys Asp Val Leu Ile Gly Val Ala Leu Pro Arg180 185 190Val Gly<210>3<211>220<212>PRT
<213>边缘假单胞菌<400>3Met Asp Gly Phe His Asp Leu Gly Gly Phe Gln Gly Phe Gly Lys Val1 5 10 15Pro His Thr Ile Asn Ser Leu Ser Tyr Lys Gln Val Phe Lys Gln Asp20 25 30Trp Glu His Leu Ala Tyr Ser Leu Met Phe Ile Gly Ala Asp His Leu35 40 45Lys Lys Phe Ser Val Asp Glu Val Arg His Ala Val Glu Arg Leu Asp50 55 60Val Arg Gln His Val Gly Thr Gln Tyr Tyr Glu Arg Tyr Val Ile Ala65 70 75 80Thr Ala Thr Leu Leu Val Glu Thr Gly Val Ile Thr Gln Ala Glu Leu85 90 95Asp Gln Ala Leu Gly Ser His Phe Lys Leu Ala Asn Pro Ala His Ala100 105 110Glu Gly Arg Pro Ala Ile Thr Gly Arg Pro Pro Phe Glu Val Gly Asp115 120 125Arg Val Val Val Arg Asp Glu Tyr Val Ala Gly His Ile Arg Met Pro130 135 140Ala Tyr Val Arg Gly Lys Glu Gly Val Val Leu His Arg Thr Ser Glu145 150 155 160
Lys Trp Pro Phe Pro Asp Ala Ile Gly His Gly Asp Val Ser Ala Ala165 170 175His Gln Pro Thr Tyr His Val Glu Phe Ala Val Lys Asp Leu Trp Gly180 185 190Asp Ala Ala Asp Glu Gly Phe Val Val Val Asp Leu Phe Glu Ser Tyr195 200 205Leu Asp Lys Ala Ala Gly Ala Arg Ala Val Asn Pro210 215 220<210>4<211>1269<212>DNA<213>边缘假单胞菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1269)<223>激活子蛋白的编码区基因<400>4atg aca gac ggc gcc cag gca agc cga ctg ccg gtg acg gtc ctt tcg48Met Thr Asp Gly Ala Gln Ala Ser Arg Leu Pro Val Thr Val Leu Ser1 5 10 15ggc ttc ctc ggc gcc ggc aag acc acc ctg ctc aac cac atc ctg cgc96Gly Phe Leu Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu Asn His Ile Leu Arg20 25 30aat cgc gaa ggc ctg cgc gtg gcc gtc atc gtc aat gac atg agc gaa144Asn Arg Glu Gly Leu Arg Val Ala Val Ile Val Asn Asp Met Ser Glu35 40 45gtc aat atc gat gcc gaa gag gtg cag cgc gat gtc gcg ctg cac cgt192Val Asn Ile Asp Ala Glu Glu Val Gln Arg Asp Val Ala Leu His Arg50 55 60
ggt cgc gat gag ctg atc gag atg agc aac ggg tgc atc tgc tgc acc240Gly Arg Asp Glu Leu Ile Glu Met Ser Asn Gly Cys Ile Cys Cys Thr65 70 75 80ctg cgc gcc gat ttg ctc gag cag atc agc atg ctc gca cgc caa cag288Leu Arg Ala Asp Leu Leu Glu Gln Ile Ser Met Leu Ala Arg Gln Gln85 90 95cgt ttc gat tac ctg ctg att gaa tcc acg ggg atc tcc gag ccg atg336Arg Phe Asp Tyr Leu Leu Ile Glu Ser Thr Gly Ile Ser Glu Pro Met100 105 110ccg gtc gcg gag acg ttc gcc ttc ctt gac gct gat ggc ttc agc ctc384Pro Val Ala Glu Thr Phe Ala Phe Leu Asp Ala Asp Gly Phe Ser Leu115 120 125agc gaa ctg gcg cgc ctg gac acc ttg gtg acg gtg gtc gat ggc agt432Ser Glu Leu Ala Arg Leu Asp Thr Leu Val Thr Val Val Asp Gly Ser130 135 140cgt ttc cag gaa ctg ctc gaa tcg ccg cac acc gtt gac cag gat gac480Arg Phe Gln Glu Leu Leu Glu Ser Pro His Thr Val Asp Gln Asp Asp145 150 155 160gcc acg cca gac gca ccc aag cgc cac ctg gcc gat ctg ctg atc gaa528Ala Thr Pro Asp Ala Pro Lys Arg His Leu Ala Asp Leu Leu Ile Glu165 170 175cag gtg gag tac gcc aac gtc att ctc gtc aat aag ctg gat ctg atc576Gln Val Glu Tyr Ala Asn Val Ile Leu Val Asn Lys Leu Asp Leu Ile180 185 190gat gca gcg cag tat cag gcc gtg cag gcg atc ctc aca ggc ctt aac624Asp Ala Ala Gln Tyr Gln Ala Val Gln Ala Ile Leu Thr Gly Leu Asn195 200 205ccg acg gcg cgg atc atg ccg atg gcc cac ggt aac atc cca tca gcc672Pro Thr Ala Arg Ile Met Pro Met Ala His Gly Asn Ile Pro Ser Ala210 215 220agc ctg ctc ggc acc cat ctg ttt gat tta ccc agc ctc gcg gcg tcg720Ser Leu Leu Gly Thr His Leu Phe Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Ser225 230 235 240
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<221>CDS<222>(1)..(582)<223>？-亚基的编码区基因<220>
<221>CDS<222>(624)..(1286)<223>？-亚基的编码区基因<220>
<221>基因<222>(1283)..(2371)<223>激活子蛋白的基因<400>6atg acg gca act tca acc cct ggt gag cgg gca cgc gca ttg ttt gca48Met Thr Ala Thr Ser Thr Pro Gly Glu Arg Ala Arg Ala Leu Phe Ala1 5 10 15gtg ctc aag cgc aaa gac ctc atc ccc gag ggc tac atc gaa cag ctc96Val Leu Lys Arg Lys Asp Leu Ile Pro Glu Gly Tyr Ile Glu Gln Leu20 25 30acc cag ctg atg gaa cac ggc tgg agc ccg gaa aac ggc gcg cgc atc144Thr Gln Leu Met Glu His Gly Trp Ser Pro Glu Asn Gly Ala Arg Ile35 40 45gtc gcc aag gcc tgg gtc gat ccg cag ttt cgc gag ctg ctg ctc aag192Val Ala Lys Ala Trp Val Asp Pro Gln Phe Arg Glu Leu Leu Leu Lys50 55 60gac ggt acg gcc gcc tgc gcc cag ttc ggc ttc acc ggc cca caa ggc240Asp Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gln Phe Gly Phe Thr Gly Pro Gln Gly65 70 75 80gaa tac atc gtc gcc ctg gaa gac acc ccg cag ttg aaa aac gtg atc288Glu Tyr Ile Val Ala Leu Glu Asp Thr Pro Gln Leu Lys Asn Val Ile85 90 95gtc tgt agc ctg tgc tcc tgc acg aac tgg ccg gtg ctg ggc ctg cca336Val Cys Ser Leu Cys Ser Cys Thr Asn Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro100 105 110cct gag tgg tac aag ggc ttc gag ttc cgt gcg cgg ttg gtc cgg gag384Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Phe Glu Phe Arg Ala Arg Leu Val Arg Glu115 120 125ggg cgc acg gta ttg cgc gag ctg ggc acc gag ttg ccc ggc gac atg432Gly Arg Thr Val Leu Arg Glu Leu Gly Thr Glu Leu Pro Gly Asp Met
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<400>8Met Asp Gly Phe His Asp Leu Gly Gly Phe Gln Gly Phe Gly Lys Val1 5 10 15Pro His Arg Ile Asn Ser Leu Ser Tyr Lys Gln Val Phe Lys Gln Asp20 25 30Trp Glu His Leu Ala Tyr Ser Leu Met Phe Ile Gly Val Asp His Leu35 40 45Asn Lys Phe Ser Val Asp Glu Ile Arg His Ala Val Glu Arg Ile Asp50 55 60Val Arg Gln His Val Gly Thr Glu Tyr Tyr Glu Arg Tyr Val Ile Ala65 70 75 80Thr Ala Thr Leu Leu Val Glu Thr Gly Val Ile Thr Gln Ala Glu Leu85 90 95Asp Glu Ala Leu Gly Ser His Phe Lys Leu Ala Asn Pro Ala His Ala100 105 110Gln Gly Arg Ala Ala Ile Ile Gly Arg Ala Pro Phe Glu Val Gly Asp115 120 125Arg Val Ile Val Arg Asp Glu Tyr Val Ala Gly His Val Arg Met Pro130 135 140Ala Tyr Val Arg Gly Lys Gln Gly Val Val Leu His Arg Thr Thr Glu145 150 155 160
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<221>CDS<222>(1)..(1089)<223>激活子蛋白的编码区基因<400>9atg agt gcc ggc gcc cag gca ggc cgg ctg ccg gtg acg gtc ctt tca48Met Ser Ala Gly Ala Gln Ala Gly Arg Leu Pro Val Thr Val Leu Ser1 5 10 15ggc ttc ctc ggc gca ggc aag acc acc ctg ctc aac cac atc ctg cgc96Gly Phe Leu Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu Asn His Ile Leu Arg20 25 30aac cgc cag ggc ctg aag gtg gcg gtt atc gtc aat gac atg agc gag144Asn Arg Gln Gly Leu Lys Val Ala Val Ile Val Asn Asp Met Ser Glu35 40 45gtc aac atc gat gcc gcc cag gtc cag cgc gac gtt gcg ctg tat cgt192Val Asn Ile Asp Ala Ala Gln Val Gln Arg Asp Val Ala Leu Tyr Arg50 55 60
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Gly Phe Leu Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu Asn His Ile Leu Arg20 25 30Asn Arg Gln Gly Leu Lys Val Ala Val Ile Val Asn Asp Met Ser Glu35 40 45Val Asn Ile Asp Ala Ala Gln Val Gln Arg Asp Val Ala Leu Tyr Arg50 55 60Gly Gln Asp Glu Leu Ile Glu Met Ser Asn Gly Cys Ile Cys Cys Thr65 70 75 80Leu Arg Ala Asp Leu Leu Glu Gln Ile Ser Ala Leu Ala Arg Gln Gln85 90 95Arg Phe Asp Tyr Leu Leu Ile Glu Ser Thr Gly Ile Ser Glu Pro Met100 105 110Pro Val Ala Glu Thr Phe Ala Phe Leu Asp Ala Asn Gly Phe Ser Leu115 120 125Ser Glu Leu Ala Arg Leu Asp Thr Leu Val Thr Val Val Asp Ala Ser130 135 140Gln Phe Met Ala Met Leu Asp Ser Pro Glu Thr Val Ala Arg Ala Asp145 150 155 160Val Thr Thr Asp Asp Ser Arg Arg Pro Leu Ala Asp Leu Leu Ile Glu165 170 175Gln Val Glu Tyr Ala Asn Val Ile Leu Val Asn Lys Arg Asp Leu Val180 185 190Asp Glu Ala Gln Tyr Gln Ala Leu Gln Ala Val Leu Ala Gly Leu Asn195 200 205
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<220>
<223>引物1F<400>11ctccaccata tgagtacagc tacttcaacg 30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物1R<400>12cttcataagc ttctatctcg gatcaaatgg 30<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物2F<400>13atgacggcaa cttcaacccc tggtg25<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物2R<400>14tcagctcctg tcggcagtcg 20
权利要求
1.分离的多核苷酸，其能编码具有与包含在序列SEQ ID NO2，3和5或7、8和10中的氨基酸序列90-100％一致的氨基酸序列的多肽。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其选自a)多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO1，4，6，9或与其互补的核苷酸序列，b)多核苷酸，其在遗传密码的简并性范围内，包含与a)的序列相对应的核苷酸序列，c)多核苷酸，其包含如a)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列包含功能上中性的有义突变，d)多核苷酸，其能在严格条件下，与a)的互补序列杂交，其中严格条件指在50-65℃，在5XSSC中洗涤，其中该多核苷酸编码耐受氰化物的腈水合酶。
3.多肽，其包含与具有序列SEQ ID NO2，3和5或7，8和10的序列90-100％一致的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的多肽，其具有能耐受氰化物的腈水合酶的活性，其在有20mM(mM＝mmol/l)氰离子存在下，在20℃转化甲基丙烯腈30min后的剩余活性是，在没有氰离子、其它条件都相同时用相同酶进行转化的剩余活性的至少90％。
5.探针或引物，其包含来自序列SEQ ID NO1，4，6，9的至少20个连续核苷酸。
6.载体，其包含选自权利要求1或2的多核苷酸。
7.通过导入权利要求1或2中的一项或多项的多核苷酸，转化或转染的宿主细胞。
8.通过导入权利要求6的载体，转化的宿主细胞。
9.从腈酶促制备酰胺的方法，其包含下述步骤a)使用具有腈水合酶活性的微生物酶(多肽)，转化包含腈基团的化合物，和b)去除形成的酰胺，其中，使用权利要求3或4所述的能耐受氰化物的腈水合酶，将腈转化成酰胺。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用能生产和含有所述酶的权利要求7或8的微生物，或其裂解产物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，使用微生物的静止细胞。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用纯化的腈水合酶。
13.如权利要求9-12中的一项或多项所述的方法，其特征在于，该酶源自假单胞菌属微生物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该酶源自采用的恶臭假单胞菌或边缘假单胞菌微生物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，采用的微生物在保藏号DSM 16275和DSM 16276下保藏。
16.如权利要求9-15中的一项或多项所述的方法，其特征在于，将下述通式的化合物转化成对应的酰胺 R″-CN(II)其中含义是XOH，H，烷基，NH2；RH，任选地被NH2取代的、分支的或不分支的、具有1-12个C原子的饱和的烷基，分支的或不分支的、具有双键和1-12个C原子的不饱和烷基，具有3-6个C原子的环烷基，烷硫基-取代的亚烷基，其中，烷基对应着C1-C3基团，且亚烷基对应着双价的C3-C8-基团，R′H，具有1-3个C原子的烷基，R″单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地被1个或2个烷基(C1-C3)，Cl，Br，F取代；具有1-6个C原子的烷基腈基团。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在有氢氰酸或氢氰酸盐存在下，转化通式(I)的化合物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，基于使用的腈，在有超过0.5mol％氰化物-3mol％氰化物的起始浓度存在下，进行转化。
19.如权利要求9-18中的一项或多项所述的方法，其特征在于，使用2-氨基-4-甲硫基丁腈作为腈。
20.如权利要求9-18中的一项或多项所述的方法，其特征在于，使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为腈，在适当时，其存在于制备该腈的反应混合物中。
21.如权利要求9-18中的一项或多项所述的方法，其特征在于，使用2-羟基-2-甲基丙腈作为腈。
22.如权利要求9-21所述的方法，其特征在于，从生物量的细胞分离酰胺或包含酰胺的溶液，并将酰胺皂化成对应的酸。
23.如权利要求9-21所述的方法，其特征在于，从生物量的细胞分离酰胺或包含酰胺的溶液，并用碱金属或碱土金属氢氧化物，将酰胺皂化成对应羧酸的盐。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，用氢氧化钙皂化MHA-酰胺，得到钙盐。
25.如权利要求9-24中的一项或多项所述的方法，其中，a)发酵假单胞菌属微生物，其中增强、尤其重组地过表达分离的多核苷酸，其能编码具有与包含在具有序列SEQ ID NO2，3，5，7，8，10的序列中的氨基酸序列90-100％一致的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有能耐受氰化物的腈水合酶的活性，b)在适当时，从这些微生物分离重组生产的且具有腈水合酶活性的酶，或制备包含该酶的蛋白级分，和c)将根据a)的微生物或根据b)的酶或包含后者的级分，转移进介质，其包含通式(I)或(II)的具有腈基团的化合物。
26.如权利要求9-24中的一项或多项所述的方法，其中采用如权利要求7或8所述的宿主细胞。
27.在保藏号DSM 16275和DSM 16276下保藏的假单胞菌属微生物。
28.能耐受氰化物的腈水合酶，其分离自在保藏号DSM 16275和DSM 16276下保藏的假单胞菌属菌株。
全文摘要
本发明涉及能耐受氰化物的腈水合酶，特别是来自具有增强的氰化物耐受性的恶臭假单胞菌或边缘假单胞菌菌株的，涉及在有氰化物存在下，它们在从腈制备酰胺中的应用，和编码这些酶的多核苷酸序列。
文档编号C12P13/02GK1934132SQ200580008964
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月14日 优先权日2004年3月20日
发明者S·奥斯瓦尔德, C·维克贝克, K·胡特马赫尔, T·杰拉斯莫瓦, A·诺维科夫, L·拉波钦科, A·亚南科, K·伊格洛瓦 申请人:底古萨股份公司