专利名称：鞘磷脂酶在增大皮肤和粘膜神经酰胺的含量方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及得自革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和乳酸菌或其混合物的鞘磷脂酶在增大皮肤神经酰胺和粘膜神经酰胺的含量方面的应用，以及含鞘磷脂酶、适合局部施用的皮肤病组合物和化妆品组合物。
背景技术：
神经酰胺(N-酰基鞘氨醇)是近年来作为一种重要胞内信使而提出的脂质代谢物，它是在数小时中各种介质的刺激作用下由细胞内释放出来的，或者是作为血清丧失的结果而产生的，并且它与在G0/G1期和编程性细胞死亡中的细胞阻滞有关。神经酰胺现在被认为是在鞘磷脂信号转导途径情况下的第二信使。它是在鞘磷脂酶影响下由鞘磷脂释放的，鞘磷脂酶是鞘磷脂特异性的磷脂酶C形式。在细胞中，神经酰胺能影响生长和分化、调节蛋白质分泌、诱发DNA的断裂和编程性细胞死亡、增加细胞因子的合成和分泌。构成这些各种不同作用的基础的分子机理目前尚不完全清楚。而了解得更多的是能引起神经酰胺释放的胞外兴奋剂。将细胞暴露于外源鞘磷脂酶或激活内源鞘磷脂酶的兴奋剂之后，鞘磷脂就能很快地进行水解。这样的兴奋剂包括TNF-α、Fas配体、白细胞介素1-β、IFN-γ、1α，25-二羟基维生素D3和NGF。
已经公知了含鞘磷脂酶的化妆品组合物。日本专利公开63216813公开了这样一种组合物其中得到的鞘磷脂酶的目的是为了抵消老化皮肤中这种酶的生理上的减少，这样促进鞘磷脂转化成神经酰胺，从而给皮肢带来有利的润湿效果。
然而，该日本公开并没有公开或至少建议这些组合物在治疗上能被用来治疗皮肤病。而且，鞘磷脂酶是从高等动物的组织(如脑和肝)中经历繁琐和复杂的提取方法而获得的。
神经酰胺在皮肤的新陈代谢中的重要性可从下文内容清楚地了解。
表皮的主要细胞成分是角质形成细胞、黑素细胞、朗氏细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞。在发炎和肿胀的过程中，单核白细胞和多形核白细胞能浸润皮肤。另一方面，胞内空间主要由中性脂质、糖蛋白、蛋白质降解产物、桥粒、活性酶、皮脂腺产物和神经酰胺组成。只要这种“砖和灰泥”的结构完整，皮肤就同时被赋予保护层和选择性渗透过滤器的功能作用。
在表皮的分化过程(始于基底层的细胞分裂，结束于角质形成细胞的死亡和脂质屏障的形成)中，细胞改变了它们的脂质合成能力。其结果是造成了表皮基底层以磷脂和胆固醇为特征，而最外层是以胆固醇、游离脂肪酸以及尤其是以神经酰胺为特征。角质层的脂质(其主要成分由鞘脂组成)在维持表皮对水的渗透性屏障中起关键性的作用。鞘脂是从表皮粒状细胞的片层体中挤出的。占角质层43～46％的神经酰胺(鞘脂)是角质层的主要极性脂质，它们对于在细胞粘附和表皮的分化过程中皮肤对水分渗漏的屏障功能中起基本作用。文献资料表明，神经酰胺是在表皮中从头合成的，经历了磷脂样的中间体。它们在角质层中以相当高的浓度存在(多达全部脂质的40％)。
与皮肤表面的外貌一样，它的功能性特点随着衰老也发生改变。老化的皮肤特征在于角质层中水份含量的减少以及与之相关的水分经皮渗漏的减少。已经表明，神经酰胺2鞘脂的比例随着年龄而减小。与衰老相关的神经酰胺的减少可造成皮肤的脱水，已在衰老过程中观察到该现象。
此外，在特应性湿疹、皮肤病和皮炎，特别是特应性皮炎和牛皮癣中已检测出异常的神经酰胺含量(缺乏)。近来，在常染色体隐性鞘脂沉积病中发现先天缺乏神经酰胺1。同样，我们也知道鞘脂沉积病的通常形式，如法布莱病、戈谢病和泰-萨病。斯-拉综合征与神经酰胺1和6的缺乏相关，伴随对正常皮肤屏障的破坏。
依上所述，维持皮肤中高含量的神经酰胺显然是非常有利的。我们将进一步理解，鞘磷脂酶的应用在粘膜水平上也是有利的。
现在在市场上能得到大量的通过提取的方法或合成的方法得到的、应用于皮肤病学和化妆品的含神经酰胺的产品。局部外用神经酰胺被提出用于重塑由于衰老、药物、洗涤剂、物理药剂等而改变的皮肤脂质屏障。这种外部给药却不可能使神经酰胺因年龄、解剖部位、季节性因素和疾病而在性质上和/或数量上变化。很清楚，神经酰胺的外部给药仅起到加性意义上的作用(内源神经酰胺+外源神经酰胺)而不能起到调节意义上的作用(由季节、解剖部分、发展中的可能的疾病过程等而引起神经酰胺的变化)。
发明内容
我们现已意外地发现细菌细胞中存在高含量的中性而非酸性的鞘磷脂酶。
因此，本发明的一个目的是提供得自细菌的鞘磷脂酶在生产适合局部施用以增大皮肤和粘膜中神经酰胺的含量的皮肤病组合物或化妆品组合物方面的应用。
根据本发明，鞘磷脂酶优选从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、乳酸菌或其混合物中提取。乳酸菌应优选选自下组嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenaforme)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus leichmanii)、小阿托波氏菌(Lactobacillus minutus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、埃氏双歧杆菌(Bifidobacterium eriksonii)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、植物双歧杆菌(Bifidobacterium plantarum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌假长亚种(Bifidobacterium pseudolongum)、乳酸乳球菌乳亚种(Steptococcus lactis)、棉子糖乳链球菌(Streptococcusraffinolactis)和唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcusthermophilus)。
根据本发明一个优选的实施方案，细胞是呈冻干的细胞或超声处理的细胞形式应用的。
根据本发明，鞘磷脂酶还能作为皮肤渗透或吸收增强剂，单独地或与其它增强剂混合用于制备适合经皮给药的药物组合物或化妆品组合物。
本发明的又一目的是提供皮肤病组合物或化妆品组合物，其特征在于它们包含有效地使皮肤或粘膜中的神经酰胺含量增大的一定量的鞘磷脂酶。
根据本发明，这类组合物中所含的鞘磷脂酶优选从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、乳酸菌或其混合物中提取。乳酸菌应优选选自下组嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、链状乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、詹氏乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、小阿托波氏菌、植物乳杆菌、罗氏乳杆菌、唾液乳杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、双歧双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、齿双歧杆菌、埃氏双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、植物双歧杆菌、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌假长亚种、乳酸乳球菌乳亚种、棉子糖乳链球菌和唾液链球菌嗜热亚种。
根据本发明一个优选的实施方案，组合物中所含的细胞是呈冻干的细胞或超声处理的细胞形式。
本发明的皮肤病组合物或化妆品组合物优选包含1×102～1×1015CFU的乳酸菌/克组合物。
本发明的皮肤病组合物或化妆品组合物也可包括外源性神经酰胺或者含下列物质的产品外源性神经酰胺、鞘磷脂、脂肪酸、胆固醇、神经酰胺酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、免疫调制剂、维生素、生长因子、表面活性剂、乳化剂、稳定剂、脂质、流变添加剂、增湿剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、色淀、颜料、辅助物质(例如酸、碱、抛射剂)和功能性物质(收敛剂、抗皮脂溢剂、抗头垢剂、除臭剂、皮肤净化剂、生角质剂、润湿剂、抗干燥剂、光滑剂、防护剂、遮光剂、涂色剂、抗脱色剂、润肤剂、恢复剂、富养剂(eutrophic agents)、抗皱纹剂、抗自由基剂、硬化剂、抗伸展标示剂(anti-stretch-markagents)、血管保护剂、抗皮疹剂、安扶剂、抗蜂窝组织炎剂、强壮剂、兴奋剂、超洗脱剂(hypereluting agents)、脱毛剂、指甲保护剂)。
最后，本发明的皮肤病组合物或化妆品组合物可以配制成液体、半液体、半固体、固体或粉末产品的形式，例如，呈如下形式乳膏、软膏、洗剂、胶囊、珠剂、阴道栓剂、染眉毛油、洗眼剂、牙膏、漱口剂、唇膏、微脂体剂、皂、剃须皂、强壮剂、灌洗液、灌肠液、洗发剂、抗头垢制剂、浸渍的和/或含药的绷带或纱布、贴片、含药的乳剂、经皮凝胶或贴片。
具体实施例方式
为了证实这些细菌诱导皮肤中形成神经酰胺的能力，我们进行了如下实验，实验基于检测使人体皮肤中生成神经酰胺的中性鞘磷脂酶。
方法测定乳酸菌中的中性和酸性鞘磷脂酶10mg冻干的唾液链球菌嗜热亚种重悬浮在500μl的缓冲液中，该缓冲液含有20mM的HEPES(pH7.4)、10mM的MgCl2、2mM的EDTA、5mM的DTT、0.1mM的NA3VO4、0.1mM的Na2MoO4、30mM的磷酸对硝基苯基酯、10mM的β-甘油磷酸盐、750mM的ATP、1μM的PMSF、10μM的亮抑酶肽、10μM的胃酶抑制剂(Sigma Chemical Co.)和0.2％的TritonX-100(用于测定中性鞘磷脂酶的活性)或500μl的0.2％的TritonX-100(用于测定酸性鞘磷脂酶的活性)。然后应用Vibracell超声发生器(Sonic and Materials Inc.，Danbury，CT)对这样制备的样品进行超声溶菌处理(时间1分钟50秒，交替10秒超声处理和10秒间歇)。再将超声处理后的样品在4℃、14,000rpm下离心30分钟，移去上清液，用Bio-Rad Laboratories试剂盒(Richmond，CA)测定蛋白质的浓度。
将100μg的样品在37℃下置于缓冲液(最终体积50μl)中保温2小时，所述缓冲液含有20mM的HEPES、1mM的MgCl2(pH为7.4)和2.25μl的〔N-甲基-14C〕鞘磷旨(SM)(0.2μCi/ml，a.s.56.6mCi/mmol，Amersham)。
为了检测酸性鞘磷脂酶的活性，将100μg细菌溶菌物置于缓冲液中，于37℃下保温2小时，所述缓冲液(最终体积50μl)含有250mM的乙酸钠、1mM的EDTA(pH为5.0)和2.25μl的〔N-甲基-14C〕SM。添加250μl氯仿∶甲醇∶乙酸(4∶2∶1)终止此反应。提取出磷脂，置于平板上，用TLC和通过放射自显影术和液体闪烁计量的SM的水解作用进行分析。超声处理过的细菌中存在的鞘磷脂酶以单位/mg蛋白质表示。1个单位的中性鞘磷脂酶在37℃下、pH为7.4时，每分钟水解1微摩尔的鞘磷脂。1个单位的酸性鞘磷脂酶在37℃下、pH为5.0时，每小时将1毫微摩尔的SM水解成N-乙酰鞘氨醇和磷酸胆碱。
乳膏的制备和处理(持续时间和方式)(用脱水基本乳膏)制备含有超声处理过的乳酸菌〔2管各20g基本乳膏和1小管超声处理过的乳酸菌(1×1012CFU)于20ml的水中〕的乳膏。在8名志愿者中，分析了每天施用该乳膏对前臂表皮角质层的神经酰胺含量的影响，如下表1所示表1
指导这些受试者自己给药，每天使用对比乳膏和含乳酸菌的实验乳膏两次(约1ml，早晚各一次)。对比乳膏每天用在右前臂，实验乳膏用在左前臂。两种乳膏被用力揉擦直到它们被完全吸收。在开始使用乳膏之前(T0)和开始使用一星期后(T1)，用250ml 99.5％的乙醇冲洗前臂，收集表皮角质层的脂质。将乙醇提取物置于旋转蒸发器中浓缩，然后蒸发至干。将此干样品溶于2ml氯仿中，在氮气中干燥，进行神经酰胺的DAG激酶定量测定(Amersham，Buckinghamshire，Great Britain)。经历三次提取过程后，又在氮气中干燥该脂质，溶于100μl氯仿中，用氯仿∶甲醇∶乙酸(65∶15∶5，v/v/v)作工作溶剂进行薄层层析(TLC)。通过放射自显影术测定磷酸化的神经酰胺。割下相应于神经酰胺-1-磷酸的膜片，在β-计数器中应用闪烁液计数存在的放射性。基于得自真实的神经酰胺(III型，牛脑神经酰胺；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的标准曲线测定存在的神经酰胺量。
结果乳酸菌中鞘磷脂酶的活性在超声处理的乳酸菌样品中，中性鞘磷脂酶活性的值约为2×10-7单位/mg菌。没有检测到酸性鞘磷脂酶活性。
超声处理的乳杆菌属(Lactobacillus)对皮肤中神经酰胺含量的影响象“方法”部分描述的那样得到的乙醇提取物中神经酰胺的含量给出于下表2中，相应的放射自显影图见
图1。可以注意到，不管受试验者基本含量各不相同，但分析出使用两种乳膏都引起所有受试验者前臂皮肤中神经酰胺含量的增大。然而，在施用含乳酸菌的乳膏后增大得更为显著。此外，与基本乳膏引起的效果相比，实验乳膏对神经酰胺含量的影响效果可被更早地检测到，于是表明实验乳膏的作用更快。
表2
权利要求
1.鞘磷脂酶在生产适合局部施用以增大粘膜神经酰胺的含量的皮肤病组合物和/或化妆品组合物方面的应用，其特征在于所述鞘磷脂酶得自革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、乳酸菌或其混合物。
2.权利要求1的在生产皮肤病组合物方面的应用，所述皮肤病组合物适合局部施用以预防或治疗特应性湿疹、皮肤病和皮炎，尤其是特应性皮炎、牛皮癣、法布莱病、戈谢病、泰-萨病和斯-拉综合征。
3.权利要求1或2的应用，其特征在于所述乳酸菌选自下组嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、链状乳杆菌(Lactobacilluscatenaforme)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳杆菌(Lactabacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus leichmanii)、小阿托波氏菌(Lactobacillus minutus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、埃氏双歧杆菌(Bifidobacterium eriksonii)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、植物双歧杆菌(Bifidobacterium plantarum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌假长亚种(Bifidobacterium pseudolongum)、乳酸乳球菌乳亚种(Steptococcus lactis)、棉子糖乳链球菌(Streptococcusraffinolactis)和唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcusthermophilus)。
4.权利要求1或2的应用，其特征在于所述皮肤病组合物或化妆品组合物适合经皮施用。
5.权利要求1或2的应用，其特征在于鞘磷脂酶是呈冻干的细胞或超声处理的细胞形式应用的。
全文摘要
公开了鞘磷脂酶在增大皮肤神经酰胺和粘膜神经酰胺的含量方面的应用，以及含鞘磷脂酶、适合局部施用的皮肤病组合物和化妆品组合物。
文档编号C12N1/21GK1840183SQ200610004928
公开日2006年10月4日 申请日期1997年11月14日 优先权日1996年11月22日
发明者R·M·A·卡瓦利瑞维斯利, C·德西蒙 申请人:艾蒂尔药物有限公司