专利名称：一种生产体细胞克隆猪的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产体细胞克隆猪的方法。
背景技术：
体细胞核移植克隆是指利用一定的设备和技术手段，将动物的体细胞与已经去除细胞核遗传物质的卵母细胞体外重组胚胎，然后再于特定的发育时期将重组胚移植到待孕母体的子宫内，完成发育，生产与体细胞供核体遗传上同质后代的过程。体细胞核移植生产克隆猪包括以下步骤采集猪的体细胞，建立体细胞系；体外将从猪卵巢采集的卵母细胞培养成熟；将供体细胞核移入去核的卵母细胞中；然后通过随后的电融合和激活得到胚胎；体外培养到囊胚或移入待孕母猪以生产克隆猪。
猪体细胞克隆具有非常重要的应用价值，农业上可以丰富地方品种保种以及猪肉品质、抗病改良的手段；医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料，因此体细胞克隆猪具有非常广阔的应用前景。鉴于猪的器官无论是在体积上还是在功能上都和人的比较接近，人们希望能利用猪来提供人所需要的各种器官，开展异种器官移植(Xenotransplantation)。体细胞克隆猪在建立人的动物疾病模型和人类器官移植方面具有巨大的应用潜力，已成为当今体细胞克隆研究的热点。猪的体细胞克隆是各种家畜中难度相对较大的，猪卵母细胞的体外成熟质量较差，体外培养的胚胎发育能力很低，并且要至少有4个优质胚胎同时附植，才能诱发足够的妊娠信号。自从1997年体细胞克隆羊“多莉”成功之后，直到2000年，体细胞克隆猪才终于有了突破，Polejaeva等首次获得了体细胞克隆猪的成功，同年Onishi等和Betthauser等相继分别成功地得到了体细胞克隆猪。Polejaeva等采用二元受体两步核移植法，借助电融合技术先使G0期颗粒细胞和体内冲出的成熟卵子组成重构胚，再以形成的原核作为核供体进行第二次核移植，成功获得了第一例体细胞克隆猪(5头仔猪)。Onishi等也报道了利用猪胎儿成纤维细胞作核供体，借助Piezo将破膜后的供体细胞核物质直接注射到体内成熟的、去核卵母细胞胞质内，获得了一头克隆仔猪。随后Bettauser等利用体外成熟的卵母细胞，经电融合与电激活获得重构胚，从多方面改进、简化了体细胞克隆猪的程序，奠定了今天克隆猪的常用技术。从2000年开始，在几个国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪，但是其成功效率往往低于1％。
克隆猪成功被攻克之后，人们又利用体细胞克隆技术开始探索生产转基因、基因组修饰(如基因打靶)猪，2001年，Park等成功地获得了转绿色荧光蛋白(GFP)基因的猪。Bondioli等移植了299枚以转基因公猪皮肤成纤维细胞为核供体，体内成熟的卵子为胞质受体的核移植胚胎，生2头仔猪。2002年Lai等用体外成熟的经产母猪卵子，采用融合/激活同步完成的方案获得了基因敲除体细胞克隆猪，它标志着基因定点敲除技术与核移植技术在猪上的成功结合，但其总效率也没能超过1％。
至今，虽然全世界已经有十多个研究组取得了猪体细胞克隆的成功，但克隆猪的效率一般不超过1％。如前所述，体细胞克隆猪制备过程包括供体细胞系建立及准备，卵母细胞的获取及成熟，核移植供体细胞与去核的卵母细胞进行融合，克隆胚胎的培养，克隆胚胎移植及待孕母猪妊娠产子，每个环节对于克隆猪的成功与否及效率高低都是至关重要的。
供体细胞的准备方式一般是在核移植前现消化培养传代的细胞，一次用完，下次不继续利用。在牛、羊有人尝试利用4℃冷藏的细胞为核供体即消化的细胞放入4℃冰箱冷藏备用进行克隆，可充分利用消化的细胞，尤其是转基因等不易获得的细胞，并丰富了供体细胞的准备方式。
克隆猪的受体卵母细胞最初是体内成熟的，超排手术法采集体内成熟的卵母细胞的成本很高，工作量很大；随着卵母细胞体外成熟技术的逐渐成熟，人们开始利用体外成熟的卵母细胞，即采集屠宰场屠宰母猪废弃的卵巢，在实验室将从卵巢的卵泡中冲取的未成熟卵子在培养基培养成熟。目前已经获得克隆猪的研究绝大部分是利用体内成熟的卵子或经产母猪(生了小猪的母猪)体外成熟的卵子，这些研究者通过对照发现目前源于经产母猪的卵子比青年母猪(未生小猪的母猪)的卵子有更好的体外发育潜力。但是冲取体内成熟的卵子成本很高(体外成熟的几十倍)，购买经产母猪的卵巢成本也很高(是青年母猪的十倍)，而且往往不易得到，如果进行大规模生产，体细胞克隆猪的制备成本就会相当高。如今在屠宰场大规模屠宰的商品猪一般都是处于初情期以前的6月龄的青年母猪，卵巢资源非常丰富，成本较低，适于体细胞克隆猪的大规模生产和研究，但是初情期前母猪卵巢的卵子质量较差，往往卵泡大小不一，细胞质成熟等方面不如经产母猪或体内成熟卵子。因此如何建立更好的成熟方案来充分利用屠宰场丰富的初情期前母猪卵巢资源是摆在研究者面前诱人而富有挑战性的课题。
猪卵母细胞体外发育能力与成熟液和培养条件有密切的联系。现在普遍用的两种基本的成熟培养基础液配方无BSA的NCSU-23和TCM-199。而PZM-3是一种新的胚胎培养基，该培养基是日本学者在猪体外生产胚胎培养上首次使用的(Yoshiokaet al.2002)，至今还没有人将PZM-3用于卵母细胞体外成熟方面的尝试。
与其他动物相比，猪胚胎体外发育能力较低，囊胚率低，细胞数少(约是体内胚胎的1/4。这反映了体外培养条件偏离体内环境，其中一个重要因素是气相条件的氧分压。通常人们都是使用5％CO2，95％的空气(约20％O2)的培养箱内进行体外培养，而输卵管和子宫的氧分压低于空气。在高氧(20％O2)下培养胚胎，可能会产生更多的氧自由基而有害于胚胎的发育。目前，培养猪胚胎的培养基有多种，其中NCSU-23是最常用的胚胎培养基，也是目前公认较好的胚胎培养基。最近依据人的输卵管和子宫液研制的胚胎培养液GIII，是一个分两阶段培养换液的培养基即G1.3/G2.3，能适应不同胚胎发育阶段对能量(葡萄糖)和氨基酸的需要，它能提高多种动物胚胎发育的质量(尤其是囊胚细胞数)。细胞数的提高可能因为它是一个较完备的培养基，G1.3/G2.3有着平衡的营养成分，葡萄糖的浓度分别为0.5mM和3.15mM，含有适宜浓度的丙酮酸、乳酸以及氨基酸和维生素等。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产体细胞克隆猪的方法。
本发明所提供的生产体细胞克隆猪的方法，是以猪胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞，以体外成熟的初情期前母猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞构建成克隆胚胎，所述克隆胚胎在氧气体积百分含量为5-10％的气相条件下进行体外培养得到早期胚胎，将所述早期胚胎移植入待孕母猪妊娠并生产体细胞克隆猪。
所述猪胎儿成纤维细胞是经过下述方法处理的现消化现用或消化后再2-8℃冷藏2-24小时。
所述体外成熟的初情期前母猪卵母细胞是将初情期前母猪卵母细胞在无BSA的NCSU-23或无BSA的PZM-3成熟培养液中培养得到的。
所述无BSA的NCSU-23或无BSA的PZM-3成熟培养液为NCSU-23或PZM-3添加10％(体积比)猪卵泡液(PFF)，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10IU/ml人绒毛膜促性腺激素(hCG)和10IU/ml孕马血清促性腺激素(PMSG)。
上述方法中，所述克隆胚胎在氧气体积百分含量为7％的气相条件下进行体外培养得到早期胚胎。
所述气相条件优选为含7％O2、5％CO2、88％N2的混合气体，所述百分含量为体积百分含量。
所述体细胞克隆胚胎的体外培养所用的基础培养基为NCSU-23、PZM-3或GIII，优选为NCSU-23。其中，所述体细胞克隆胚胎的体外培养的培养基，在体细胞克隆胚胎发育至2-4细胞阶段前为NCSU-23、PZM-3或GIII；在体细胞克隆胚胎发育的2-4细胞阶段及2-4细胞阶段后为添加1-10ng/ml EGF的NCSU-23、PZM-3或GIII。
所述体细胞克隆胚胎的体外培养所用的培养基，在体细胞克隆胚胎发育至2-4细胞阶段前为NCSU-23；在体细胞克隆胚胎发育的2-4细胞阶段及2-4细胞阶段后为添加1-10ng/ml EGF的NCSU-23。
所述EGF的添加浓度为10ng/ml。
为了建立低成本、大规模及高效率的体细胞克隆猪生产体系，本发明在核移植供体细胞的保藏方式，卵母细胞的选取及体外成熟、克隆囊胚效率的提高等环节上进行优化，成功获得了体细胞克隆猪。具体体现在1)本发明采用的核移植供体细胞是猪胎儿成纤维细胞，准备方式为现消化现用和消化后再2-8℃冷藏2-24小时，结果表明4℃冷藏12-20小时的与现消化现用的供体细胞一样，可以用于核移植供体并且能有效支持克隆胚胎的早期发育；2)本发明采用的核移植受体是初情期前母猪的卵母细胞；对初情期前母猪的卵母细胞进行体外成熟培养，采用了传统的卵母细胞成熟液即无BSA的NCSU-23，以及一种新的卵母细胞成熟液PZM-3，结果表明PZM-3可作为一种新的卵母细胞成熟液；3)本发明对得到的克隆胚胎进行了体外培养研究，结果表明与20％O2(5％CO2，95％的空气)的气相条件下相比，在低氧条件下(7％O2、5％CO2、88％N2的气相条件下)显著提高了克隆胚胎的发育能力，提高了胚胎的囊胚率和细胞数；本发明还对克隆胚胎体外培养的培养液进行了摸索，共采用三种培养基即NCSU-23、PZM-3或GIII进行培养，结果表明三种培养基都能用于克隆囊胚的体外培养，其中GIII大大地提高了囊胚的细胞数；同时本发明也在克隆胚胎发育的2-4细胞阶段，在培养基中添加10ng/ml EGF，结果发现可显著提高来自初情期前卵巢卵母细胞的克隆胚的囊胚率。
本发明共移植3头受体母猪(经产)，移植后30d用B超检测确定有前2头妊娠，妊娠率为66.7％(2/3)，高于平均水平30-50％。待孕母猪B790怀孕到期并生下3头仔猪，本次实验克隆猪的出生率1.3％(3/230)，超过了公认的难度效率1％。出生的3头猪，1头存活，出生后一直很健康。本发明极大地降低了体细胞克隆猪的生产成本，并提高了克隆猪生产效率，建立了一整套可用于大规模生产体细胞克隆猪的有效方法。同时体细胞克隆猪生产体系的建立也为开展人类移植器官移植研究及疾病模型建立奠定了基础。
本发明在国际上首次利用4℃冷藏的猪体细胞和初情期前小母猪体外成熟的卵母细胞构建克隆胚胎，在低氧条件下培养克隆胚胎，成功生产体细胞克隆猪。4℃冷藏供体细胞克隆猪的成功，为今后节省利用不易获得的转基因细胞来克隆猪提供了一条有效途径。初情期前母猪卵母细胞体外成熟质量较差，但在实验中很难大规模得到经产母猪的卵子(商品猪一般在初情期前进行屠宰)，这是体细胞克隆猪产业化的一大瓶颈。本发明利用初情期前的卵母细胞进行体外成熟获得克隆猪成功，突破了卵子的制约，为今后大规模工厂化生产克隆猪奠定了坚实的基础。
图1为卵母细胞—卵丘细胞复合体照片图2为成熟的卵母细胞照片图3为低氧下培养的早期克隆胚胎照片图4为体细胞核移植囊胚照片图5为体细胞克隆囊胚Hoechst33342细胞计数照片图6为出生后7天的体细胞克隆猪照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、体细胞核移植技术生产克隆猪的条件优化实验实施例中主要仪器设备超净工作台；体视显微镜；二氧化碳培养箱；显微操作系统；倒置显微镜；拉针仪；断针仪；磨针仪；体视热台；倒置热台；融合仪；正置荧光显微镜实施例中所用各种化学试剂，除特别注明外，均购自美国Sigma-Aldrich公司。
实施例中各种溶液配制DMEM(高糖，购自GIBCO)溶液将DMEM粉末溶于900ml Milli-Q超纯水中，再按产品说明要求加3.7g/L的NaHCO3后，再另外添加0.11g/L丙酮酸钠，3.57g/LHEPES，66mg/L青霉素和100mg/L的硫酸链霉素，调pH至7.2～7.4，然后定容至1L。然后用0.20μm滤膜过滤除菌，分装后储于4℃备用。使用前添加10％-20％的胎牛血清FBS(购自Gibco/Hyclone)，1％非必需氨基酸(NEAA)构成细胞完全培养基。
无钙镁DPBS液(DPBS-)分别取0.20g/L KCl，0.20g/L KH2PO4，8.00g/L NaCl，2.16g/L Na2HPO4·7H2O，溶于900ml Milli-Q超纯水中，调PH至7.2～7.4，然后定容至1L。0.20μm滤膜过滤除菌，或高压灭菌，分装后储于4℃备用。
0.25％(0.25g/100ml)胰蛋白酶组织消化液取0.25g胰蛋白酶Trypsin(1250，购自GIBCO)和0.02g EDTA，用DPBS-定容至100ml后用0.20μm滤膜过滤除菌，分装后储于-20℃备用。
冲卵液0.1％PVA-TL-HEPES即在HEPES缓冲的添加了0.1％(0.1g/100ml)聚乙烯醇(PVA)的台氏液(PVA-TL-HEPES)将6.663g NaCl，0.237g KCl，0.168g NaHCO3，0.041g NaH2PO4，1.868mlNa Lactate，0.102g MgCl2.6H2O，2.383g Hepes，0.065g penicillin G，0.05gstreptomycin sulfate，0.294g CaCl2·2H2O，0.100g polyvinyl alcohol(PVA)，2.186g sorbitol，和0.022g sodium pyruvate溶于700ml Milli-Q H2O中。再用100ml Milli-Q超纯水加热溶解PVA，待PVA溶解且冷却至室温，加入到含有上述成分的700ml Milli-Q H2O的溶液中，调pH为7.2-7.4后用Milli-Q H2O定容至1000ml，使渗透压为295-310mOsm。0.22μm滤器过滤分装，放于4℃保存，存放不超过3周。用于冲取卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)。
DPBS-PVA冲卵液先用100ml Milli-Q水加热融解1g PVA，冷却后再取9.55gDPBS(购自Gibico)粉末，添加Milli-Q水，使之溶解，并定容至1L。用于冲洗COCs和配制脱卵丘液。
NCSU-23(North Carolina State University-23)先取300ml Milli-Q水，再按顺序加入3.178g NaCl，1.053g NaHCO3，0.178g KCl，0.081g KH2PO4，0.147g MgSO4·7H2O，0.125g CaCl2·2H2O，0.500g glucose，0.073g glutamine，0.438gtaurine，0.273g Hypotaurine，0.033g penicillin G，0.025g streptomycin。调pH为7.2-7.4后用Milli-Q H2O定容至500ml，渗透压为280～290mOsm。用于卵母细胞体外成熟基础培养基或者胚胎培养基。0.22μm滤器过滤分装，放于4℃保存，3周内用完。
Porcine zygote medium-3(PZM-3)先取300ml Milli-Q水，再按顺序加入3.156g NaCl，1.053g NaHCO3，0.373g KCl，0.024g KH2PO4，0.049g MgSO4·7H2O，0.308g Ca-lactate·5H2O，0.011g Na-pyruvate，0.073g L-glutamine，0.273ghypotaurine，10ml BME amino acid solution，5ml MEM non-essential amino acidsolution，0.033g penicillin G，0.025g streptomycin。调pH为7.2-7.4后用Milli-Q H2O定容至500ml，渗透压为273～283mOsm。
卵母细胞体外成熟培养液NCSU-23或PZM-3添加10％(体积比)猪卵泡液(PFF)，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10IU/ml人绒毛膜促性腺激素(hCG)和10IU/ml孕马血清促性腺激素(PMSG)，称为无BSA的NCSU-23或PZM-3。
脱卵丘液(0.1％透明质酸酶)取50ml上述制备的DPBS-PVA冲卵液，按100mg/mL加入透明质酸酶，缓慢搅拌，使之溶解并用DPBS-PVA冲卵液定容至100ml，0.20μm针头滤器在超净台内过滤，分装到1.5ml离心管内，-20℃保存备用。
融合/激活液0.25M(4.555g/100ml)Mannitol，0.1mM CaCl2·2H2O(先配成0.147g/100ml，100×母液，再取1ml母液进行稀释)，0.1mM MgCl2·6H2O(先配成0.2033g/100ml，100×母液，再取1ml母液进行稀释)，0.5mM HEPES(先配成1.192g/100ml，100×母液，再取1ml母液进行稀释)，0.01％PVA(0.01g/100ml)，调pH为7.2-7.4后用Milli-Q H2O定容至100ml，渗透压为253～268mOsm。超净台内0.20μm滤器过滤分装，4℃保存。
胚胎操作液(Hepes-NCSU-23(无钙))0.76965g NaCl，0.0168g NaHCO3，0.0356gKCl，0.0162g KH2PO4，0.0293g MgS04·7H20，0.1g Glucose，0.0146g Glutamine，0.15012g Taurine，0.2383g HEPES，0.4g BSA(牛血清白蛋白)，0.0065g PenicillinG，0.005g streptomycin，Milli Q H2O溶解定容至100ml。将上述成分按顺序加入混匀，调pH为7.2-7.4，渗透压为285-300mOsm，0.20μm滤器过滤分装，4℃保存备用。
显微操作液Hepes-NCSU-23(无钙)(上述胚胎操作液)+7.5μg/ml CB(细胞松弛素B)胚胎培养液NCSU-23+0.4％BSA；PZM-3+0.3％BSA；GIII(G1.3和G2.3)购自新视野医疗设备有限公司(武汉市)代理的瑞典VITROLIFE公司的产品。
1、猪胎儿成纤维细胞系的建立及供体细胞的准备对处于妊娠期第33天(配种时期为0天)的中国实验用小型猪(香猪)采用组织块接种法建立胎儿成纤维细胞系，常规细胞传代以及冷冻保存。所用的培养基为DMEM。
供体细胞准备方法待传代2-6次的猪胎儿成纤维细胞生长至90％汇合时，用0.25％胰蛋白酶组织消化液消化、离心，最后加200μL DMEM溶液重悬细胞沉淀，直接提供用作核移植供体细胞(现场消化法)或将消化的细胞再在4℃冰箱保存12h后用作核移植供体细胞(4℃冷藏法)，并比较两者方法得到的克隆胚胎的卵裂率及囊胚率的差异。由核移植供体细胞得到囊胚的实验方法见参考文献(张运海等利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎，中国科学，C辑，2005，35(5)439-445)。结果如表1所示，表明采用胰蛋白酶消化离心收获细胞做供体的现场消化法以及4℃冷藏法提供核移植供体细胞，两种供体细胞准备方式对克隆胚胎发育的影响没有显著差异(表1)。
表1供体细胞准备方式对克隆胚胎发育的影响
卵裂率＝卵裂数/培养胚胎数；囊胚率＝囊胚数/培养胚胎数；同一栏内上标不同表示差异显著(P＜0.05).
4℃冷藏法可以充分利用较多的供体细胞，在进行转基因克隆猪的制备时尤为重要，丰富了核移植供体细胞的准备方式。
2、卵母细胞体外成熟从屠宰场取初情期前小母猪的卵巢，放入30-35℃的生理盐水(添加青霉素10万IU/升、链霉素50mg/升)中，2h内运回实验室。用配有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。将抽取液放于50ml离心管中37℃水浴，而后用0.1％PVA-TL-HEPES洗涤2遍，再分别放入直径60mm的塑料培养皿。在体式显微镜下，用口吸管分别挑选卵丘包裹3层以上、致密、而且胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte-compl exes，COCs)(图1)，用卵母细胞体外成熟培养液洗涤3遍再转入在培养箱中至少已经平衡4h的塑料培养皿中成熟培养液滴内(每100μl液滴放25枚)，每一直径35mm的塑料培养皿中做4个液滴，用胚胎级矿物油覆盖。COCs先在卵母细胞体外成熟培养液中培养20±2h；然后换新鲜的卵母细胞体外成熟培养液的微滴中继续培养20±2h，实验设计为2×2的实验上述2种不同的卵母细胞体外成熟培养液(NCSU-23或PZM-3添加10％(体积比)猪卵泡液(PFF)，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10IU/ml人绒毛膜促性腺激素(hCG)和10IU/ml孕马血清促性腺激素(PMSG))和2种不同氧浓度条件，该2种不同氧浓度条件分别为含有5％(体积比)CO2的空气(约含有20％(体积比)O2)或7％(体积比)O2，5％(体积比)CO2，88％(体积比)N2的混合气；温度为39℃，湿度为100％。在成熟培养终止后，用脱卵丘液脱去卵丘细胞。在体视镜下拨出排出第一极体的成熟卵母细胞(图2)，统计计数分析体外成熟率。
成熟培养液和氧浓度对卵母细胞成熟率的影响结果如表2所示，结果表明卵母细胞成熟培养在NCSU-23培养基中，高氧(20％O2)和低氧(7％O2)对卵母细胞核的成熟无影响(84.8％vs.80.1％)，而卵母细胞成熟培养在PZM-3培养基中，高氧(20％O2)下卵母细胞核的成熟显著高于低氧(7％O2)(P＜0.05，75.4％vs.58.7％)。
表2不同成熟培养液和氧分压对卵母细胞成熟影响
*20％含5％CO2的空气；7％5％CO2，7％O2，88％N2.同一栏内上标不同表示差异显著(P＜0.05).
3、体外成熟卵母细胞的激活与体外培养将形态较好的上述体外成熟卵母细胞转移到融合/激活液中平衡20秒，用融合/激活液洗涤3遍后，每批40个左右放入已经铺满融合/激活液的融合槽内(电极宽度为500μm，美国BTX)，用ECM2001融合仪(BTX)施加一个30μs，1.2KV/cm的直流电脉冲诱导激活。取出处理好的卵母细胞，在NCSU-23+4mg/mL BSA+10μg/mlCB(细胞松弛素B)液中洗涤3遍后，转入石蜡油覆盖并预先在CO2培养箱(5％CO2的空气，温度为39℃，湿度为100％)中平衡2小时的NCSU-23+4mg/ml BSA+10μg/ml CB微滴内培养3-5小时，再取出用NCSU-23+4mg/ml BSA洗三遍后转移到石蜡油覆盖并预先在CO2培养箱中(含5％CO2的空气，温度为39℃，湿度为100％)平衡至少2小时的胚胎培养液(NCSU-23+4mg/ml BSA或PZM-3+0.3％(0.3g/100ml)BSA)微滴中继续培养。液滴大小为50μL，每个液滴中放20-25个卵。气相条件为含5％CO2的空气中(高氧)或7％O2，5％CO2，88％N2(低氧)的混合气中，39℃，100％湿度培养168h观察记录囊胚率。胚胎培养在NCSU-23中5％CO2的空气和7％O2，5％CO2，88％N2的混合气培养168小时囊胚率分别为28.5±7.5和19.7±2.5，在PZM-3中5％CO2的空气和7％O2，5％CO2，88％N2的混合气培养168小时囊胚率分别为18.7±4.7和26.1±4.6。成熟培养液和氧分压孤雌激活胚胎发育影响如表3所示，表3中为168h后观察结果，两种培养液的基础培养基NCSU-23和PZM-3高氧和低氧下成熟的卵母细胞对孤雌胚的囊胚率和囊胚细胞数无显著影响(表3)。
表3成熟培养液和氧分压对孤雌激活胚胎发育的影响
20％O2含5％CO2的空气；7％O25％CO2，7％O2，88％N2.
4、体细胞核移植将步骤1中4℃保存的供体细胞以及排出第一极体的成熟卵母细胞同时转入显微操作液滴(Hepes-NCSU-23(无钙)+7.5μg/ml CB(细胞松弛素B))中，然后在显微操作仪上用固定吸管(外径100-120μm)吸持卵母细胞，用内径15-25μm的去核/注射针盲吸法去核，吸取第一极体及相邻的10-20％可能含有卵母细胞核的胞质。挑选直径15-20μm圆形光滑的供体细胞，从去核切口放入卵周隙。每批操作30个卵母细胞，结束后将供体细胞-卵胞质构成的细胞对(重构卵)转移到NCSU-23+4mg/mL BSA(牛血清白蛋白)中，在39℃，含有5％(体积比)CO2的空气100％湿度培养箱中恢复0.5h。
5、重构卵融合与激活将恢复好的重构卵分批转移到融合/激活液中平衡2min，融合/激活液由0.25M甘露醇，0.1mM氯化钙，0.1mM氯化镁，0.5mM HEPES以及0.01％PVA组成，每批5个放入已经铺满融合/激活液的融合槽内(电极宽度为500μm)，用实心玻璃针使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪(BTX，USA)施加一个50μs、2.0KV/cm的直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤，转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃，含有5％CO2的空气(约含20％的O2)，100％湿度下培养0.5-1小时后取出判定融合。
6、体细胞核移植胚胎体外培养(1)胚胎培养阶段氧分压和培养基对猪核移植胚胎发育的影响将融合激活的胚胎分别转入下述6种不同条件下培养1)NCSU-23+4mg/mLBSA胚胎培养液滴内培养，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2的混合气；2)PZM-3+3mg/mL BSA胚胎培养液滴中培养，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2的混合气；3)NCSU-23+4mg/mL BSA胚胎培养液滴中培养，培养条件为39℃，100％湿度，含有5％CO2的空气；4)PZM-3+3mg/mL BSA胚胎培养液滴中培养，培养条件为39℃，100％湿度，含有5％CO2的空气；5)将融合激活的胚胎转入G1.3(GIII)+1mg/mL BSA培养3天，然后转入G2.3(GIII)+5mg/ml BSA中继续培养3天，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2的混合气；6)将融合激活的胚胎转入G1.3(GIII)+1mg/mL BSA培养3天，然后转入G2.3+5mg/mlBSA中继续培养3天，培养条件为39℃，100％湿度，含5％CO2的空气条件。每30μL的液滴培养8-10枚重构胚，在培养的第168h时统计卵裂率情况和囊胚形成结果及囊胚细胞数，囊胚细胞数用Hoechst33342染色计数(图5)。统计结果以统计分析软件SAS 8.2的t检验进行分析，P＜0.05差异显著。
胚胎培养阶段氧分压和培养基对猪核移植胚胎发育的影响如表4所示，低氧、高氧浓度(7％O2和20％O2)和NCSU-23、PZM-3、GIII三种培养基对胚胎发育的影响，在低氧条件(7％O2)下提高了胚胎的囊胚率和细胞数(PZM-3中的低氧囊胚率低于高氧)，三种培养基差异不显著。其中，培养基NCSU-23在7％O2气相下，囊胚率和囊胚细胞数提高显著(P＜0.05，17.7±2.5％vs 8.2±1.2％；46.3±9.6vs31.0±2.1)，而PZM-3在低氧气下只能显著提高囊胚的细胞数(P＜0.05，49.4±9.8vs 36.6±2.1)，对囊胚率无显著影响(P＞0.05，10.9±4.5％ vs.11.2±3.6％)。GIII(7％O2)能显著提高囊胚的细胞数，平均数可达64.3。GIII(20％O2)培养胚胎的囊胚率和细胞数都显著降低，囊胚率和细胞数分别为5.6±5.2％和43.2±7.6。
GIII是最近依据人的输卵管和子宫液研制的胚胎培养液，一个分两阶段培养换液的培养基即G1.3/G2.3，能适应不同胚胎发育阶段对能量(葡萄糖)和氨基酸的需要，它能提高多种动物胚胎发育的质量。上述实验结果表明猪胚胎在GIII(适合低氧的培养基)可收回10％左右的囊胚，并极大提高了囊胚的细胞数，细胞数的提高可能因为它是一个较完备的培养基。G1.3/G2.3有着平衡的营养成分，葡萄糖的浓度分别为0.5mM和3.15mM，含有适宜浓度的丙酮酸、乳酸以及氨基酸和维生素等。而NCSU-23则是含较高浓度葡萄糖(5.5mM)、谷胺酰氨和牛磺酸的一步培养基，配方不含丙酮酸、乳酸、维生素和其他氨基酸。对这三种培养基的培养效果分析将有利于进一步改进培养基。
表4不同氧分压和胚胎培养基对猪核移植胚胎发育的影响
*20％含有5％CO2的空气；7％5％CO2，7％O2，88％N2.a，b，c同一栏内上标不同差异显著(P＜0.05)(2)胚胎培养基NCSU-23中添加EGF对克隆胚发育的影响将融合激活的胚胎转入NCSU-23+4mg/mL BSA胚胎培养液滴内培养，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2的混合气体条件培养至2-4细胞阶段(36h)。在2-4细胞阶段(36h)在NCSU-23+4mg/mL BSA添加10ng/mL EGF，一部分未添加EGF作为对照组，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2的混合气体条件培养至第168h时统计囊胚形成结果及囊胚细胞数。培养基中EGF的添加对克隆胚胎发育的影响如表5所示，结果表明与未添加EGF的对照组相比，培养基中添加10ng/ml EGF的处理组显著提高了克隆胚胎的囊胚形成率(P＜0.05，25.8±7.6％vs.8.3±8.3％)。
表5胚胎培养基NCSU-23中添加EGF对克隆胚发育的影响
a，b同一栏内上标不同表示差异显著(P＜0.05).
该实验表明将氧分压从20％降低到5-10％，大大提高了胚胎的发育潜能，为大量生产胚胎提供了可能性。低氧(7％氧)条件下培养早期克隆胚胎，更接近体内环境，囊胚体外发育率可达10-30％。常规培养方法是在20％氧分压下，一般囊胚体外发育率不超过20％，可能高氧会产生更多的氧自由基而有害于胚胎的发育。同时在培养基NCSU-23中添加10ng/ml EGF显著提高了克隆胚胎的囊胚形成率。
实施例2、克隆猪的培育1、体细胞核移植胚胎的获得对处于妊娠期第33天(配种时期为0天)的中国实验用小型猪(香猪)采用组织块接种法建立猪胎儿成纤维细胞系，常规细胞传代以及冷冻保存。所用的培养基为上述制备的DMEM溶液。待传代2-6次的猪胎儿成纤维细胞生长至90％汇合时，用0.25％(0.25g/100ml)胰蛋白酶组织消化液常规方法消化、离心，最后加200μL DMEM溶液重悬细胞沉淀，再在4℃冰箱保存12h后用作核移植供体细胞(4℃冷藏法)。
从屠宰场取初情期前小母猪的卵巢，按照将实施例1中步骤2的方法进行卵母细胞的成熟培养。在成熟培养终止后，用脱卵丘液脱去卵丘细胞。在体视镜下拨出排出第一极体的成熟卵母细胞(图2)。将成熟卵母细胞按照实施例1中步骤4的方法进行体细胞核移植得到供体细胞-卵胞质构成的细胞对(重构卵)。
按照实施例1步骤5的方法将重构卵融合与激活，将融合激活的胚胎转入胚胎培养液滴内，按照实施例1步骤6的方法，在NCSU-23+4mg/mL BSA培养基中培养，每30μL的液滴培养8-10枚重构胚，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2培养36h至2-4细胞阶段(图3)。2-4细胞阶段后一部分继续在NCSU-23+4mg/mL BSA添加10ng/mL EGF的微滴中CO2养箱中培养，培养条件为39℃，100％湿度，7％O2、5％CO2、88％N2的混合气体条件，培养168h后观察胚胎发育到囊胚的情况，得到体细胞核移植囊胚(图4)。
2、胚胎移植与妊娠维持和检测在构建克隆胚的当天，挑选自然发情的3头经产二元母猪(长白猪×大白猪、大白猪×长白猪)B792、B790和P1652，开始发情的标准为站立反射。次日胚胎移植前，硫喷妥钠常规麻醉，在手术架上侧卧保定，侧腹部做一个长约8cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植管(Agtech Inc.USA)沿输卵管伞进入约5cm，将步骤1得到的体细胞核移植早期胚胎(培养12-30h)移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。B792受体母猪移植了150枚克隆胚胎，B790受体母猪本交后移植了少量胚胎(20枚)，P1652受体母猪移植了中等数量(60枚)的克隆胚胎。胚胎移植后第10天待孕母猪肌肉注射1000IU PMSG(天津华孚高新生物技术公司)，第13天注射800IU hCG(宁波第二激素厂)。胚胎移植后30天B型超声波(Pie Medical，Holand/Netherland)检测妊娠与否，结果表明B792和B790妊娠。然后于第50天、70天和90天超声波跟踪检测胎儿发育情况。其中全部移植克隆胚胎的B792怀孕足月，在第115天注射前列腺稀醇诱导分娩，于第116天自然产下3头黑色仔猪(表6)，克隆猪的生产效率为1.3％(3/230)。其中一头存活(图6)，出生后一直很健康。
表6克隆胚胚胎移植后的体内发育
3、微卫星DNA分析应用微卫星DNA分析法检测体细胞克隆猪的基因型是否与供体细胞一致，DNA样品来源于步骤1的香猪胎儿成纤维细胞系(供体细胞系)、B792生产的2头克隆猪和受体母猪B792的耳部组织及1头随机抽样的分娩母猪(长白猪×大白猪)耳部组织和2头随机抽样的仔猪(长白猪×大白猪)尾尖组织。选取7对分布于不同染色体的荧光标记的微卫星引物(S0070、S0714、S072、SW1111、S742、S830和S857)，按优化的反应条件对上述基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为在20μl反应体系中，含10×PCR缓冲液2μl，Taq酶1.0U、20ng/μL DNA模板1μL，每种引物10μmol/L各1.0μL，ddH20补足20μl。PCR反应条件为，94℃变性5min，94℃30s，55℃(或60℃)30s，72℃30s共35循环，接着72℃延伸7min，最后4℃保温。PCR扩增产物在ABI377全自动测序仪上进行电泳，以软件Genescan3.1对电泳结果进行基因型分析。
微卫星鉴定结果表明，7对微卫星DNA分析(表7)证实2头克隆猪和供体细胞系的基因型完全一致，而与受体母猪、随机抽样的分娩母猪、随机抽样的仔猪无任何相关。说明克隆猪的遗传物质完全来自供体细胞。
表7供体细胞、代孕母猪和克隆猪的7个微卫星位点基因型
权利要求
1.一种生产体细胞克隆猪的方法，是以猪胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞，以体外成熟的初情期前母猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞构建成克隆胚胎，所述克隆胚胎在氧气体积百分含量为5-10％的气相条件下进行体外培养得到早期胚胎，将所述早期胚胎移植入待孕母猪妊娠并生产体细胞克隆猪。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述猪胎儿成纤维细胞是经过下述方法处理的现消化现用或消化后再2-8℃冷藏2-24小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述体外成熟的初情期前母猪卵母细胞是将初情期前母猪卵母细胞在无BSA的NCSU-23或无BSA的PZM-3成熟培养液中培养得到的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述克隆胚胎在氧气体积百分含量为7％的气相条件下进行体外培养得到早期胚胎。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述气相条件为含7％O2、5％CO2、88％N2的混合气体，所述百分含量为体积百分含量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述体细胞克隆胚胎的体外培养所用的基础培养基为NCSU-23、PZM-3或GIII。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述体细胞克隆胚胎的体外培养所用的基础培养基为NCSU-23。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述体细胞克隆胚胎的体外培养的培养基，在体细胞克隆胚胎发育至2-4细胞阶段前为NCSU-23、PZM-3或GIII；在体细胞克隆胚胎发育的2-4细胞阶段及2-4细胞阶段后为添加1-10ng/ml EGF的NCSU-23、PZM-3或GIII。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述体细胞克隆胚胎的体外培养所用的培养基，在体细胞克隆胚胎发育至2-4细胞阶段前为NCSU-23；在体细胞克隆胚胎发育的2-4细胞阶段及2-4细胞阶段后为添加1-10ng/ml EGF的NCSU-23。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述EGF的添加浓度为10ng/ml。
全文摘要
本发明公开了一种生产体细胞克隆猪的方法。该方法是是以猪胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞，以体外成熟的初情期前母猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞构建成克隆胚胎，所述克隆胚胎在氧气体积百分含量为5－10％的气相条件下进行体外培养得到早期胚胎，将所述早期胚胎移植入待孕母猪妊娠并生产体细胞克隆猪。该方法极大地降低了体细胞克隆猪的生产成本，并提高了克隆猪生产效率。
文档编号C12N15/06GK1810967SQ20061000319
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月22日 优先权日2006年2月22日
发明者潘登科, 张运海, 戴蕴平, 李宁 申请人:李宁