专利名称：一种水牛体细胞克隆的方法
技术领域：
本发明属生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。
背景技术：
动物体细胞克隆是20世纪末期生物技术领域的一项划时代的重大突破，它不仅证明了分化了的成年动物体细胞在适宜的条件下可以恢复到发育的起始状态，发育成为一个完整个体，而且对加快动物的遗传改良速度、提高转基因动物的效率具有非常广阔的应用前景。虽然体细胞克隆已先后在牛，小鼠，大鼠，猪，山羊，马和骡等多种动物身上取得成功，但水牛则由于地域分布和卵子发育潜能低等原因，这一物种的克隆(包括胚胎细胞克隆的水牛)在国际上至今尚未取得成功。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用水牛体细胞克隆水牛的方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题1.受体卵母细胞的成熟和去核在成熟培养液中添加牛卵泡液(BFF)和上皮细胞生长因子(EGF)，在纺锤体图像系统(Spindle View)下去核。
2.供体细胞的培养处理用DNA合成的抑制剂Aphidincolin培养处理供体细胞，然后进行饥饿培养。
3.重组胚的激活和体外培养采用离子霉素(ionomycin)和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)联合激活，用改良的TCM199加发情牛血清(OCS)进行胚胎的体外的培养。
用本发明的方法进行水牛体细胞克隆，已于2004年11月19日获得了世界首例体细胞克隆水牛，2005年3月17日获得了世界首例成年体细胞克隆水牛，为水牛体细胞克隆和定向遗传改良迈出了重要的一步。
图1是本发明受体卵母细胞在Spindle View显微镜下去核的情况。左图为卵母细胞尚未去核，右图是核已取出的情况；其去核成功率达到100％。
图2是本发明获得的水牛体细胞克隆胚胎。
图3是本发明获得的体细胞克隆水牛(图中的小牛)。
具体实施例方式
为提高卵母细胞的发育潜能，卵母细胞在TCM199(即组织培养液199号)+5％OCS(即发情牛血清)+2％BFF(即牛卵泡液)+10ng/ml EGF(即上皮细胞生长因子)的成熟液中培养20～22h；为提高去核率，保证重组胚的正常发育，用0.15～0.25％的透明质酸酶去掉卵丘细胞后，在Spindel View显微镜下去核。供体细胞经传代培养后，为使供体细胞同期在G0/G1期，用0.1～0.2μg/ml的Aphidicolin(一种DNA合成的抑制剂)培养处理24h，然后在含0.5％胎牛血清(FCS)的培养液中培养2～5d。经培养处理的供体细胞用0.2％的胰蛋白酶消化1～2min，然后注射到去核的受体卵母细胞卵周隙中，通过电融合诱导供体细胞与受体卵母细胞质膜的融合，形成重组胚。为充分激活重组胚，保证重组胚的体外正常发育，重组胚用5μmol/L的离子霉素激活处理5～10min，再在2mmol/L 6-DMAP(一种蛋白质磷酸化的抑制剂)中培养处理2～4h，而后置于含30μl培养液(改良的TCM199+5％OCS)的颗粒细胞单层细胞微滴中，在含5％CO2的38.5℃培养箱中培养6～7d，使其发育到囊胚阶段。获得的囊胚直接移植到受体母水牛子宫角内，或经冷冻保存后再移植到受体母水牛子宫角内。采用本发明的方法，重组胚的分裂率达到70～80％，囊胚发育率达到30％。至申请日为止，本发明的申请人已获得7头受孕的母水牛的成果，其中两头流产，两头分娩，三头待产。
实施例12003年12月5日，我们用本发明的方法对经传代培养(3代)的雌性水牛胎儿成纤维细胞用0.1μg/ml的Aphidicolin培养处理24h，然后用含0.5％FCS的培养液饥饿培养5d。于2003年12月11日将这些培养处理的细胞移植到去核的本地水牛卵母细胞内，构建成重组胚。重组胚经过6天培养形成囊胚，于2003年12月17日移植到受体水牛子宫内。经过343天妊娠后，于2004年11月19日剖腹产获得一头雌性克隆水牛。这头克隆牛的体重为29kg，性别与供体细胞一致，经微卫星DNA鉴定，该克隆水牛与供体细胞完全一致。
实施例22004年3月31日，我们用0.1μg/ml的Aphidicolin对传代培养(5代)的成年水牛卵巢颗粒细胞培养处理24h，然后用含0.5％FCS的培养液饥饿培养3d。2004年4月4日，用这些培养处理的水牛卵巢颗粒细胞作为供体细胞，与去核的本地水牛卵母细胞重组形成重构胚，经过6天体外培养形成克隆囊胚。2004年4月10日，将克隆囊胚非手术移植到受体水牛子宫内，经过348天妊娠后，于2005年3月17日顺产一头雌性克隆水牛。这头克隆水牛的体重为23kg，体长为86cm，体高62.5cm，性别与供体细胞一致。经微卫星DNA鉴定，证实该克隆水牛的确来自供体细胞。
权利要求
1.一种水牛体细胞克隆的方法，其特征是工艺步骤为(1)受体卵母细胞的成熟和去核在成熟培养液中添加牛卵泡液和上皮细胞生长因子，在纺锤体图像系统下去核；(2)供体细胞的培养处理用DNA合成的抑制剂Aphidicolin培养处理供体细胞，然后饥饿培养；(3)重组胚的激活和体外培养采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤联合激活，用改良的组织培养液199号加发情牛血清进行胚胎的体外的培养。
全文摘要
一种水牛体细胞克隆的方法，其工艺步骤为在成熟培养液中添加牛卵泡液和上皮细胞生长因子培养受体卵母细胞，在纺锤体图像系统下去核；用DNA合成的抑制剂Aphidicolin培养处理供体细胞，再饥饿培养；采用离子霉素和6－二甲氨基嘌呤联合激活重组胚，用改良的TCM199加发情牛血清进行胚胎的体外的培养。用本发明的方法进行水牛体细胞克隆，已获得成功，并获得了世界首例成年体细胞克隆水牛。
文档编号C12N5/06GK1733907SQ200510019068
公开日2006年2月15日 申请日期2005年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者石德顺, 陆凤花, 杨素芳, 韦英明 申请人:广西大学