专利名称：一种白藜芦醇的生物生产方法
技术领域：
本发明所属生物医药技术领域，更具体说，特别涉及一种白藜芦醇的生产方法。
背景技术：
白藜芦醇(resveratrol,res),其化学名为3,4’，5-三轻基-反式-二苯乙烯，也称芪三酹，分子式为C14H12O3,分子量为228. 2。纯品为无色针状晶体,难溶于水(25°C时为
O.03g/L)，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。随着对白藜芦醇的研究的不断深入，人们发现白藜芦醇具有广泛的生理药理活性，包括抗癌活性、抗氧化作用、保护心血管作用、 清除自由基、抗炎作用、抗菌作用、免疫调节作用、雌激素样活性等。因此，白藜芦醇在保健品、化妆品、药品等领域拥有广阔的市场前景。白黎芦醇属于非黄酮类的多酚化合物，在自然界分布广泛，目前至少在21个科， 31个属的72种植物中发现。到目前为止，从植物中提取仍是生产白藜芦醇的最主要的方法。国外主要从葡萄皮和葡萄籽中提取，国内则从中药虎杖等中提取。我国目前是白藜芦醇植物提取物的主要生产国家。提取方法为先用溶剂渗滤提取或加热回流提取，再对提取物进行萃取分离。提取溶剂多用甲醇、乙醇和乙酸乙酯。此法存在周期长、有效成分损失大、 提取率低等缺点。近年来出现了一些新的提取技术，如酶提法、CO2超临界萃取法、微波萃取法、超声萃取法等等。但仍然不能解决植物提取法面临的根本问题，如植物原料受限和质量不稳定、生产能力低、种植受到季节和地理位置的限制等等。虽然已有化学全合成白藜芦醇的报道，但步骤复杂，产率低，环境污染严重。近年来，随着生物技术的不断进步，使用重组微生物生产白藜芦醇成为备受关注的方法。白黎芦醇的生物合成途径属于苯丙氨酸-丙二酸途径。白藜芦醇的从头生物合成途径为以L-苯丙氨酸为底物,经苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine lyase PAL)、肉桂酸-4-轻化酶(cinnamate-4-hydroxylase C4H)催化，或以L-酪氨酸为底物，酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase TAL)催化生成对香豆酸；再经4_香豆酰辅酶A连接酶 (coumaroyl-CoA4CL)、白藜芦醇合酶(resveratrol synthase RS),最终生成白藜芦醇。 Watts等将拟南芥的4CL基因和花生的RS基因转入大肠杆菌中，在培养基中加入对香豆酸为底物，合成了白藜芦醇。Katsuyama等将深红酵母的PAL、紫草的4CL和花生的RS基因同时转入大肠杆菌中，以酪氨酸为底物，合成了白藜芦醇。专利CN101160393使用L-苯丙氨酸或者L-酪氨酸为底物，使用PAL、C4H、4CL、RS或者TAL、4CL、RS在酵母中合成了白藜芦醇。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种改进的白藜芦醇的生物生产方法，通过构建重组工程菌株，在不添加底物的情况下实现白藜芦醇的从头合成，使生产成本最低化。本发明的目的通过下述技术方案予以实现
一种白藜芦醇的生物生产方法，按照下述步骤进行首先(即步骤I)设计并优化苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)、酪氨酸氨解酶基因 (TAL)、4_香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)和白藜芦醇合酶(RS)的基因序列，并全合成这些目标基因；其次(即步骤2)使用酶切连接的方法将获得的目标基因连接到表达载体上；然后(即步骤3)将构建好的表达载体转化到菌株中，得到重组工程菌株；最后(即步骤4)对重组菌株进行发酵，并从发酵产物中分离纯化白藜芦醇。上述步骤I中设计并优化后获得的基因序列如序列表所示。其中所述苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)优选斯氏假单胞杆菌的苯丙氨酸羟化酶基因序列，使用jcat (http://www. jcat. de)对其进行密码子优化,用于在大肠杆菌BW25113 和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为786bp，序列如序列表SEQID NO. I所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。所述酪氨酸氨解酶基因(TAL)优选黄孢原毛平革菌的酪氨酸氨解酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达,优化后的基因长度为2214bp，序列如序列表SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。所述4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)优选天蓝色链霉菌的4_香豆酰辅酶A连接酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为1569bp，序列如序列表SEQ ID NO. 7所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。所述白藜芦醇合酶基因(RS)优选虎杖的白藜芦醇合酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为1167bp，序列如序列表SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。所述步骤3中的菌株为大肠杆菌BW25113或者谷氨酸棒状杆菌ATCC21673，所述谷氨酸棒状杆菌选用来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区霄云路32号， 100027)提供的谷氨酸棒状杆菌ATCC21673 ;所述大肠杆菌选用来自日本国家遗传研究所 (矢田1111，三岛，静冈县411-8540，日本)提供的大肠杆菌BW25113。目前白藜芦醇的生产主要是从植物中提取，对自然资源破坏严重。本发明提供了一种用生物发酵生产白藜芦醇的方法，使用基因工程大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌 ATCC21673，进行发酵生产白藜芦醇，不需底物添加即可利用工程菌株的代谢产物和异源表达的基因实现合成白藜芦醇，实现了白藜芦醇的从头合成。本发明可以解决白藜芦醇的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
图I是本发明的白藜芦醇生物合成路线2是本发明中pEC-mP-mT-m4-mR质粒构建过程示意3是各个基因在重组大肠杆菌中进行异源表达的电泳结果(泳道I :空白对照； 泳道2 mPAH基因表达结果；泳道3 mTAL基因表达结果；泳道4 mRS基因表达结果；泳道 5 m4CL基因表达结果)
图4是构建白藜芦醇工程菌株发酵检测结果高效液相色谱图(HPLC检测结果)，其中A为白藜芦醇标准品的HPLC检测结果；B为白藜芦醇工程谷氨酸棒状杆菌发酵检测HPLC 结果；C为白藜芦醇工程大肠杆菌发酵检测HPLC结果
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。使用JCAT在线基因设计软件，根据已发表的基因序列，保守设计并优化苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)、酪氨酸氨解酶基因(TAL)、4_香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)和白藜芦醇合酶(RS)的基因序列，并全合成这些目标基因，其中FASTpfu酶购买于北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶，购买于富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)序列优化与获得优选斯氏假单胞杆菌的苯丙氨酸轻化酶基因序列，使用jcat (http ://www. jcat. de)对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达， 优化后的基因长度为786bp，序列如序列表SEQ ID NO. I所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。设计引物如下PAH-UP CGGAGCTCGAAAGGAGGTTCACCATGAAGACCACCCACTACGT (Sac I 酶切位点)(SEQ ID NO. 2)PAH-DOffN GGGGTACCCCTTTGAATTAAGCAGCCTTTGGTGGGAA(Kpn I 酶切位点)(SEQ IDN0. 3)使用FASTpfu 酶进行 PCR，PCR 反应条件为95°C，5min，I 个循环；95°C，40s，53°C， 30s，72°C，30s，共30个循环；72°C，lOmin，I个循环；4°C保存。PCR得至Ij 800bp左右的目标片段。将得到的PCR产物进行纯化后用Sac I和Kpn I酶进行酶切，连接到pEC_XK99E质粒上，构建重组质粒pEC-mPAH，并转化大肠杆菌BW25113，以引物PAH-UP和PAH-DOWN进行菌落PCR验证，将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。酪氨酸氨解酶基因(TAL)序列优化与获得优选黄孢原毛平革菌的酪氨酸氨解酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为 2214bp，序列如序列表SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。设计引物如下TAL-UP GGGGTACCCCAAAGGAGGTGAGTAATGCCATCCCGCATCGACTA (Kpn I 酶切位点)(SEQ ID NO. 5)TAL-DOffN GCTCTAGAGCTCCCCTAGATCCTTTAAGCCTTGATGGACTTAA(Xba I 酶切位点)(SEQ ID NO. 6)使用FASTpfu 酶进行 PCR，PCR 反应条件为95°C，5min，I 个循环；95°C，40s，63°C， 30s，72°C，30s，共30个循环；72°C，lOmin，I个循环；4°C保存。可得到2200bp左右片段。将得到的PCR产物进行纯化后用Kpn I和Xba I酶进行酶切，连接到pEC_XK99E质粒上，构建重组质粒pEC-mTAL，并转化大肠杆菌BW25113，以引物TAL-UP和TAL-DOWN进行菌落PCR验证，将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)序列优化与获得优选天蓝色链霉菌的4-香豆酰辅酶A连接酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为1569bp，序列如序列表SEQ ID NO. 7所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。设计引物如下4CL-UP GCTCTAGAGCAAAGGAGGATATACGTTTTCCGCTCCGAGTACGC (Xba I 酶切位点)(SEQ ID NO. 8)4CL-D0WN CATGTCGACATGGTGGGCGGGCGGTTAGCGTGGCTCGCGCAGCT (Sal I 酶切位点)(SEQ ID NO. 9)使用FASTpfu 酶进行 PCR，PCR 反应条件为95°C，5min，I 个循环；95°C，40s，60°C， 30s，72°C，lmin，共30个循环；72°C，lOmin，I个循环；4°C保存。PCR得至Ij 1500bp左右的目标片段。将得到的PCR产物进行纯化后用Xba I和Sal I酶进行酶切，连接到pEC_XK99E 质粒上，构建重组质粒pEC-m4CL，并转化大肠杆菌BW25113，以引物4CL-UP和4CL-D0WN进行菌落PCR验证，将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。白藜芦醇合酶基因(RS)序列优化与获得优选虎杖的白藜芦醇合酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，用于在大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673的表达，优化后的基因长度为1167bp，序列如序列表SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列，并进行片段全合成。设计引物如下=RS-UP :CATGTCGACATGAAAGGAGGTACTATATGGCTGCTTCCACCGAGGAG(Sal I 酶切位点)(SEQ ID NO. 11)RS-DOffN CCCCTGCAGGGGTTCAATCATTTTGAGTTAGATGATTGGAACGGA(Sbf I 酶切位点)(SEQ ID NO. 12)使用FASTpfu 酶进行 PCR, PCR 条件为95°C，30s，I 个循环；95°C，10s, 50°C，30s, 72°C，lmin20s，共30个循环；72°C，lOmin，I个循环；4°C保存。PCR得至Ij 1200bp左右的目标片段。将得到的PCR产物进行纯化后用Sal I和SbfI酶进行酶切，连接到pEC-XK99E质粒上，构建重组质粒pEC-mRS，并转化大肠杆菌BW25113，以引物RS-UP和RS-DOWN进行菌落 PCR验证，将验证得到的阳性克隆株进行测序验证。将已构建好的重组质粒pEC-mPAH、pEC_mTAL、pEC_m4CL、pEC-mRS电击转化进入大肠杆菌BW25113中，得到分别含有mPAH、mTAL、m4CL、mRS基因的重组菌株。将得到的菌株在LB培养基中37°C、220转/分过夜培养。将100 μ L过夜培养的大肠杆菌菌液加入IOmL含有抗生素的LB培养基中，培养
2.5小时，当0D600达到O. 6后，加入ImM的IPTG诱导表达，继续培养3小时后结束。取 ImL菌液离心收集菌体，用PBS缓冲液冲洗后加入250 μ L上样缓冲液。水浴煮沸IOmin后获得蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如附图所示，说明各个基因在重组大肠杆菌BW25113中均实现了异源表达。将合成白藜芦醇所需的4个基因串联到PEC-XK99E载体质粒上，以利于在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中表达。如上述实施步骤，PCR扩增得到各个目标基因，依次连接到 PEC-XK99E载体质粒上，构建重组质粒pEC-mP-mT-m4-mR，质粒构建过程如附图所示。将构建好的载体分别电击转化大肠杆菌BW25113和谷氨酸棒状杆菌ATCC21673中，得到白藜芦醇生产工程菌。于平板上挑取白藜芦醇生产工程菌大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌单菌落，加入LB培养基中，分别在37°C和30°C 220r/min过夜培养。取ImL菌液加入IOOmL的LB培养基中，37°C和30°C 220r/min培养4小时后加入ImM的IPTG，继续培养48小时发酵结束。取ImL发酵液12000r/min离心3分钟，取上清，用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。高效液相色谱条件如下色谱柱C18(4.6X250mm);流动相为体积为45%甲醇的水溶液；流速lmL/min ;进样量20 μ L ;柱温室温；紫外检测器，检测波长304nm。如图所示，HPLC检测结果分析表明，用所构建的工程菌进行发酵生产，高效合成了白藜芦醇(与标准样品相比，在相同的保留时间出生成白藜芦醇的峰，其余保留时间出现的杂质可通过离心或者过滤等手段予以分离)。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种白藜芦醇的生物生产方法，其特征在于，按照下述步骤进行步骤1，首先设计并优化苯丙氨酸羟化酶基因、酪氨酸氨解酶基因、4-香豆酰辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合酶的基因序列，并全合成这些目标基因；步骤2，其次使用酶切连接的方法将获得的目标基因连接到表达载体上；步骤3，然后将构建好的表达载体转化到菌株中，得到重组工程菌株；步骤4，最后对重组菌株进行发酵，并从发酵产物中分离纯化白藜芦醇。
2.根据权利要求I所述的一种白藜芦醇的生物生产方法，其特征在于，其中所述苯丙氨酸羟化酶基因优选斯氏假单胞杆菌的苯丙氨酸羟化酶基因序列，使用 jcat对其进行密码子优化，序列如序列表SEQ ID NO. I所述的核苷酸序列；所述酪氨酸氨解酶基因优选黄孢原毛平革菌的酪氨酸氨解酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，序列如序列表SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；所述4-香豆酰辅酶A连接酶基因优选天蓝色链霉菌的4-香豆酰辅酶A连接酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，序列如序列表SEQ ID NO. 7所述的核苷酸序列；所述白藜芦醇合酶基因优选虎杖的白藜芦醇合酶基因序列，使用jcat对其进行密码子优化，序列如序列表SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的一种白藜芦醇的生物生产方法，其特征在于，所述步骤3中的菌株为大肠杆菌BW25113或者谷氨酸棒状杆菌ATCC21673。
全文摘要
本发明公开了一种白藜芦醇的生物生产方法，使用酶切连接的方法将获得的目标基因连接到表达载体上苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)、酪氨酸氨解酶基因(TAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)和白藜芦醇合酶(RS)的基因序列；将构建好的表达载体转化到菌株中，得到重组工程菌株；对重组菌株进行发酵。与现有技术相比，本发明的技术方案使用基因工程谷菌株，进行发酵生产白藜芦醇，不需底物添加即可合成白藜芦醇，实现了白藜芦醇的从头合成，可以解决白藜芦醇的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
文档编号C12N15/63GK102605006SQ20121003676
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者姚元锋, 王长松, 赵广荣 申请人:天津大学