一种检测透明质酸酶的荧光方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测透明质酸酶的荧光方法。该方法首先将阳离子型共轭聚合物与连接了荧光猝灭剂阿霉素的带负电荷的透明质酸通过静电吸引结合；共轭聚合物的荧光由于与阿霉素之间的电子转移被猝灭，且荧光强度随阿霉素浓度的增大而减弱；当加入透明质酸酶时，它将透明质酸链水解，使阳离子型共轭聚合物与透明质酸的结合削弱，距离增大，阿霉素被释放，荧光猝灭效应减弱，共轭聚合物的荧光逐渐恢复，且共轭聚合物荧光恢复的程度与透明质酸酶的浓度相关。该方法操作简便，响应速度快，成本较低，具有较高的选择性和灵敏度，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有重要的意义。
【专利说明】一种检测透明质酸酶的荧光方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感及分析领域，特别涉及一种利用阳离子型共轭聚合物和透明质酸探针检测透明质酸酶的荧光方法。
【背景技术】
[0002]共轭聚合物的共同特征是分子内有大的η-电子共轭体系，提供了电荷大范围迁移的条件，因为其主链的η - 共轭结构与能提供P轨道的原子(如N，S等)相连的P- π共轭结构形成了沿高分子链的离域η键，电荷可通过该离域η键沿高分子链运动。因此，共轭聚合物是一种非常高效的能量/电子传递介质，它具有“分子导线”特征，即受激发产生的激子可以沿共轭主链迅速迁移。把铵根、羧酸根、磺酸根基团或寡聚乙二醇等亲水性基团共价连接到共轭聚合物侧链上可使其具有水溶性。通过引入阳离子基团，可使整条聚合物链在水溶液中带正电荷，能与带负电荷的生物分子发生相互作用。
[0003]透明质酸是一种带负电的线性黏多糖，由(IH)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成。1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质，随后在人体内也发现了它的存在。在机体内，透明质酸显示出多种重要的生理功能:如维持组织结构完整性、形成围绕各个细胞的高度水合矩阵、促进细胞迁移和转移及调解细胞间信号等(Rafal Fudala, MarkE.MummertjZygmunt Gryczynskijet al.Journal ofPhotochemistry and Photob1logyB:B1logy, 2012, (106):69 - 73)。它和蛋白质、核酸一样，都是生命过程的基本物质，广泛存在于生物体的软结缔组织中。透明质酸分子中含有的大量羧基、羟基、酰胺基，在生理条件或适当的PH环境下，羧基可充分解离成负离子。因此，透明质酸具有突出的保水性能，还有粘弹性的双重特征，即它的水溶液既具有凝胶的弹性，也具有溶液的粘性。近年来，由于透明质酸独特的理化性质和生理功能，它已经在诸多方面得到广泛应用，例如:保护眼睛、保护和润滑关节、促进血管生成、促进伤口愈合以及肿瘤的治疗等。
[0004]透明质酸酶(Hyaluronidase, HAase)是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶,它可断开透明质酸糖链中的N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖羧酸之间的糖苷键，将其解聚和水解成低相对分子质量透明质酸或寡糖。透明质酸酶首次发现于1929年，Duran-Reynals在哺乳动物睾丸及其他组织提取物中发现一种可促进疫苗、染料、毒素等扩散的“扩散因子”，随后被鉴定为透明质酸酶(F.Duran-Reynals.Tissue permeability and the spreadingfactor in infect1n:A contribut1n to the host:parasite problem[J].Bacter1lRev, 1942,6(4):197-252)。透明质酸酶在许多不同的癌症细胞中都有过度表达，例如膀胱癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤等。几种致癌细胞行为，包括组织入侵及血管再生的增强作用等，也与透明质酸酶的活性增加有关。此外，透明质酸酶也可用于抗癌化疗剂，透明质酸酶的加入可减少肿瘤细胞的抗药性。因此，对透明质酸酶进行高效的检测在肿瘤的早期诊断和治疗等方面具有重要的理论和应用研究价值。
[0005]目前已报道的透明质酸酶的检测方法有浊度法、粘度法、酶谱法、免疫测定法以及一些其他的化学方法等(Dan Cheng, Weiye Han, Kuncheng Yang, etal.Talanta, 2014(130):408 - 414)。其中应用较多的方法浊度法，浊度法是基于大分子量的透明质酸盐于酸化血清中发生沉降现象建立起来的，但这种方法需要大量的酶，且测量结果相对不准确。酶谱法较简单但不适合敏感的定量分析。免疫测定法则需要专业和昂贵的试剂。因此找到一种既能特异性检测透明质酸酶，又操作简便、快速、成本低的检测方法，成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明要解决的技术问题是针对现有检测透明质酸酶方法的不足，提供一种利用透明质酸探针与阳离子型水溶性共轭聚合物结合的利用荧光信号来检测透明质酸酶的方法，灵敏度和特异性好，并且操作简便、快速，成本低。
[0007]技术方案:本发明为一种基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸探针检测透明质酸酶的荧光方法，运用该方法可以实现对透明质酸酶的定性和定量检测。该技术的核心是利用透明质酸酶与结合荧光猝灭剂透明质酸探针发生作用前后，阳离子型水溶性共轭聚合物的荧光猝灭和恢复的程度进行透明质酸酶的检测。当透明质酸酶浓度为零时，共轭聚合物与透明质酸探针通过静电作用结合，共轭聚合物的荧光由于与透明质酸探针上的阿霉素之间的电子转移被猝灭；当透明质酸酶浓度增大时，透明质酸酶与透明质酸发生作用，透明质酸链被水解成片段，大大削弱了共轭聚合物与透明质酸探针的静电结合作用，使两者的距离增大，因此共轭聚合物的荧光得以恢复；共轭聚合物荧光恢复的程度与透明质酸酶的浓度相关，因此根据本方法可以对透明质酸酶进行定量检测。
[0008]本发明的检测透明质酸酶的荧光方法基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸HA探针，包括以下步骤:
[0009]I)制备结合荧光猝灭剂的透明质酸探针；
[0010]2)将阳离子型水溶性共轭聚合物与所述透明质酸探针结合，进行荧光检测；
[0011]3)在透明质酸探针中加入透明质酸酶，待其与透明质酸酶作用后，在其中加入阳离子水溶性共轭聚合物，再次进行荧光检测。
[0012]突光粹灭剂包括阿霉素DOX的小分子突光粹灭剂。
[0013]所述阳离子型水溶性共轭聚合物，其荧光发射由于与阿霉素荧光猝灭剂之间的电子转移能够被粹灭。
[0014]所述阳离子型水溶性共轭聚合物与透明质酸探针是通过静电吸引作用结合。
[0015]所述透明质酸探针与透明质酸酶的作用，是透明质酸酶将透明质酸链水解为透明质酸短链的过程。
[0016]所述的荧光检测中，所使用的缓冲溶液是0.15M NaCU0.02M PBS缓冲液，pH =
5.6o
[0017]所述的荧光检测中，温度为25°C。
[0018]所述荧光检测，是加入透明质酸酶溶液在37°C下孵育30分钟后测量荧光发射光
-1'TfeP曰。
[0019]所述的荧光检测是用荧光分光光度计进行检测，激发波长在阳离子型水溶性共轭聚合物最大紫外-可见吸收峰处，发射波长扫描范围为415 — 600nm。
[0020]有益效果:本发明所述的荧光检测方法基于水溶性共轭聚合物信号倍增和实时检测的优势，以及阿霉素能够猝灭水溶性共轭聚合物的荧光和透明质酸酶能够水解透明质酸的特点，利用透明质酸酶与透明质酸探针发生作用前后，阳离子型水溶性共轭聚合物的荧光恢复的程度进行透明质酸酶的检测。该方法操作简便，响应速度快，成本较低，且具有较高的选择性和灵敏度，是一种分析效率较高的检测方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为阳离子型水溶性共轭聚合物(PFEP)、透明质酸(HA)、阿霉素(DOX)的分子结构式。
[0022]图2为利用阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸探针检测透明质酸酶的工作原理图。
[0023]图3为基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸探针的荧光检测方法对不同浓度的透明质酸酶进行检测的荧光光谱图。透明质酸酶浓度范围为O?1.85U/mL。
[0024]图4为不同浓度透明质酸酶加入待测体系前后，体系荧光强度变化的对应关系曲线图。注解:小图表示体系荧光强度与O?1.30U/mL浓度范围内的透明质酸酶的线性关系图。
[0025]图5为特异性分析图。分别为检测底液中加入透明质酸酶，凝血酶(Thrombin),溶菌酶(Lysozyme)和PBS缓冲溶液的对比结果。
【具体实施方式】
[0026]为了更好地理解本发明的内容，下面以阳离子型水溶性共轭聚合物和荧光素标记的透明质酸探针检测透明质酸酶的实验为例，说明本发明技术的【具体实施方式】。
[0027]运用该技术包括如下三个步骤:
[0028]I)制备结合阿霉素的透明质酸探针；
[0029]2)将阳离子型水溶性共轭聚合物与所述透明质酸探针结合，进行荧光检测；
[0030]3)在透明质酸探针中加入透明质酸酶，待其与透明质酸酶作用后，在体系中加入阳离子水溶性共轭聚合物，再次进行荧光检测。
[0031]其中:
[0032]步骤I反应机理为:透明质酸上的羧基与阿霉素上的氨基在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的催化作用下发生缩合反应连接在一起。透明质酸和阿霉素的分子结构式如图1所示。
[0033]步骤2中的阳离子型水溶性共轭聚合物可参照文献(Huang Y Q, Fan QL，Lu X M，Fang C，Liu S J，Li Hj Wen Yj Wang L H，Huang W.Journal ofPolymerScience: PartA: Polymer Chemistry2006，44 (19)，5778-5794)制备，其浓度以重复单兀的摩尔浓度表示。透明质酸探针的浓度也以其重复单元的摩尔浓度表示。该共轭聚合物通过静电吸引作用与透明质酸探针结合，使该共轭聚合物的荧光被阿霉素猝灭，从而使荧光信号显著减弱。共轭聚合物的荧光恢复程度用加入透明质酸酶前后的荧光强度的比值，即I。/Itl来表示。当透明质酸酶浓度为零时，共轭聚合物的荧光强度用Itl表示。
[0034]荧光检测所用的仪器为岛津RF-5301PC荧光分光光度计。荧光光谱测量条件:氣灯激发，激发波长为404nm，发射扫描范围为415_600nm。检测缓冲液为pH = 5.6的0.15MNaCU0.02M PBS缓冲液，用4mL石英比色皿进行测量，样品体积2.7mL ;阳离子型水溶性共轭聚合物浓度为1.5X 10_7mol/L，透明质酸探针的浓度为O?3.1X 10_6mol/L，检测温度25。。。
[0035]步骤3在透明质酸探针中加入透明质酸酶，在37°C下孵育30分钟后，在体系中加入阳离子水溶性共轭聚合物后进行荧光检测。由于透明质酸酶将透明质酸链水解，削弱了共轭聚合物与透明质酸探针的静电结合作用，使两者的距离增大，阿霉素对共轭聚合物的荧光猝灭作用减弱，共轭聚合物的荧光得以恢复。用^表示加入透明质酸酶后共轭聚合物的荧光强度，计算荧光强度变化的相对值Λ I:
[0036]Δ I = Ic/10
[0037]Λ I与透明质酸酶的浓度相关，根据两者的关系曲线可以对透明质酸酶进行定量检测。
[0038]荧光检测所用的仪器、荧光光谱测量条件、检测缓冲液同步骤2，用700uL石英比色皿进行测量，样品体积540uL ;阳离子型水溶性共轭聚合物浓度为1.5X10_7mol/L，透明质酸探针的浓度为1.48X 10_6mOl/L，透明质酸酶的浓度为O?1.85U/mL，检测温度25°C。
[0039]实施例1检测不同浓度的透明质酸酶
[0040]在温度为25°C，pH = 5.6的PBS缓冲液中，向含8 X 10_5mol/L透明质酸探针的底液中加入一系列不同量的透明质酸酶，在37°C下孵育30分钟，之后稀释至透明质酸探针浓度为1.48X10_6mol/L，加入1.5X10_7mol/L阳离子型水溶性共轭聚合物，扫描其荧光发射光谱，实验结果如图5所示透明质酸酶的终浓度分别为0、0.19,0.38,0.56,0.74,0.93、1.11、
1.30、1.49、1.85U/mL。从图中可见随着透明质酸酶的浓度增大，阳离子型水溶性共轭聚合物的荧光恢复程度越高。计算△ I，对透明质酸酶的浓度作图得图4。该图表明在透明质酸酶浓度为O?1.30U/mL范围内具有很好的线性范围，大于该范围，Λ I的曲线趋向平缓，表示加入透明质酸酶的浓度趋于饱和。
[0041]该方法的检测限公式:L0D = 3&/S，其中Stl表示空白样品的标准偏差，S表示在该方法线性范围内的灵敏度(Eggins B R, Chemical Sensors and B1sensors, Johnffiley&Sons Ltd, West Sussex, England, 2002)。本实验空白样的标准偏差为0.04,结合线性曲线的灵敏度计算得到检测限为0.075U/mL。
[0042]实施例2特异性分析
[0043]检测1:将浓度为0.38U/mL的透明质酸酶加入检测底液中，其它实验条件同实施例I。
[0044]同时，做如下试验作为对比。
[0045]检测2:用等体积浓度为透明质酸酶5倍的溶菌酶(Lysozyme)和凝血酶(Thrombin)进行试验,作为阴性对照,其它实验条件同实施例1。
[0046]检测3:用等体积的空白缓冲溶液代替透明质酸酶进行试验，作为空白对照，其它实验条件同实施例1。
[0047]结果如图5所示。加入透明质酸酶的检测体系的共轭聚合物的荧光恢复程度显著高于其他3种对照体系，表明该方法对透明质酸酶的检测具有较高的特异性。
【权利要求】
1.一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于该方法基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸HA探针，包括以下步骤: 1)制备结合荧光猝灭剂的透明质酸探针； 2)将阳离子型水溶性共轭聚合物与所述透明质酸探针结合，进行荧光检测； 3)在透明质酸探针中加入透明质酸酶，待其与透明质酸酶作用后，在其中加入阳离子水溶性共轭聚合物，再次进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于荧光猝灭剂包括阿霉素DOX的小分子荧光猝灭剂。
3.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述阳离子型水溶性共轭聚合物，其荧光发射由于与阿霉素荧光猝灭剂之间的电子转移能够被猝灭。
4.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述阳离子型水溶性共轭聚合物与透明质酸探针是通过静电吸引作用结合。
5.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述透明质酸探针与透明质酸酶的作用，是透明质酸酶将透明质酸链水解为透明质酸短链的过程。
6.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述的荧光检测中，所使用的缓冲溶液是0.15M NaCU0.02M PBS缓冲液，pH = 5.6。
7.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述的荧光检测中，温度为25°C。
8.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述荧光检测，是加入透明质酸酶溶液在37°C下孵育30分钟后测量荧光发射光谱。
9.根据权利要求1所述的一种检测透明质酸酶的荧光方法，其特征在于所述的荧光检测是用荧光分光光度计进行检测，激发波长在阳离子型水溶性共轭聚合物最大紫外-可见吸收峰处，发射波长扫描范围为415 — 600nm。
【文档编号】G01N21/64GK104390947SQ201410669140
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】黄艳琴, 宋彩霞, 刘兴奋, 范曲立, 黄维 申请人:南京邮电大学