专利名称：用于鉴定acc脱氨酶结构基因的引物及方法
技术领域：
本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及针对微生物1-氨基环丙烷-1羧酸 (ACC)脱氨酶结构基因设计的通用特异性简并引物和用聚合酶链式反应(PCR)从根瘤菌等细菌中扩增ACC脱氨酶结构基因(acdS)的方法。
背景技术：
植物遭受旱涝、盐碱、高低温、重金属等逆境胁迫和病原微生物侵染会应激产生大量植物激素乙烯。高水平的乙烯会抑制植物根伸长、促植物器官衰老和脱落、加重病症。ACC 是植物合成乙烯的直接前体。有些定殖在植物体内外的细菌能吸收植物细胞分泌出来的 ACC,并用ACC脱氨酶催化ACC脱氨基反应，生成α -酮丁酸和NH3作为细菌生长所需的碳氮源。与此同时，植物细胞内的ACC浓度下降，相应地ACC氧化成乙烯的量降低，从而消减在逆境下乙烯对植物生长的抑制，延缓植物器官的衰老或病害的发展。由于植物不能靠运动选择适宜生长的地方而免不了生长在逆境中，与植物紧密联合的有ACC脱氨酶的细菌往往会比有固氮、溶磷或分泌铁载体等特性的细菌更易产生促植物生长的效应；ACC脱氨酶也就被认为是细菌促植物生长的一种重要特性(Glick et al. Critical Reviews of Plant Sciences 2007,26 :227-242)。随着全球气候变暖，自然灾害频发，环境污染日益严重，利用微生物帮助植物抗逆和修复污染的土壤和水体受到人们的重视，大量的有ACC脱氨酶的细菌被分离和筛选出来，显示出促植物生长、抗逆和清除污染物的效益。根瘤菌与豆科植物共生体系的固氮能力是自然界多种生物固氮体系中最强的，固氮量占地球生物固氮量的65%以上。根瘤菌若能高效结瘤和固氮，一方面侵染力要强，能够躲避或压制植物把根瘤菌作为外来入侵物而产生的防卫反应，另一方面要适应植物的生存环境，能耐受干旱、高盐、偏酸碱或高低温等逆境或称非生物胁迫。筛选能耐受非生物胁迫的根瘤菌只需操作自由培养状态的根瘤菌，相对便捷。筛选侵染力强的根瘤菌，通常要逐一接种相应的豆科植物，培养一段时间后，检测根部的结瘤数和接种根瘤菌的占瘤率；若要从数量较多的根瘤菌菌株中筛选出侵染力强的菌株往往需要较大的培养空间，耗时耗力。早在20世纪70年代就有研究发现乙烯抑制根瘤菌结瘤和固氮，90年代的研究发现根瘤菌侵染引发豆科植物产生ACC和乙烯，近十年的研究发现有些根瘤菌有ACC脱氨酶，它们的ACC脱氨酶结构基因(accK)在根瘤中的表达量很高，如果把根瘤菌的acdS敲除，根瘤菌的结瘤能力会显著降低(Uchiumi et al. Journal of Bacteriology 2004,186 2439-2448)；相反，如果向原本没有ACC脱氨酶的根瘤菌导入acdS，那根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株(Ma et al. Applied and Environmental Microbiology 2004,70 :5891-5897)。有一研究检测了 10个商业化生产应用的根瘤菌菌株发现有一半(5个)的菌株有acdS和ACC脱氨酶活性(Ma et al. Antonie van Leeuwenhoek 2003,83 :285-291)。这些研究都表明有ACC脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力，能高效结瘤；筛选有ACC脱氨酶的根瘤菌能更可预测地实现与豆科植物高效结瘤固氮。ACC脱氨酶在多个纲目的细菌和真菌中存在。检测细菌是否有ACC脱氨酶通常用含有ACC的培养基来培养细菌并诱导细菌的ACC脱氨酶活性，再用比色法检测ACC脱氨酶催化ACC脱氨的产物-α -酮丁酸。但有研究发现有些根瘤菌有acdS，但在自生状态下没有 ACC 脱氨酶活性(Ma et al. Antonie van Leeuwenhoek 2003，83 :285-291)，只在与豆科植物共生的根瘤中表达 acdS(Uchiumi et al. Journal of Bacteriology 2004， 186 :2439-2448 ；Nukui et al. Applied and Environmental Microbiology 2006,72 4964-4969)。这样，要鉴定细菌是否有ACC脱氨酶，从分子水平检测细菌是否有acdS是比检测细菌是否有ACC脱氨酶活性更稳妥的方法。检测细菌是否有acdS可以用DNA杂交法或PCR扩增法。PCR扩增比DNA杂交在实验操作上要简便得多，快得多，费用也低，所以更适合用来从大量菌株中筛选有acdS的细菌。PCR技术作为分子生物学最常用的技术，经广泛持续的研发，效率越来越高，操作越来越简便，费用越来越低。如有些商业化的2XPCR预混液中加入了增强剂和优化剂，显著提高了 PCR反应的特异性和灵敏度，还能有效扩增GC含量高、有二级结构等复杂模板，降低了对PCR条件的要求；反应前只需向2XPCR预混液加入引物、模板和用纯水补足反应体积，降低了取样误差，提高了检测重复性。已有一些研究设计了用PCR法扩增细菌acdS完整或部分序列的简并引物，但还没有特异性和广谱性兼备的引物。有针对Miizobium属根瘤菌的acdS设计的引物，但对 Rhizobium属不同种的根瘤菌要用不同的引物对(Duan et al. Microbial Ecology 2009， 57 :423-436),广谱适用性差。有的引物是针对β-和Y _变形杆菌纲细菌的acdS设计的(Blaha et al. FEMS Microbiology Ecology 2006,56 :455-470 ；Shah et al. Canadian Journal of Microbiology 1998,44 :833-843)，对有些属于α -变形杆菌纲的根瘤菌不适用，而且对有些有ACC脱氨酶活性的β-和Y-变形杆菌纲细菌，也不能从中扩增出 acdS (Shah et al. Canadian Journal of Microbiology 1998,44:833-843)。有的广谱引物简并度太高，特异性差，能扩增到非ACC脱氨酶的ACC脱氨酶同源蛋白的基因，如D-半胱氨酸脱巯基酶的基因(Hontzeas et al. Applied and EnvironmentalMicrobiology 2005, 71 :7556-7558)。已有研究表明ACC脱氨酶与其它同源蛋白的氨基酸序列保守区和酶活性关键位点在第51 (Lys，简写K)，78 (Ser，S), 268 (Tyr, Y)和294(Tyr, Y)位上的氨基酸残基是相同的，但在第295位和322位上的氨基酸残基是不同的，而且这两个氨基酸残基决定了酶的催化特性。ACC脱氨酶在第295位和322位上的氨基酸残基是Glu (E)和Leu (L)，而其它同源蛋白往往是Thr(T)或义！·^。因此，根据第295位和322位上氨基酸残基的差异有可能设计出扩增acdS的特异引物。共有-简并杂合寡核苷酸弓丨物(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primer，C0DEH0P)法是设计广谱简并引物的有效方法(Rose et al. Nucleic Acids Research 1998,26 :1628-1635)。C0DEH0P法设计简并引物的原理是选择靶蛋白保守区内连续3-4个保守氨基酸序列设计简并核苷酸序列(9-12个碱基)得到3’简并核心区；在5’ 端根据引物退火温度的设置选择部分保守或优势氨基酸残基，结合密码子偏好性设计出5’ 端非简并共有序列夹。通过在较短的3’简并核心区序列用较少的简并碱基来控制适度的引物简并度，控制适度的有效引物的浓度；通过加长5’端非简并共有序列夹来控制引物退火温度，保障扩增特异性。这样，在首轮扩增时，通过杂合引物在3’简并核心区与模板正确匹配而实现正确延伸；在随后的扩增循环中，通过杂合引物与首轮扩增产物在5’共有序列夹区正确匹配而实现正确扩增。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，设计出针对ACC脱氨酶结构基因(acdS)的广谱且特异的简并引物，用于从根瘤菌等细菌中用PCR法扩增出acdS，在分子水平鉴定具有ACC脱氨酶的细菌，从大量根瘤菌中快速筛选出具ACC脱氨酶的能高效结瘤的根瘤菌。本发明的解决方案是，基于尽可能多种类的、已确证有ACC脱氨酶活性的微生物包括α -、β -和Y -变形杆菌纲的细菌和真菌的acdS的保守区和C0DEH0P法设计出用于扩增acdS的广谱简并引物，通过序列比对选出能区分acdS序列和与ACC脱氨酶高度相似的D-半胱氨酸脱巯基酶的基因序列的特异简并引物，用预测有效的广谱特异引物从已知有ACC脱氨酶活性的细菌中扩增acdS，用检验有效的广谱特异引物从根瘤菌中扩增acdS， 筛选出有ACC脱氨酶的、有较高几率能与寄主豆科植物高效结瘤固氮的根瘤菌。本发明中，设计出的扩增acdS片段的广谱特异的新引物有3条正向引物 acdSf3、反向引物 acdSr3 和 acdSr4。acdSf3的核甘酸序列是5，ATCGGCGGCATCCAGffSNAAYCANAC 3，，对应的氨基酸序列是IGGIQ(S)NQT，包括了第78位的保守氨基酸残基Ser(S)，下划线区是3’简并核心区，简并度是128，在acdS序列中对应部分的GC含量平均约60% ；序列比对分析显示3’简并核心区能很好匹配各类受试微生物的acdS中相应的保守序列，而且3’简并核心区的3’端不与D-半胱氨酸脱巯基酶基因相应序列匹配(图1)，即能区分acdS和D-半胱氨酸脱巯基酶基因相应序列，对acdS的扩增特异性强。acdSr3 的核苷酸序列是 5，GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT 3，，对应的氨基酸序列是DPVY(E)GKSMH，包括了第295位的保守氨基酸残基Glu(E)，下划线区是3’简并核心区，简并度是64，在acdS序列中对应部分的GC含量平均约；序列比对分析显示3’简并核心区能很好匹配受试acdS中相应序列，但3’简并核心区的3’端也与多数受试D-半胱氨酸脱巯基酶基因相应序列匹配(图幻，对acdS的扩增特异性弱。acdSr4的核苷酸序列是5，GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA 3’，对应的氨基酸序列是 YAH(L) GGQP,包括了第322位的保守氨基酸残基Leu (L)，下划线区是3’简并核心区，简并度是64，在acdS序列中对应部分的GC含量平均约72% ；序列比对分析显示3’简并核心区能很好匹配受试acdS中相应序列，与D-半胱氨酸脱巯基酶基因相应序列匹配度差(图3)，能较好区分acdS和D-半胱氨酸脱巯基酶基因相应序列，对acdS的扩增特异性较强。因预测到acdSr4比acdSr3对acdS相应序列的特异性要强，所以预测用acdSf3/ acdSr4引物对扩增acdS片段的特异性比用acdSf3/acdSr3引物对强，而acdSf3/acdSr3 引物对的扩增特异性主要决定于acdSf3的特异性。在实际应用时，特异性扩增acdS首选acdSf3/acdSr4引物对。但因acdSr4在acdS序列中对应部分的GC含量较高(平均约 72% )，用acdSf3/acdSr4引物对扩增acdS的反应条件要求也要高于用acdSf3/acdSr3引物对的条件，所以实际应用时，对同一菌株分别用acdSf3/acdSr4和acdSf3/acdSr3引物对扩增，以分别确保检测的特异性和成功率。本发明中，利用权利要求1所述的引物鉴定和筛选微生物是否具有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶的方法，其特征在于，是将acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一个引物对用于PCR反应，从微生物或其核酸样品中扩增ACC脱氨酶结构基因的部分序列； 用acdSf3/acdSr4引物对扩增出的acdS片段大小760bp，用acdSf3/acdSr3引物对扩增出的acdS片段大小680bp ；如能用acdSf3/acdSr4引物对扩增得到长度760bp的DNA片段，或者用两对引物分别扩增得到长度760bp和680bp的DNA片段，即认为微生物有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶；如只能用acdSf3/acdSr3引物对扩增得到长度680bp的DNA片段， 还需要以acdSf3或/和acdSrf为测序引物进行PCR产物直接测序获得所得DNA片段的碱基序列，如果测得的序列与基因数据库GenBank中序列相似度最高的是ACC脱氨酶结构基因的序列，则认为微生物有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶。对于有不只一个接近预期大小片段的扩增产物，可以通过切胶回收分别纯化不同大小的片段，再以相应引物为测序引物分别进行PCR产物直接测序，如果其中有一个DNA片段的序列与基因数据库GenBank 中序列相似度最高的是ACC脱氨酶结构基因的序列，则认为微生物有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶。本发明中，针对acdS的广谱特异简并引物的应用所依托的是PCR技术。在实际操作中，一方面使用了添加了增强剂和优化剂的2XPCR预混液商品，提高了扩增acdSr4引物对应的GC含量高模板的效率，也降低了取样误差，提高了检测重复性。另一方面，利用根瘤菌等革兰氏阴性细菌的细胞壁易破解的特性，将根瘤菌及其它革兰氏阴性细菌的单菌落用10 μ 1无菌水悬浮后取1 μ 1直接加入PCR反应体系，利用PCR预变性反应阶段的高温裂解细菌细胞，以释放出的细菌DNA为模板进行扩增，免去提取细菌基因组DNA的步骤，简便、省时、省钱，适用于从多个细菌中快速筛选有ACC脱氨酶的菌株。本发明提供的acdSf3/ acdSrf和aCdSf3/acdSr4两对引物经预测也适用于从放线菌(革兰氏阳性)和真菌基因组中扩增acdS(图1，2，3)，但本发明针对根瘤菌等革兰氏阴性细菌所用的制备PCR模板的方法不适用于放线菌和真菌。本发明的有益效果在于提供了两对广谱且特异的用于PCR法扩增微生物acdS片段的新引物acdSf3/ acdSr3和aCdSf3/aCdSr4，预测适用于α-、β-和γ -变形杆菌纲的细菌、放线菌和真菌。 实践已证实基于这两对引物的PCR能从有ACC脱氨酶活性的属于β -变形杆菌纲的伯克霍尔德菌、草螺菌和属于Y -变形杆菌纲的假单胞菌中扩增到acdS的片段，能从大量属于 α -变形杆菌纲的根瘤菌中快速筛选出有acdS的菌株，比已有的其它研究设计的引物在广谱性和特异性上都要强，扩增效率也更高。本发明不仅能用来鉴定有ACC脱氨酶活性的细菌有acdS，也能用于筛选有ACC脱氨酶的细菌；而且，因有研究证实有ACC脱氨酶的根瘤菌能高效结瘤，所以本发明能快速从大量根瘤菌中筛选出能高效结瘤的菌株。
图1为核苷酸序列联配比对图，显示引物acdSf3序列与各类微生物ACC脱氨酶结构基因(acdSf3上部)和D-半胱氨酸脱巯基酶基因(acdSf3下部)相应序列间的匹配性。 涂黑碱基表示与引物碱基不匹配。图2为核苷酸序列联配比对图，显示引物acdSrf序列与各类微生物ACC脱氨酶结构基因(acdSr3上部)和D-半胱氨酸脱巯基酶基因(acdSr3下部)相应序列间的匹配性。涂黑碱基表示与引物碱基不匹配。图3为核苷酸序列联配比对图，显示引物acdSrf序列与各类微生物ACC脱氨酶结构基因(acdSr4上部)和D-半胱氨酸脱巯基酶基因(acdSr4下部)相应序列间的匹配性。 涂黑碱基表示与引物碱基不匹配。
具体实施例方式引物设计从GenBank数据库中选取了 17个已证实有ACC脱氨酶活性的微生物的ACC脱氨酶的氨基酸序列。这17个微生物包括6个α-变形杆菌纲的细菌[Agrobacterium tumefaciens D3 (氨基酸序列在 GenBank 的登录号 AAI^8496)、Azospirillum lipoferum4B(ABE66282) > Mesorhizobium Ioti MAFF303099(BAB52295)> Phyllobacterium brassicacearum STM196(AB031418)、 Rhizobium leguminosarum 128C53K(AAL16088)和 Sinorhizobium meliloti SMll (ABA56046) ]，4 个 β-变形杆菌纲的细菌[Burkholderi caledonica LMG 19076(ACH81521), B.caryophylli LMG 2155 (ACH81522)、Ralstonia solanacearum GMI 1000(CAD17797)禾口 Variovorax paradoxus5C2 (AAT35829)]，2 个 Y —变形杆菌纲的细菌[Pseudomonas ffluorescens 17(AAC44163)禾口 P. putida UW4(AAV73804)]，2 个归属还未确定的细菌[Enterobacter cloacae CAL2 (AAD05070) 禾口 Pseudomonas sp.ACP(AAA25689) ], 3 个真菌[Hansenula saturnus(Q7M523)、 Penicillium citrinum(BAA92150)和 Tricboderma asperellum(ACX94231)]。将这些氨基酸序列用MUSCLE程序列队联配后提交到多序列联配模块处理器(Blocks Multiple AlignmentProcessor ；http://bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/ process_blocks.html)来鉴定这些ACC脱氨酶序列的保守区并产生保守区块，用C0DEH0P 程序(http//bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/codehop. html)在默认参数下对各保守区块设计出引物序列，将各程序生成引物与上述氨基酸序列对应的核苷酸序列比对进行手动校正产生待测引物。将待测引物与受试acdS和D-半胱氨酸脱巯基酶基因的相应保守区块的核苷酸序列联配比对，预测在3’简并核心区能有效区分双方序列的引物有正向引物 adSf3和反向引物acdSr4，而反向引物acdSr3的区分能力较弱(图1，2，3)。引物制备用全自动DNA合成仪合成，用ULTRAPAGE方法纯化得到白色结晶，用Tris-EDTA缓冲液(pH 8.0)或超纯水稀释到100 μ M，分装到0. 5ml离心管内，在_20°C保存。PCR扩增模板制备取细菌在丰富培养基上生长的单菌落，用10 μ 1无菌纯水悬浮菌体，取1 μ 1菌悬液作为PCR反应的模板。PCR 扩增按天根生化科技(北京)有限公司生产的2XTaq PCR MasterMix(含染料，目录号 KT201)产品说明书配制PCR反应液。分别用引物对acdSf3/acdSr4或acdSf3/acdSr3扩增。 每个引物的浓度为0. 4 μ M，加1 μ 1菌悬液作模板，反应液的总体积为25 μ 1或50 μ 1 (用于测序)。以不加菌悬液的反应液为阴性对照。用Bio-Rad SlOOO型PCR仪或东胜龙黑金刚 PCR仪进行扩增反应。反应程序为预变性94°C 4min,变性-退火-延伸循环为94°C 45s,530C 45s, 72°C lmin,循环；35次，终延伸72°C IOmin0反应结束后吸取1_5 μ 1反应液及5 μ 1 250bp DNA ladder marker [宝生物工程(大连)有限公司生产，目录号D515]，经1 %琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，用凝胶成像分析系统检测扩增结果。扩增阳性结果得到长度 760bp (用 acdSf3/acdSr4 引物对)或 680bp (用 acdSf3/acdSr3 引物对)的 DNA 片段。实施例1从有ACC脱氨酶活性的归属于β -变形杆菌纲的伯克霍尔德菌和草螺菌和归属于Y -变形杆菌纲的假单胞菌的菌株中扩增acdS片段受试菌株是已检测到有ACC脱氨酶活性的44个细菌菌株。其中有1个从甘蔗根际土壤中分离的、5个从玉米茎内分离的和12个从水稻根分离的归属于变形杆菌纲的伯克霍尔德属的菌株，10个从水稻根分离的归属于变形杆菌纲的草螺菌属的菌株和 16个从水稻根分离的归属于Y-变形杆菌纲的假单胞菌属的菌株(li et al. Letters in Applied Microbiology 2011，53 :178-185)。这些菌株分别在LB培养基(每升含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg氯化钠，15g琼脂粉，pH7.0)上，在培养。用20 μ 1移液器吸头挑取直径约Imm的单菌落移入10 μ 1无菌纯水中悬浮菌体，取1 μ 1菌悬液作为PCR反应的模板。经PCR扩增后都分别得到了 760bp和680bp的DNA片段，并且以acdSf3和acdSr3 为测序引物对其中680bp的扩增产物直接测序，获得的序列与GenBank数据库中的序列比较发现都与acdS最相似，证实扩增所得是acdS的片段。这些序列在GenBank中的登录号为 HQ728585 到 HQ7^626，HQ728641, HQ728642 和 HQ84077。其中草螺菌属菌株的 acdS 序列与数据库中草螺菌菌株SmRl的acdS序列的相似度有93. 5% -100%，而与其它属细菌 acdS序列的相似度都低于80% ；其中假单胞菌属菌株的acdS序列与数据库中其他微生物 WacdS序列相似度较低，与最相似的草螺菌SmRl的acdS序列的相似度也仅75% -76%。 由于这些草螺菌(包括数据库中草螺菌菌株SmRl的acdS序列)和假单胞菌的acdS序列与数据库中其它细菌的acdS序列差异比较大，用以前研究设计的简并引物没能从中扩增出acdS序列，所以，本发明设计的新引物对acdSf3/acdSr3和acdSf3/acdSr4比以前研究设计的简并引物的广谱性和扩增效率高。实施例2从大量根瘤菌菌株中扩增acdS片段，筛选出可能高效结瘤的根瘤菌受试根瘤菌是从刺槐根瘤内分离到的200个根瘤菌分离物。这些根瘤菌分别在TY 培养基(每升含5g胰蛋白胨，3g酵母提取物，0. 44g 二水氯化钙，15g琼脂粉，pH6. 8-7. 0) 上，在培养。用20 μ 1移液器吸头挑取直径约Imm的单菌落移入10 μ 1无菌纯水中悬浮菌体，取1 μ 1菌悬液作为PCR反应的模板。经PCR扩增且以acdSf3和acdSr3为测序引物对680bp的扩增产物直接测序，获得23个不同序列，都与GenBank数据库中根瘤菌的acdS 序列最相似，证实扩增所得的是acdS的片段；其中20个菌株的acdS序列与Mesorhizobium 属根瘤菌的acdS序列最相似，可能归属于Mesorhizobium属；有3个菌株的acdS序列与 Sinorhizobium属根瘤菌的acdS序列最相似，可能归属于Sinorhizobium属。这些结果与此前研究发现Mesorhizobium属根瘤菌在刺槐根瘤中占优势是相符的(Wei et al. FEMS Microbiology Ecology 200968 :320-328 ；Shiraishi et al.Soil Science and Plant Nutrition 2011,57 :765-774)。从200个根瘤菌分离物中快速筛选出的这23个具ACC脱氨酶的菌株很可能是侵染力强、能高效结瘤的菌株；接下来可以通过在不同胁迫条件下培养根瘤菌菌株和接种刺槐苗的实验从这23个菌株中筛选出对逆境适应性强、高效结瘤固氮且促刺槐苗生长的高效根瘤菌，在刺槐造林育苗生产上发挥作用。
权利要求
1.用于鉴定ACC脱氨酶结构基因的引物，其特征在于，包括正向引物acdSf3、反向引物 acdSr3和acdSr4，其核苷酸序列分别是acdSf3 :5’ -ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3‘；acdSr3 :5’ -GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’ ；acdSr4 :5’ -GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA-3，。
2.一种利用权利要求1所述的引物鉴定和筛选微生物是否具有ACC脱氨酶结构基因和 ACC脱氨酶的方法，其特征在于，是将acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一个引物对用于聚合酶链式反应，从微生物或其核酸样品中扩增ACC脱氨酶结构基因的部分序列；如能用aCdSf3/acdSr4引物对扩增得到长度760bp的DNA片段，或者用两对引物分别扩增得到长度760bp和680bp的DNA片段，即认为微生物有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶；如只能用acdSf3/acdSr3引物对扩增得到长度680bp的DNA片段，还需要以acdSf3 或/和acdSrf为测序引物测定所得DNA片段的碱基序列，如果测得的序列与基因数据库 GenBank中序列相似度最高的是ACC脱氨酶结构基因的序列，则认为微生物有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物是细菌。
全文摘要
本发明涉及微生物技术，旨在提供用于鉴定ACC脱氨酶结构基因的引物及方法。该引物包括正向引物acdSf3、反向引物acdSr3和acdSr4。鉴定和筛选微生物是否具有ACC脱氨酶结构基因和ACC脱氨酶的方法，是将acdSf3/acdSr3或acdSf3/acdSr4中的至少一个引物对用于聚合酶链式反应，从微生物或其核酸样品中扩增ACC脱氨酶结构基因的部分序列，并根据扩增结果进行判断。本发明能从大量属于α-变形杆菌纲的根瘤菌中快速筛选出有acdS的菌株，比已有的其它研究设计的引物在广谱性和特异性上都要强，扩增效率也更高。也能用于筛选有ACC脱氨酶的细菌，能快速从大量根瘤菌中筛选出能高效结瘤的菌株。
文档编号C12N15/11GK102534034SQ20121003864
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者安千里, 常四平, 张继泰, 李万里, 李江川, 李郑义 申请人:武汉凯迪工程技术研究总院有限公司, 浙江大学