一种超氧化物歧化酶的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种来源于动物凝血块的超氧化物歧化酶的制备方法，包括：(1)、将动物凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，过滤；(2)、离心，水溶，速冷、静置、纯化、稀释、过滤；(3)、在冰箱中析出的沉淀，真空冷冻干燥，制得超氧化物歧化酶。本发明具有制备工艺简单，无复杂生产设备，成本低，环境友好，产率高，可适合进行工业化生产等特点，所得超氧化物歧化酶pH具有很好的稳定性，良好的热稳定性以及蛋白酶水解能力。
【专利说明】一种超氧化物歧化酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种来源于动物凝血块的超氧化物歧化酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD)是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。
[0003]SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
[0004]SOD是机体活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，对防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用。作为生物体细胞中最主要的抗氧化酶，SOD是通过催化下类反应:0厂+O2- +2H++S0D — H202+02+S0D起作用的，即:将生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离子自由基通过歧化反应而生成过氧化氢和氧气，过氧化氢随后被体内的抗坏血酸和过氧化氢酶(CAT)分解为H2O和O2，从而解除02_，所造空城的氧化胁迫。这在维持生物体内超氧阴离子自由基的产生与消除的动态平衡中起着重要作用。
[0005]至今为止，人们已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳动物等各种生物体内分离得到了多种S0D、按照结合的金属离子的种类不同，可分为三种类型，即Mn-SOD、Fe-SOD和Cu-Zn-SOD。第一种类型含Mn，呈粉红色，目前已从真核细胞的线粒体及元和细胞浆分离得到；第二种类型含Fe，呈黄色，只存在于原核细胞内；第三种类型含Cu和Zn，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。
[0006]由于原材料有限，纯化困难等原因，导致SOD的纯度地、产品少。在现有技术中，对在动物血中进行超氧化物歧化酶的提取通常采用分离然然后用乙醇和氯仿进行提取，取得粗酶液。由于动物血耐热性差，因而取得的粗酶液常常含有较多的杂蛋白。
[0007]针对以上不足，本发明提供一种在动物学血中提取高纯度的超氧化物歧化酶的制备方法。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是通过对动物凝血块进行过滤、三次离心、纯化、沉淀，得到一种超氧化物歧化酶的方法。
[0009]本发明技术方案如下:
[0010]步骤1:按每10g动物凝血块对应20?30g蛋白质沉淀剂，将动物凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，使动物凝血块与蛋白质沉淀剂充分接触，过滤掉沉淀物，收集滤液；
[0011]步骤2:将滤液离心，分离血红蛋白沉淀，取上清液加入2?8mL 0.9mol/L NaCl分3次冲洗，避免残留，得到溶血；
[0012]步骤3:将步骤2所得溶血离心，在其中加入2mol/L NaClUmol/L ZnCljP去离子水，NaCl、ZnCl2、去离子水和步骤2所得溶血的体积比为1:1:2:5，在40?50°C下水溶20?40分钟，取出速冷至常温；
[0013]步骤4:将步骤3所得溶血离心，加入丙酮，使酶蛋白沉淀，丙酮与溶血的体积比为1: 2，在冰箱中静置2?4小时，得到粗酶沉淀；
[0014]步骤5:在步骤4所得粗酶沉淀中加入质量比为10%?20%的去离子水，充分搅匀，装入透析袋，加到已用pH值为7.8的0.5mmol/L磷酸钠缓冲液平衡好的CM-S^hadexC色谱柱上吸附，透析6?10小时后，用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集；
[0015]步骤6:将步骤5所得粗酶用2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，粗酶与磷酸钠缓冲液的体积比为5:1，进行两次稀释、两次过滤；
[0016]步骤7:在步骤6所得滤液中加入lmol/L的CuCl2,滤液与CuCl^体积比10:1，置于冰箱中I?2天，析出的沉淀，即为湿超氧化物歧化酶；
[0017]步骤8:真空冷冻干燥即得超氧化物歧化酶产物。
[0018]进一步，所述的动物凝血块是猪、牛或羊的凝血块。
[0019]进一步，步骤I中的过滤采用两层纱布进行过滤。
[0020]进一步，步骤2中离心的条件为，O?4°C，5000转/分，离心时间为10?20分钟。
[0021]进一步，步骤3中离心的条件为，O?4°C，5000转/分，离心时间为30?40分钟。
[0022]进一步，步骤4中离心的条件为，O?4°C，3000转/分，离心时间为50?60分钟。
[0023]进一步，步骤6中的两次过滤，第一次采用纱布过滤，第二次采用滤纸过滤。
[0024]与现有的超氧化物歧化酶的制备方法相比，本发明方法主要具有以下几个方面的优点:
[0025]1、本发明方法可以用凝血块作为制备超氧化物歧化酶的原料；现有的制备工艺多以动物血液为制备原料，本发明的方法可以将所取回的动物凝血块直接使用，这样对原料的要求就大大降低，从而更有利于产业化生产。
[0026]2、加入的丙酮，可以使粗酶得以沉淀，即利用冷的有机溶剂与蛋白质短时间接触导致蛋白质沉淀(而不变性)的性质来沉淀蛋白质。
[0027]3、磷酸钠缓冲液有调节pH值的作用，可以确保超氧化物歧化酶的稳定性增强。
[0028]4、CuCl2在超氧化物歧化酶的制备中起到催化反应的作用，提高了超氧化物歧化酶的产率。
【具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
[0030]实施例1
[0031]取10g猪凝血块对应，20g蛋白质沉淀剂，将猪凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，使猪凝血块与蛋白质沉淀剂充分接触，用两层纱布进行过滤、收集滤液；在o°c，5000转/分条件下，将滤液离心20分钟，取上清液加入的4mL 0.9mol/L NaCl，分3次冲洗，得到溶血；在0°C，5000转/分条件下，将溶血离心40分钟后，在其中加入2mol/L NaCl、lmol/L ZnCl2和去离子水，NaCl, ZnCl 2、去离子水和步骤2所得溶血的体积比为1: 1:2: 5，在40°C下，水溶40分钟，取出速冷至常温；在0°C，3000转/分条件下，离心60分钟，加入丙酮，丙酮与溶血的体积比为1:2，在冰箱中静置4小时，得到粗酶沉淀；在粗酶沉淀中加入质量比为10%的去离子水，充分搅匀，装入透析袋，加到已用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液平衡好的CM-S印hadexC色谱柱上吸附，透析10小时后，用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集；将部分收集器中的粗酶用2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，粗酶与磷酸钠缓冲液的体积比为5:1，用纱布过滤；再用体积比为20%的2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，用滤纸过滤；在所得滤液中加入lmol/L的CuCl2，滤液与&1(:12的体积比10:1，置于冰箱中2天，析出的沉淀，即为湿超氧化物歧化酶；真空冷冻干燥得超氧化物歧化酶成品。
[0032]实施例2
[0033]取10g牛凝血块对应，30g蛋白质沉淀剂，将牛凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，使牛凝血块与蛋白质沉淀剂充分接触，用两层纱布进行过滤、收集滤液；在4°C，5000转/分条件下，将滤液离心10分钟，取上清液加入的8mL 0.9mol/L NaCl，分3次冲洗，得到溶血；在40C，5000转/分条件下，将溶血离心30分钟后，在其中加入2mol/L NaCl、lmol/L ZnCl2和去离子水，NaCl, ZnCl 2、去离子水和步骤2所得溶血的体积比为1: 1:2: 5，在50°C下，水溶20分钟，取出速冷至常温；在4°C，3000转/分条件下，离心50分钟，加入丙酮，丙酮与溶血的体积比为1:2，在冰箱中静置2小时，得到粗酶沉淀；在粗酶沉淀中加入质量比为20%的去离子水，充分搅匀，装入透析袋，加到已用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液平衡好的CM-S印hadexC色谱柱上吸附，透析6小时后，用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集；将部分收集器中的粗酶用2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，粗酶与磷酸钠缓冲液的体积比为5:1，用纱布过滤；再用体积比为20%的2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，用滤纸过滤；在所得滤液中加入lmol/L的CuCl2，滤液与&1(:12的体积比10:1，置于冰箱中I天，析出的沉淀，即为湿超氧化物歧化酶；真空冷冻干燥得超氧化物歧化酶成品。
[0034]实施例3
[0035]取10g羊凝血块对应，25g蛋白质沉淀剂，将羊凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，使羊凝血块与蛋白质沉淀剂充分接触，用两层纱布进行过滤、收集滤液；在2°C，5000转/分条件下，将滤液离心15分钟，取上清液加入的6mL 0.9mol/L NaCl，分3次冲洗，得到溶血；在2°C，5000转/分条件下，将溶血离心35分钟后，在其中加入2mol/L NaCl、lmol/L ZnCl2和去离子水，NaCl, ZnCl 2、去离子水和步骤2所得溶血的体积比为1: 1:2: 5，在45°C下，水溶30分钟，取出速冷至常温；在2°C, 3000转/分条件下，离心55分钟，加入丙酮，丙酮与溶血的体积比为1:2，在冰箱中静置3小时，得到粗酶沉淀；在粗酶沉淀中加入质量比为15%的去离子水，充分搅匀，装入透析袋，加到已用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液平衡好的CM-S印hadexC色谱柱上吸附，透析8小时后，用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集；将部分收集器中的粗酶用2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，粗酶与磷酸钠缓冲液的体积比为5:1，用纱布过滤；再用体积比为20%的2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，用滤纸过滤；在所得滤液中加入lmol/L的CuCl2，滤液与&1(:12的体积比10:1，置于冰箱中2天，析出的沉淀，即为湿超氧化物歧化酶；真空冷冻干燥得超氧化物歧化酶成品。
[0036]本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤: 步骤1:按每10g动物凝血块对应20?30g蛋白质沉淀剂，将动物凝血块一边搅拌一边加入蛋白质沉淀剂，过滤、收集滤液； 步骤2:将滤液离心10?20分钟，取上清液加入的2?8mL 0.9mol/L NaCl分3次冲洗，得到溶血； 步骤3:将步骤2所得溶血离心30?40分钟，在其中加入2mol/L NaClUmol/L ZnCl2和去离子水，NaCl、ZnCl2、去离子水和步骤2所得溶血的体积比为1: 1:2: 5，在40?50°C下，水溶20?40分钟，取出速冷至常温； 步骤4:将步骤3所得溶血离心50?60分钟，加入丙酮，丙酮与溶血的体积比为1: 2，在冰箱中静置2?4小时，得到粗酶沉淀； 步骤5:在步骤4所得粗酶沉淀中加入质量比为10%?20%的去离子水，充分搅匀，装入透析袋，加到已用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液平衡好的CM-S^hadexC色谱柱上吸附，透析6?10小时后，用pH值为7.8的2.5mmol/L磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱，用部分收集器收集； 步骤6:将步骤5所得粗酶用2.5mmol/L的磷酸钠缓冲液进行稀释，粗酶与磷酸钠缓冲液的体积比为5:1，进行两次稀释、两次过滤； 步骤7:在步骤6所得滤液中加入lmol/L的CuCl2，滤液与CuCl^体积比10:1，置于冰箱中I?2天，析出的沉淀，即为湿超氧化物歧化酶； 步骤8:真空冷冻干燥即得超氧化物歧化酶产物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的动物凝血块是猪、牛或羊的凝血块。
3.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤I中的过滤采用两层纱布进行过滤。
4.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤2中离心的条件为，O?4°C，5000转/分。
5.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤3中离心的条件为，O?4°C，5000转/分。
6.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤4中离心的条件为，O?4°C，3000转/分。
7.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6中的两次过滤，第一次采用纱布过滤，第二次采用滤纸过滤。
【文档编号】C12N9/02GK104450636SQ201410834602
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】杨正君 申请人:成都市真阳子生物科技有限公司