一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用。本发明采用同源序列法，在拟南芥果胶裂解酶序列的基础上，通过cD?NA-RACE技术，克隆获得了甘蓝型油菜果胶裂解酶BnPL基因的c?DNA、基因组DNA、编码区，并在此基础上利用基因组步移法获得了BnPL基因的启动子。本发明利用重组载体进行BnPL基因的原核表达，表明该基因具有果胶裂解酶活性；通过构建BnPL的反义表达载体，说明BnPL具有促进角果开裂的功能；通过BnPL基因的启动子驱动GUS基因表达，说明BnPL基因的功能可能与细胞的分离相关。这些结果都表达BnPL基因参与细胞分离过程，利用反义技术操作BnPL基因能够创造抗裂角的植物材料。
【专利说明】一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和植物基因工程领域。具体涉及一种果胶裂解酶BnPL及其 编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 油菜角果开裂是构成油菜减产的主要因素之一，也是当前机械化收获中最突出的 问题。生产上由裂角造成的损失一般为10% -20%，当收获期遇到多雨和高温天气时损失 将高达50%。油菜易裂角不利于机械化收获，提高油菜角果的抗裂角能力是机械化收获过 程中急需解决的重大问题，加强油菜抗裂角性状的研究对油菜生产的可持续性发展具有重 要意义。
[0003] 果胶是植物细胞壁的主要组成部分，能在细胞之间的相互连接过程中发挥作用， 在维持植物细胞壁的结构上具有重要意义。另外，果胶也能作用于植物的抗病性状和信号 转导。果胶裂解酶基因是一类能降解果胶质的酶的总称，广泛存在于微生物和植物组织中， 果胶裂解酶基因能通过对半乳糖醛酸的β碳原子上的基团进行转移和消除机制使半乳糖 醛酸的α -1，4键断裂，是一种能降解细胞壁的裂解酶基因，在植物的生长和发育过程中， 伴随着细胞壁的修饰和成分的改变与降解。果胶裂解酶基因通过降解细胞壁的果胶来发挥 这一作用。在植物中，果胶裂解酶基因首先在番茄的花发育过程中被分离出来，且具有花发 育特性。果胶裂解酶基因能降解花粉细胞壁中的果胶物质，从而导致花粉细胞壁的松弛而 使花粉管萌发。在拟南芥中，果胶裂解酶基因不仅能影响组织的腐烂还能诱导拟南芥植株 的抗病体系。
[0004] 在跃变型果实中，果胶裂解酶基因能影响果实的硬度。在成熟香蕉的果实中分离 出了两个果胶裂解酶基因基因 Pel-Ι和Pel-2,这两个基因都只在成熟的角果中表达，在绿 色的角果和叶，根中都不表达，显示这两个果胶裂解酶基因在果实的成熟和软化过程中具 有重要作用。在草莓中构建了 35S启动子驱动的反义表达果胶裂解酶基因基因的载体转化 草莓，在反义表达果胶裂解酶基因基因的阳性草莓株系中，果胶裂解酶基因基因的表达水 平比对照低30%，表型体现为其产量降低，成熟果实果胶裂解酶含量比对照低，果实更硬。 对其中的2个转反义基因的转基因株系进行了细胞学结构观察，发现转反义果胶裂解酶基 因的果实中细胞之间间隙比对照要小，两个相邻细胞之间的结合能力更强，果实更耐存储。 这些实验证明果胶裂解酶基因能控制相邻细胞之间的连接，对维持果实细胞间的结合能力 具有重要作用。
[0005] 由于甘蓝型油菜裂角涉及到离区细胞的降解，果胶裂解酶基因在油菜角果发育中 可能起到一定的作用，因此通过反向遗传学的方法研究果胶裂解酶基因基因的功能，对创 造和培育抗裂角性强的油菜品种具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因，本发明提供了这个基因 的核苷酸序列和其蛋白质的氨基酸序列。该基因参与细胞分离过程，利用反义技术操作 BnPL基因能够创造抗裂角的植物材料。
[0007] 本发明的另一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因的制备方法，该方 法根据拟南芥的果胶裂解酶基因（AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列数据库中找 到了三个匹配较好的序列，根据这三个EST序列设计引物，以甘蓝型油菜cDNA为模板进行 PCR，对PCR产物进行测序后，根据扩增出的序列片段设计RACE引物进行RACE反应，扩增全 长cDNA序列，从而得到全长cDNA序列。以全长cDNA序列设计特异引物，以油菜基因组DNA 为模板扩增BnPL基因的全长序列。
[0008] 本发明的再一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因启动子的制备方 法，根据果胶裂解酶BnPL基因的全长序列设计引物，通过基因组步移法在甘蓝型油菜品系 R2中扩增并拼接出果胶裂解酶BnPL启动子序列。根据拼接出的果胶裂解酶BnPL启动子的 拼接序列设计特异引物，扩增出该基因的启动子全长序列。
[0009] 本发明的再一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角 性中的应用途径。
[0010] 本发明的技术方案通过以下方法实现：
[0011] 一种果胶裂解酶BnPL基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，总长度1416bp，共 编码471个氨基酸。
[0012] 一种果胶裂解酶BnPL基因，其表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0013] 所述的果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性中的应用。
[0014] 所述的果胶裂解酶BnPL基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0015] 所述的果胶裂解酶BnPL基因启动子在植物角果发育调控中的应用。
[0016] 1、一种果胶裂解酶BnPL基因通过以下步骤获得：
[0017] 步骤1，BnPL基因全长cDNA序列的克隆
[0018] a.根据拟南芥果胶裂解酶基因（AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列数据库 中找到三个匹配较好的序列：GR462449. 1，GR453547. 1，GR463150. 1，根据这三个EST序列 设计引物扩增得到了一个小片段的序列，经拼接后作为模板进行引物设计：PL-F-1(5'-CGA GGAAGAGGACGACATTGAG-3'）和 PL-R-1(5' -CGAATCCTCGGCATCCTCTG-3'）；
[0019] b.以甘蓝型油菜品系R2角果发育期RNA反转的cDNA为模板进行PCR扩增，转化 送至英骏生物技术服务有限公司（上海）测序。
[0020] C.为获得基因的全长序列，利用RACE技术扩增全长cDNA序列，使用扩增出的序 列片段设计 RACE 引物：PL-RACE-5(5' -TCCATCGGCCTGTCCTCTAAACC-3'）和 PL-RACE-3(5' -GTACAGGACCACAGGAGGCAAACG-3'），进行RACE反应。对扩增产物测序拼接后获得BnPL基因 全长cDNA序列：如SEQ ID N0. 2所示，长度为1796bp，其中包含178bp的5' UTR，172bp的 3' UTR，另外还存在一个32bp的polyA尾巴。
[0021] 步骤2,获取BnPL基因全长DNA序列
[0022] a.根据该基因的cDNA全长序列设计引物，引物组合为Mq-Pect ate-5-3: (5, -CG GATCCATGGAGACAGCTAGGCTTTTC-3'），Mq-Pectate-3-l:(5'-CCGGAATTCTTAGCATGGTTTTCCGAC C_3,）；
[0023] b.以油菜品系R2的基因组DNA为模板PCR获得BnPL全长基因片段将该片段回收 测序，获得序列BnPL全长DNA基因序列，如SEQ ID NO. 3所示，其总长度为2468bp，由3个 内含子和4个外显子组成。
[0024] 2、果胶裂解酶BnPL基因启动子的获得
[0025] 步骤1，根据果胶裂解酶BnPL基因的全长序列，设计6条特异性引物： SP1(5' -ACTCATCGGTCTCCGCAACA-3' ）、 SP2(5' -GGAATCAAACTGGCAATACAAATCAC-3' ）、 S P3(5' -TTTCTGTTTGGTAGATGAACCGTATT-3' ）、 SP11(5' -TCGCAGACTAATGGGTTGGTAAA-3' ）、 SP12(5' -ACGACGCCGCTTGAGTG-3'）和 SP13(5' -CCTTATAGACGCCAGCCACGA-3'）。
[0026] 步骤2,利用油菜基因组DNA为模板，基因组DNA的核苷酸序列，使用 Genome-walking试剂盒（Takara公司）通过基因组步移扩增油菜BnPL启动子序列：
[0027] 第一次步移以试剂盒提供的AP2引物作为上游引物，以SP1、SP2、SP3引物分别作 为下游引物进行3轮热不对称PCR反应；
[0028] 第二次步移以试剂盒提供的AP4引物作为上游引物，以SP11、SP12、SP13引物分别 作为下游引物进行3轮热不对称PCR反应。
[0029] 对两次步移后的PCR片段测序后进行序列拼接，获得启动子序列，其核苷酸序列 如SEQ ID N0. 5所示，序列总长度为1955bp。
[0030] 3、载体构建
[0031] 1)果胶裂解酶BnPL基因反义载体的构建
[0032] a.使用的引物组合为 Fanyi-3-l: (5, -CGGATCCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3'）和 Fan yi-5-l: (5' -CCGGAATTCATGGAGACAGCTAGGCT-3'）；
[0033] b.以油菜cDNA为模板扩增，片段回收后插入到PMD18简易T载体中，经M13引物 测序；
[0034] c.确定序列的完整性后，利用BamHI/EcoRI对重组载体进行酶切，同时也利用 BamHI/EcoRI对原始PBI121载体进行酶切，切除掉⑶S基因序列；
[0035] d.将两个带有BnPL基因的酶切片段亚克隆入PBI121表达载体，使外源基因序列 取代载体中的报告基因 GUS的位置，其中正义载体为正向方向取代，而反义载体为反向方 向取代。
[0036] 2)果胶裂解酶BnPL基因启动子重组载体的构建
[0037] a.将引物MQ-promoter-5-lOl和MQ-promoter-3-3 (序列见上文）在油菜基因组 DNA的扩增产物回收，插入到PMD18简易T载体中，经M13引物测序；
[0038] b.确定序列的完整性后，利用Clal/Xbal对重组载体进行酶切，同时也利用Clal/ Xbal对原始PBI121载体进行酶切，切除掉35S序列；
[0039] c.然后将带有BnPL启动子的酶切片段克隆入PBI121表达载体，使BnPL启动子取 代载体中的35S启动子序列。
[0040] 4、植物转化
[0041] 重组的含目标果胶裂解酶BnPL基因及其启动子的新质粒PBI121表达载体导入农 杆菌（EHA105)，通过农杆菌介导法转化油菜和拟南芥，其中拟南芥利用花序浸染法转化花 蕾，油菜利用组织培养法转化下胚轴。转基因植株的筛选采用含50mg/L卡那霉素的1/2MS 培养基进行筛选，并通过PCR进行验证，采用的引物组合为Kan-5和Kan-3，扩增的目标基因 为卡那霉素基因，转基因阳性植株经过连续两代选择，T3转基因植株被用作表型分析。
[0042] 本发明中所用的术语"转基因植物"是指含有导入的目标基因并能够稳定地增强 或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。
[0043] 本发明中所提到的植物包括水稻、小麦、玉米等受高温逆境影响较大的粮食作物， 也包括油菜、大豆、棉花等经济作物，还包括夏季生长的黄瓜、番茄等蔬菜作物。
[0044] 提取植物叶片DNA是常用的分子生物学技术，提取mRNA的方法也有多种成熟的技 术，构建本发明中所述的载体构建和将载体转染入植株所用到的酶切、连接、农杆菌介导法 转化油菜下胚轴和侵染拟南芥花序等方法也是本领域中常用技术。
[0045] 本发明中所用到的DNA Marker(lOObp)、dNTPs(10mmol/L)均购自北京鼎国生物公 司；总RNA提取液Trizol和RNA反转录试剂盒购于Invitrogen公司，DNase购于Promega 公司，DNA回收纯化试剂盒购于OMEGA公司。其他试剂均为国产分析纯。克隆载体pMD18-T、 大肠杆菌DH5a，Ex Taq聚合酶（5υ/μυ购自宝生物工程（大连）有限公司。PBI121载 体由 申请人:保存，油菜品系R2由中国农业科学院油料作物研究所油菜杂种优势利用课题 提供。
[0046] 本发明通过克隆果胶裂解酶BnPL基因，构建反义植物表达载体转化油菜和拟南 芥，明确了该基因参与植物角果发育中的细胞分离过程，对于提高植物抗裂角性表现中起 着重要的作用。利用反义技术操作， 申请人:可以利用该基因人工创造抗裂角的植物材料。反 义载体转化拟南芥和油菜的阳性植株中，角果的抗裂性增强。
[0047] 本发明通过克隆果胶裂解酶BnPL基因及其启动子，构建由该启动子驱动的含⑶S 基因的植物表达载体，转化拟南芥后GUS活性只在生殖生长阶段成熟的花药、花瓣柱头和 角果中检测到，尤其在角果顶部、假隔膜及角果与果柄结合处。表明果胶裂解酶BnPL的启 动子具有组织特异性，在植物角果发育调控中的表达有着重要作用。
【具体实施方式】
[0048] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照Sa mbrook等人的《分 子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或Draper 等人（Blackwell科学出版社，1988) -书中所列的具体方法或者条件进行，或按照所用试 剂制造厂商所建议的条件。
[0049] 实施例1 一种果胶裂解酶BnPL基因的获得
[0050] 1. 1总DNA和总RNA的提取
[0051] 采用CTAB法提取植物DNA ;采用Triozol法提取植物的总RNA，使用DNase消化去 除RNA中的DNA污染。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA和总RNA的质量。使用Takara公 司的M-MLV RTase cDNA试剂盒，根据其说明书将2 μ g的总RNA被反转录成cDNA。
[0052] 1. 2BnPL基因全长cDNA序列的克隆
[0053] 根据拟南芥果胶裂解酶基因基因（AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列 数据库中进行同源性搜索，找到了三个匹配较好的序列，EST编号分别为GR462449. 1、 GR453547. 1和GR463150. 1，将这三个序列用CAP3软件拼接，以获得的序列为模板设计引 物：PL-F-1 (5, -CGAGGAAGAGGACGACATTGAG-3,）和 PL-R-1 (5, -CGAATCCTCGGCATCCTCTG-3,） ，以甘蓝型油菜R2角果发育期RNA反转的cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95°C， 2min ;94°C，30s, 55°C，30s, 72°C，lmin,共 34 个循环；最后 72°C 延伸 10min ;PCR 产物用 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。将所得片段克隆至PMD18-T载体上，转化大肠杆菌 DH5ci，蓝白斑筛选重组子，菌落PCR鉴定正确的阳性克隆，送至英骏生物技术服务有限公 司（上海）测序，结果得到了一个822bp的序列。为获得基因的全长序列，利用RACE技术扩 增全长cDNA序列，利用扩增出的822bp的序列设计RACE引物进行RACE反应，5'和3'RACE 的引物分别为 PL-RACE-5 (5 ' -TCCATCGGCCTGTCCTCTAAACC-3 '）和 PL-RACE-3 (5 ' -GTACAGGAC CACAGGAGGCAAACG-3'）。3'RACE与5'RACE过程中cDNA第一条链的合成以及PCR反应体系 的配置和扩增均按照Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。 主要组成成分为：cDNA 第一链 2.5yL，RACE 引物（10ymol/L)L0yL，UPM(10X)5.0yL， Master Mix41. 5μ L。PCR 反应程序为：94°C，30s，72°C，3min，5 个循环；94°C，30s, 70°C， 308,721：，3111丨11，5个循环；941：，308,681：，308,721：，3111丨11，27个循环；共37个循环。？〇? 反应结束后，各取3' RACE和5' RACE产物5. 0 μ L在1. 2%的琼脂糖凝胶电泳上检测，利用 OMEGA公司的胶回收试剂盒回收RACE产物，经pMD18-T载体连接后克隆测序。结果表明 3' RACE产物的长度为1322bp，5' RACE产物的长度为982bp。在3' RACE和5' RACE的产物 中存在361bp的序列重复，经CAP3软件拼接后获得BnPL基因的全长序列，长度为1796bp， 其中包含178bp的5' UTR，172bp的3' UTR，另外还存在一个32bp的polyA尾巴。
[0054] BnPL基因的全长cDNA序列，经ORF find软件分析表明其开放阅读框序列为179bp 至1594bp，总长为1416bp，共编码471个氨基酸，得到了一种油菜果胶裂解酶基因，其碱基 序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。利用在线分析结构域软件http://smart. embl-hei delberg.de/smart分析表明该基因编码的蛋白具有果胶裂解酶基因结构域（domain)。将 此序列在公共数据库NCBI上进行Blaxtp搜索比对寻找同源蛋白，结果表明，油菜的BnPL 与拟南芥（Arabidopsis thaliana)的一些果胶裂解酶基因蛋白的相似性较高。为比较不 同物种果胶裂解酶基因序列的同源性关系，提取了 24个果胶裂解酶基因蛋白，其中含有6 个拟南芥果胶裂解酶基因家族蛋白，涉及到18个物种。通过构建系统发育进化树，结果 表明BnPL与拟南芥的两个蛋白一致性非常高，对应的拟南芥的基因编号为At5gl5110和 At3g01270。拟南芥果胶裂解酶基因家族蛋白的序列在进化过程中发生了分化，可能导致了 不同果胶裂解酶基因功能分化的原因。
[0055] 1. 3果胶裂解酶BnPL基因全长序列的PCR扩增
[0056] 为了获得甘蓝型油菜BnPL基因的全长DNA序列，根据该基因的cDNA序列设计引 物组合：Mq-Pectate-5-3: (5，-CGGATCCATGGAGACAGCTAGGCTTTTC-3，），Mq-Pectate-3_l: (5， -CCGGMTTCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3'）。利用R2的基因组DNA为模板扩增BnPL基因的全长序 列，PCR扩增体系为：20 μ L反应体系，含8. 75 μ L的ddH20, 2 μ L的10 X LAPCR缓冲液，4 μ L 的 2. 5mmol/L 的 dNTP, 2 μ L 的 MgC12 (25mM)，1 μ LPCR 引物 lOmmol/Lprimer, 1 μ L100mmol/L 的模板 DNA，最后加入 0.25yL 的Takara LA Taq(5U/yL)。反应条件为：95°C，3min;94°C， 45s ;50°C，45s ;72°C，3min ;34个循环；最后72°C延伸10min。PCR产物用1. 2%琼脂糖凝胶 电泳检测，回收所得片段进行克隆和测序，结果获得了长度为2468bp的BnPL基因组序列。 利用此序列及cDNA序列在网站http://gsds. cbi. pku. edu. cn/上分析比较，以确定外显子 和内含子的位置，结果表明甘蓝型油菜BnPL基因由3个内含子和4个外显子组成。
[0057] 实施例2BnPL基因启动子的扩增及载体构建
[0058] 2. IBnPL基因启动子的扩增
[0059] 利用油菜基因组DNA作为模板，使用Genome-walking试剂盒（Takara公 司）扩增油菜BnPL启动子序列。根据BnPL基因的全长序列，设计6条特异性引物 SP1(5' -ACTCATCGGTCTCCGCAACA-3' ）、 SP2(5' -GGAATCAAACTGGCAATACAAATCAC-3' ）、 S P3(5' -TTTCTGTTTGGTAGATGAACCGTATT-3' ）、 SP11(5' -TCGCAGACTAATGGGTTGGTAAA-3' ）、 SP12 (5 ' -ACGACGCCGCTTGAGTG-3 '）和 SP13 (5 ' -CCTTATAGACGCCAGCCACGA-3 '）。第一次步移 以试剂盒提供的AP2引物作为上游引物，SP1、SP2、SP3引物分别作为下游引物利用油菜品 系R2的基因组DNA进行3轮热不对称PCR反应。最后一轮产物经回收纯化，并与T-载体 连接，测序发现其长度为l〇18bp。由于序列较短，再次在已测序序列的基础上进行第二次步 移。第二次步移以试剂盒提供的AP4引物作为上游引物，以SP11、SP12、SP13引物分别作为 下游引物进行3轮热不对称PCR反应。第3轮PCR引物测序后表明其序列长度为1431bp。 由于两次步移之间存在着重复序列，根据重复序列拼接后获得共2339bp的前导序列。（具 体PCR过程严格按照试剂盒说明进行。PCR产物电泳检测、回收、克隆、测序同上。）
[0060] 2. 2果胶裂解酶BnPL基因启动子的载体构建
[0061] 利用油菜品系R2的基因组DNA为模板，根据获得的2339bp前导序列设计引物组 合 MQ-promoter-5-lOl 和 MQ-promoter-3-3 进行 PCR，Mq-promoter-5-101: (5，_CATCGATGT GCTGATACCAGCGTAGTCA-3'） ；Mq-promoter-3-3:(5,-CTCTAGATTTTTTTAATTTGATTACCCCTTTTT GCT-3'），验证Genome-walking得到的启动子序列的真实性。PCR扩增体系为：共20 μ L反 应体系，含 10. 75 μ L 的 ddH20, 2 μ L 的 lOXExTaq buffer, 2 μ L 的 2. 5mmol/L dNTP，2 μ L 的MgC12(25mM), 1 μ L 的 lOmmol/LPCR引物，1 μ LlOOmmol/L 的 cDNA，0. 25μ L 的 Takara Ex Taq(5U/y L)。反应条件为：95°C，2min ;94°C，30s, 60°C，30s, 72°C，3min，共 34个循环；最后 72°C延伸10min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，回收所得片段进行克隆和测序。 结果表明步移的序列与通过常规PCR扩增得到的序列相同，由于引物MQ-promoter-5-lOl 和MQ-promoter-3-3扩增的序列长度为1955bp，利用在线启动子分析软件http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html预测，表明此片段具备启动子的基本特征，能代 表果胶裂解酶BnPL的启动子序列。
[0062] 实施例3BnPL基因功能的原核表达验证
[0063] 根据获得的BnPL的cDNA序列设计引物组合扩增BnPL基因的编码区，引物为：Mq-Pectate-5-1 (5，-CGCGGATCCATGGAGACAGCTAGG-3，）和Mq-Pectate-3-1 (5，-CCGGAATTCTTAGC ATGGTTTTCCGACC-3 '）。模板为油菜品系R2的角果发育期cDNA，PCR扩增体系为：总共20 μ L反 应体系，包含10·75μL的ddH20,2μL的10XExTaqbuf?er，2μL的2·5mmol/LdNTP，2μL 的 MgC12 (25mM)，1 μ L 的 10mmol/L PCR 引物，1 μ L100mmol/L 的 cDNA，0· 25 μ L 的 Takara Ex Taq(5U/yL)。反应条件为：95°C，2min;94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin，共 34 个循环； 最后72°C延伸10min ;PCR产物用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收，插入到PEASY-E原核 表达载体（本实验室保存），通过PCR验证其插入方向，菌落PCR检验阳性菌落。采用自身 引物MQ-PL-5-1和MQ-FUL-PL-3-1进行测序，确定序列的正确性和完整性。正向插入的载 体转化大肠杆菌BL21，进行原核表达。先使用含有氨苄的LB平板筛选阳性单克隆，挑出单 克隆接种到2ml含氨苄的LB液体培养基中，37°C下过夜。取0. 5ml过夜培养的菌液接种到 50ml含AMP的LB液体培养基中37°C培养3小时，使其0D600达到0. 5。加入IPTG使其总 浓度达到ImM进行诱导表达，37°C下继续培养。取利用IPTG分别诱导2小时、4小时、6小 时、8小时和10小时的样品各lml，12000rpm离心0. 5分钟，弃上清液，加入lOOul的1倍的 SDS上样缓冲液，震荡混均，沸水中加热5分钟，12000rpm离心0. 5分钟后进行电泳，采用标 准的SDS-PAGE电泳过程进行电泳。通过IPTG诱导后，对诱导液进行沉淀和电泳，表明重组 蛋白生成了一个62kD大小的蛋白质，通过IPTG诱导2小时，4小时，6小时的重组蛋白都能 产生目标蛋白。且通过超声波处理后，在沉淀和上清中都能检测出目标蛋白，说明重组蛋白 属于可溶性蛋白。
[0064] 利用Ni柱进行重组蛋白的纯化，主要过程为：将诱导培养的大肠杆菌进行离心收 集，重悬在GuNTA-Obuffer中，另外加入ImM的PMSF进行悬浮细胞，加入溶菌酶，4°C过夜消 化，利用超声波破壁，l〇〇〇〇rpm离心10分钟，将上清缓慢分段加入Ni柱进行纯化，纯化步骤 按照说明书进行。
[0065] 酶活性检测采用标准的半乳糖醛酸法，过程为：取0. 5ml待测液加入2. 5ml含 0. 3%的多聚半乳糖醛酸的0. 07M的Tris-HCl (PH = 8)，并加入30ul0. 1M的CaC12, 37度下 反应半小时，然后加入0. lml的lMNaOH终止反应；沸水加热5分钟后，lOOOOrpm离心2分 钟，取上清测定232nm的吸光值。设置阴性对照，上述过程中不加待测酶液，其他过程完全 和上述过程相同。通过Ni柱对可溶性蛋白进行纯化，并进行了酶活性测定，结果表明重组 蛋白在Ca离子作用下具有典型的果胶裂解酶基因活性。
[0066] 实施例4植物转化试验
[0067] 主要是通过构建反义表达载体进行拟南芥和油菜的转基因实验，以验证BnPL基 因的功能。构建过程如下：使用的引物组合为Fanyi-3-l: (5' -CGGATCCTTAGCATGGTTTTCCG ACC-3'）和 Fanyi-5-l: (5, -CCGGAATTCATGGAGACAGCTAGGCT-3'）。采用 K0D Plus 聚合酶 (Τ0Υ0Β0)，PCR 体系为 20 μ L，主要包含 11 μ L 的 ddH20, 2 μ L 的 10XPCR buffer for K0D Plus, 2 μ L 的 2mmol/L dNTP，1 μ L 的 25 μ mol/L MgS04,1 μ L 的 PCR 引物，1 μ L100mmol/L 的 cDNA，最后加入 lyL K0D Plus(lU/yL)酶。反应条件为：95°C，2min;94°C，30s，60°C， 30s，72°C，2min，共34个循环；最后72°C延伸10min。PCR产物用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检 测并回收，插入到PMD18简易T载体中，经M13引物测序，确定序列的完整性后，利用BamHI/ EcoRI对重组载体进行酶切，同时也利用BamHI/EcoRI对原始PBI121载体进行酶切，切除掉 ⑶S基因序列。然后将带有BnPL基因的酶切片段亚克隆入PBI121表达载体，使外源基因 序列取代载体中的报告基因 GUS的位置。将重组的含反义目标BnP L基因的新PBI121载 体导入农杆菌（ΕΗΑ105)，通过花序浸染法转化野生型拟南芥，通过组织培养法转化油菜下 胚轴。转基因植物的筛选采用含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基进行，并通过PCR进行验 证，采用的引物组合为Kan-5和Kan-3,扩增的目标基因为卡那霉素基因，采用的PCR扩增体 系为：Dream PCR MIXlOyL(购自 Fe rmentas)，DNA模板 lyL,正反向引物各 2μ?(10μΜ/ L)，ddH205 μ L。反应条件为：95°C，2min ;94°C，30s, 60°C，30s, 72°C，lmin,共 34 个循环；最 后72°C延伸10min ;PCR产物用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。转基因阳性植株经过连续两代 选择，T3转基因植株用作表型分析。
[0068] 提取转基因植株花蕾的RNA，反转录获得cDNA，利用引物组合pectate-75-f和 pectate-244-r检测含反义BnPL基因表达载体的转基因植株中的果胶裂解酶基因的表达 量。对表达了该反义基因的植株进行表型鉴定，以野生型作为对照。与野生型拟南芥相 t匕，在反义表达的转基因阳性拟南芥植株后代的角果出现了变异，多数植株的角果变短，角 果黄熟后不马上开裂甚至延长放置时间也不开裂，整个植株长时间放置不发生角果开裂想 象。而野生型拟南芥角果一旦成熟变黄就全部自然开裂。含反义BnPL基因表达载体的转 基因油菜植株的角果形态变化较小，与非转基因对照相比，反义表达BnPL基因植株的角果 长度略微变小。利用随机碰撞法鉴定发现转基因植株的角果抗裂角性明显增强，碰撞10分 钟后，转基因植株的角果仅有少数破裂，而非转基因对照植株的角果几乎全部破裂。
[0069] 实施例5启动子组织特异性表达验证
[0070] 利用BnPL基因的启动子构建表达载体，构建过程为：先采用引物 MQ-promoter-5-lOl和MQ-promoter-3-3以油菜品系R2的DNA为模板进行PCR，PCR产物用 1. 2 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收，插入到PMD18简易T载体中。经M13引物测序，确定序 列的完整性后，利用Clal/Xbal对重组载体进行酶切，同时也利用Clal/Xbal对原始PBI121 载体进行酶切，切除掉35S序列。然后将带有BnPL启动子的酶切片段亚克隆入PBI121表 达载体中，使BnPL启动子取代PBI121载体中的35S启动子序列。
[0071] 对转基因阳性植株进行⑶S染色分析。⑶S母液混合液的配制：总体积为1L， 主要含有磷酸二氢钠15. 601g ;NaEDTA3. 7224g，亚铁氰化钾211. 2mg，铁氰化钾164. 7mg， TritonX-lOOlml，剩余体积用水补足，最后使用NaOH将PH值调整为7. 0,置棕色试剂瓶于 4°C冰箱避光保存。X-Glux的配制：称量0. 06g的干粉溶于1. 5ml的N，N-二甲基甲酰胺， 锡箔纸包裹后置_20°C冰箱保存备用。
[0072] 取阳性植株的不同组织置入10ml的离心管中，加入⑶S母液混合液8ml，然后加入 100 μ 1的X-Glux溶液，再加入800 μ 1的甲醇后，将植物组织完全浸没，在37°C下过夜。隔 夜后倒掉染液，先用75%的乙醇对材料进行脱色，再用无水乙醇进行脱色，每隔1小时换一 次乙醇，直至组织透明，一般需要2至3次，然后将组织置50%的乙醇中5分钟后，最后将透 明的组织放入纯水中，显微镜观察组织染色情况。
[0073] 观察结果显示在根，茎，叶中都没有检测出GUS活性，只在花和角果中检测到了 GUS活性，在幼小花蕾期检测不到GUS活性，只有当花蕾开放后，在开放的花瓣和成熟的花 药中才开始能检测到其活性，在角果期，在角果皮和DZ区都能检测到GUS活性。说明GUS活 性只在生殖生长阶段的组织中检测到，而在营养生长阶段的组织中检测不到，表明BnPL的 启动子具有组织特异性，主要调控基因在花药、柱头及角果中的表达，尤其是在角果中的表 达，在角果皮、离区及未成熟角果顶端、角果与花托结合处表达量较高，这些都是与细胞分 离密切相关的部位，推测BnPL基因的的功能与细胞的分离相关，在植物角果的发育中起着 重要作用。
[0074]
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[0076]
[0077]
[0078]
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[0080]
【权利要求】
1. 一种果胶裂解酶BnPL基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示。
2. 根据权利要求1所述的一种果胶裂解酶BnPL基因，其特征在于：所述的果胶裂解酶 BnPL基因的表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. -种果胶裂解酶BnPL基因的启动子，其特征在于：所述的启动子核苷酸序列为SEQ ID No. 5 所示。
4. 根据权利要求1所述的一种甘蓝型油菜果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性 中的应用。
5. 根据权利要求3所述的一种果胶裂解酶BnPL基因的启动子在植物角果发育调控中 的应用。
【文档编号】C12N15/113GK104109682SQ201410330994
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】胡琼, 刘佳, 汪文祥, 王军, 李云昌, 梅德圣, 付丽, 王会 申请人:中国农业科学院油料作物研究所