专利名称：：启动子的制作方法启动子本发明为蛋白质表达和细胞选择领域。本文报道了具有弱启动子强度和因此有限表达有效连接的编码核酸的启动子。
背景技术：
：蛋白质的表达是活细胞中的基本过程。蛋白质表达需要的所有信息均由单个核酸提供。该核酸不仅含有蛋白质M酸序列的信息，其还提供所需的调节信息(例如，核糖体结合位点、转录起始和终止信号、剪接信号、增强子元件等)，包括启动子/启动子序列。启动子是调节例如编码多肽的核酸(其有效连接启动子)转录为前mRNA的量的核酸。其为转录控制元件，定位在有效连接编码序列5，末端的RNA聚合酶起始位点附近。从对SV40早期启动子的分析已知，在启动子由7-20碱基对组成的区段中含有转录激活子的识另，J/结合位点。一个区段是RNA合成的起始位点，例如众所周知的TATA框。定位在RNA合成起始位点5，即上游大约30-110碱基对处的其他区段定义了转录起始的频率。启动子至少需要在特定位点并以指定方向(即，5，到3，方向)起始RNA合成的一个区段。。^口^;^^Hlac-lpp、ara-、lac一、tac画、trc-、trp-、phoA-、Pbad-、入pl-、lpp-和T7-启动子。SV40启动子是来自猴(空泡)病毒40基因组的核酸序列。对于真核或原核细胞中异源多肽的重組产生，通常将一个或多个表达质粒引入所述细胞中。所述一个或多个表达质粒包含用于表达异源多肽的表达盒，并还包含用于表达选择性标记的表达盒，所述选择性标记为选择表达所述异源多肽的转染细胞所需。异源多肽和选择性标记的合成均需要部分细胞表达装置的能力。因为目标主要是产生异源多肽，所以细胞表达装置的绝大多数可得能力应该分配来表达编码异源多肽的核酸。仅少量应该用于表达选择性标记。表达能力的这种分配通过相应启动子的强度来完成。更强的启动子是更多有效连接的核酸进行了转录并因此进行了翻译。因此，存在具有可调节或可减小启动子强度的启动子的需要。Taylor,W.E.等(Endocrinol.137(1996)5407-5414)报道了人干细胞因子启动子缺失变体。在美国专利申请US2007/0092968中才艮道了用于癌治疗基因的肿瘤选择性和高效表达的新hTMC启动子和载体。Fromm等(J.Mol.Appl.Gen.1(1982)457-481和ibid2(1983)127-135)才艮道了SV-40早期区启动子的缺失作图和缺失突变体。在US6，399，571中报道了壳多糖酶壳多糖结合片段。WO99/62927报道了结締组织生长因子-4。发明概述本发明的第一方面是具有，即具有核酸序列SEQIDNO:02或SEQIDNO:03或SEQIDNO:04或SEQIDNO:06的启动子。在一个实施方案中，所述启动子具有核酸序列SEQIDNO:04。本发明的笫二方面是具有核苷酸序列SEQIDNO:04,并当有效连接编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸序列SEQIDNO:07时，相比于野生型SV40启动子SEQIDNO:05具有20%或更^f氐启动子强度的核酸。本发明的其他方面是选择细胞的方法，所述方法包括这样顺序的以下步骤a)用核酸转染真核细胞，所述核酸包含i)包含编码异源多肽的核酸的第一个表达盒，ii)包含第一个核酸SEQIDNO:04和编码选择性标记的第二个核酸的第二个表达盒，由此所述第一个核酸有效连接第二个核酸，b)在适合于非转染真核细胞生长的条件下培养所述转染细胞，c)选择在步骤b)中繁殖的细胞，并同时i)在选择性培养条件下繁殖，或ii)表达戶斤述选择'l"生才示i己。在本发明该方面的一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞或PER.C6细胞、或HEK细胞、或Sp2/0细胞。在另一实施方案中，所述异源多肽M疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中，所述选择性标记是新霉素-氨基糖苷磷酸转移酶，或潮霉素-磷酸转移酶，或dLNGFR或GFP。本发明的第四方面是用于表达异源多肽的方法，其包括这样顺序的以下步骤a)用包含表达盒的核酸转染哺乳动物细胞，所述表达盒包含有效连接编码异源多肽的第二个核酸的第一个核酸SEQIDNO:02或SEQIDNO:03或SEQIDNO:04或SEQIDNO:06，b)选择步骤a)中转染的细胞，c)在适合于所述异源多肽表达的情况下培养所选择的细胞，d)从所述细胞或所述培养基中回收异源多肽。在本发明该方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、或PER.C6细胞、或HEK细胞、或Sp2/0细胞。在另一实施方案中，第一个核酸是SEQIDNO:04。在另一实施方案中，第二个核酸编码免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在另一实施方案中，所述核酸包含编码选择性标记的第二个表达盒。发明详述本发明报道了具有核苷酸序列SEQIDNO:02或SEQIDNO:03或SEQIDNO:04或SEQIDNO:06的新启动子核酸。用于进行本发明的方法和技术为本领域技术人员所知并描述于，例如A謂bel，F.M.，编辑，CurrentProtocolsinMolecularBiology,I至III巻(1997)，和Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)7中。已知本领域技术人员能够使用重组DNA技术产生核酸和/或多肽的许多衍生物。例如可通过在个别位置或几个位置中替代、改变、交换、缺失或插入来修饰此类衍生物。例如可通过位点定向诱变进行修饰或衍生。本领域技术人员可容易地进行这种修饰(参阅例如Sambrook，J.等，MolecularCloning:Alaboratorymanual(1999)ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,美国)。重组净支术的4吏用4吏得本领域4支术人员能够用异源核酸转化多种宿主细胞。"启动子，，指核酸，即多核苷酸序列，其控制有效连接的核酸的转录。启动子可包括RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所用一个或多个启动子在宿主细胞的细胞类型中将是有功能的，在所述宿主细胞中涉及有效连接核酸的表达。大量启动子，包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子为本领域所熟知(并在数据库如GenBank中得以鉴定)。它们可克隆多核苷酸获得或在克隆多核苷酸内获得(来自例如保藏中心，如ATCC及其他市售或个体来源)。"启动子"包含指导例如有效连接的结构基因进行转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区或5'非翻译区(5，UTR)，靠近结构基因的转录起始位点。在转录起始起作用的启动子内的序列元件特征通常在于共有核苷酸序列。这些序列元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE;McGehee,R.E.等，Mol.Endocrinol.7(1993)551)、环腺苷酸应答元件CRE)、血清应答元件(SRE;Treisman,R.，SeminarsinCancerBiol.1(19卯)47)、糖皮质激素应答元件(GRE)，和用于其他转录因子如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.等,J.Biol.Chem.267(1992)19938)、AP2(Ye,J"等，J.Biol.Chem.269(1994)25728)、SP1的结合位点、cAMP应答元件结合蛋白(CREB;Loeken，M.R"GeneExpr.3(1993)253-264)和/Mt苷酸因子(一般参阅，Watson等编辑，MolecularBiologyoftheGene,第4版，TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.1987，和Lemaigre，F.P.和Rousseau,G.G，Biochem.J.303(1994)1-14)。如果启动子是诱导型启动子，那么响应诱导剂的转录速率提高。相反，如果所迷启动子是组成型启动子，那么转录速率不受诱导剂的调节。阻抑型启动子也是已知的。例如，c-fos启动子在生长激素结合到细胞表面其受体上后被特异性激活。可通过人工杂合启动子完成四环素(tet)调节的表达，所述启动子由例如CMV启动子后接两个Tet-操纵子位点组成。Tet-阻抑物结合两个Tet-操纵子位点并阻断转录。加入诱导物四环素后，Tet-阻抑物从Tet-操纵子位点上释放，转录继续进行(Gossen，M.和Bujard，H"Proc.Natl.Acad.Sci.美国89(1992)5547-5551)。对于其他诱导型启动子，包括金属石危蛋白和热激启动子，参阅例如Sambrook，等(上文)，和Gossen，M.，等，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已经鉴定为强启动子用于高水平表达的真核启动子是SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复、中国仓鼠延伸因子loc(CHEF-1，参阅例如US5,888,809)、人EF-la、泛素和人巨细胞病毒立即早期启动子(CMVIE)。增强子(即，在启动子上作用增强转录的顺式作用DNA元件)在提高单独用启动子获得的表达水平中与启动子连接发挥作用是必需的，并可作为转录调节元件被包括在内。通常，含有启动子的多核苷酸区段也将包括增强子序列(例如，CMV或SV40)。如此处所用，术语"核酸"是由各核普酸組成的多聚物，即多核苦酸。它指天然发生的，或部分或完全非天然发生的核酸，其例如编码可重组产生的多肽。核酸可由通过化学手段分离的或合成的DNA片段构成。核酸可整合到另一核酸中，例如整合到表达质粒或宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭和表达栽体。通常，所述质粒还将包含原核增殖单位，其包含分别用于在细菌中栽体复制和选择的复制起始区(例如ColEl的复制起始区)和选择性标记(例如，青霉素或四环素抗性基因)。如本发明中所用的术语"启动子强度"和其语法上的等同物指启动子在有效连接的核酸的转录中的功效。如果与野生型SV40启动子SEQIDNO:05的启动子强度相比，启动子的启动子强度可以高，即其可以从卯％到高于100%，或中等，即可以从40。/。到^f氐于90%,或j氐，即其可^直至低于40%。可通过比较有效连接所讨论的启动子的异源多肽的表达量与同一细胞类型中有效连接野生型SV40启动子的该异源多肽的表达量来测定该值。这可以例如通过ELISA测定，测定转染有表达盒的CHO-或HEK-细胞中异源多肽的表达量来完成，所述表达盒由所讨论的启动子有效连接的编码异源多肽的核酸组成。在转染有表达盒的同一细胞系中通过比较该量与同一异源多肽的表达量，即比较具有相同表ii^粒(其中仅一个启动子被改变)的同一细胞中异源多肽的量来测定相对启动子强度，所述表达盒与由野生型SV40启动子有效连接的编码同一ELISA测定确定的异源多肽的核酸组成。如本申请中所用的术语"野生型SV40启动子，，表示核酸SEQIDNO:05，其对应于SV40基因组核酸SEQIDNO:01的位置72-411。"有效连接"指两种或更多种组分的并置，其中所述组分处于允许它们以其期望方式起作用的关系中。例如，如果其顺式起作用以控制或调节连接的编码序列的转录，那么启动子和/或增强子有效连接编码序列。通常，但不是必须的，"有效连接的"DNA序列是相邻的，并且需要时连接两个蛋白质编码区，如相邻并在阅读框内的分泌前导序列/信号序列和多肽。然而，尽管有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但其不必与其相邻。增强子不必相邻。如果所迷增强子增强编码序列的转录，那么其有效连接编码区。有效连接的增强子可以位于编码序列的上游、中间或下游，和距离启动子相当远的位置。如果聚腺普酸化位点以转录通过编码区至聚腺苷酸化序列进4亍的方式定位在编码序列的下游末端，那么其有效连接编码序列。通过本领域已知的重组方法，例如使用PCR方法，和/或通过在便利的限制性酶切位点上连接来完成连接。如果不存在便利的限制性酶切位点，那么根据一般实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。在本发明范围内，可基本上利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染细胞。例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中。或者，可寸吏用脂转染试剂如FuGENE6(RocheDiagnosticsGmbH，德国)、X-tremeGENE(RocheDiagnosticsGmbH，德国)和LipofectAmine(InvitrogenCorp.,美国)。或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒栽体系统将核酸引入细胞中(Singer,O.，Proc.Natl.Acad.Sci,美国101(2004)5313-5314)。术语"细胞"或"宿主细胞"指能够或可以向其中引A/转染例如编码异源多肽或构成shRNA的核酸的细胞。宿主细胞包括原核细胞，其用于繁殖栽体/质粒，和真核细胞，其用于表达核酸。在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在另一实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞选自如下的哺乳动物细胞CHO细胞(例如CHOKl或CHODG44)、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、HEK293EBNA细胞、PER.C6细胞和COS细胞。在其他实施方案中，所述哺乳动物细胞选自杂交瘤、骨髓瘤和啮齿动物细胞。骨髓瘤细胞包含大鼠骨髓瘤细胞(例如YB2)，和小鼠骨髓瘤细胞(例如NS0、SP2/0)。用于药学应用的多肽在一个实施方案中在哺乳动物细胞如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PERC6细胞等中产生。为了宿主细胞的发酵并因此为了目的多肽的表达，使用培养基。今天CHO细胞在实验室中小规^^莫或在生产过程中大规模地广泛用于药物多肽的表达。由于其广泛的分布和用途，CHO细胞的特征和遗传背景是众所周知的。因此，管理机构认可CHO细胞用于产生应用于人的治疗蛋白质。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。"表达盒"指核酸，其含有宿主细胞中至少含有的结构基因进行表达和分泌所需的元件。核酸的特征同样在于其由单个核苷酸组成的序列，或由核酸分子编码的氨基酸序列。"基因"表示核酸，其为例如染色体或质粒上的区段，能够影响肽、多肽或蛋白质的表达。除了编码区，即结构基因，基因还包含其他功能元件，例如，信号序列、启动子、内含子和/或终止子。"结构基因"表示不含信号序列的基因区域，即编码区。如此处所用，术语"表达"指细胞内发生的转录和/或翻译。可在细胞中存在的相应mRNA量的l^出上测定宿主细胞中期望产物的转录水平。例如，可通过PCR或通过Northern杂交对从所选核酸转录的mRNA进行定量(参阅Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。可通过多种方法，例如通过ELISA，通过测定蛋白质的生物活性，或通过使用不依赖该活性的测定，如使用识别并结合所述蛋白质的抗体的Western印迹或放射免疫测定对由所选核酸编码的蛋白质进行定量(参阅Sambrook,等，1989，上文)。如此处所用，"调节元件"指编码目的多肽的核酸序列进行转录和/或翻译所需的顺式存在的核苷酸序列。转录调节元件通常包含待表达的核酸序列上游的启动子、转录起始和终止位点和聚腺苷酸化信号序列。术语"转录起始位点，，指核酸中对应于掺入初级转录物即mRNA前体的笫一个核苷酸的核普酸；所述转录起始位点可与所述启动子序列重叠。术语"转录终止位点"指通常在待转录目的基因3'末端处呈现的核苷酸序列，其引起RNA聚合酶终止转录。所述聚腺苷酸化信号序列或多A添加信号为在真核mRNA3'末端的特定位点进行切割并在细胞核中向切割的3'末端转录后添加约100-200个腺苦酸(聚A尾巴)的序列提供信号。所迷聚腺香酸化信号序列可包括位于切割位点上游约10-30个核苷酸的共有序列AATAAA。"多肽"是通过肽键连接的M酸残基的聚合物，其可以是天然产生的或合成的。低于约20个氨基酸残基的多肽可称作"肽"。包含两条或多条M酸链或包含长度为100个M酸或更多个M酸的M酸链的多肽可称作"蛋白质"。多肽或蛋白质也可包含非肽组分，如糖类基团或金属离子。可通过产生所述蛋白质的细胞向蛋白质添加糖类和其他非肽成分，并且其根据细胞类型而有所变化。蛋白质和多肽此处以其氨基酸骨架结构定义；如添加糖类基团通常不进行明确说明，但也存在。"异源DNA"或"异源多肽"指并非给定宿主细胞中天然存在的DNA分子或多肽，或DNA分子群或多肽群。对特定宿主细胞异源的DNA分子可含有来自宿主细胞种类的DNA(即内源DNA)，只要该宿主细胞来源DNA与非宿主细胞来源DNA(即外源DNA)组合。例如，认为含有编码多肽的非宿主DNA区段的DNA分子是异源DNA分子，所述非宿主DNA区段有效连接包含启动子的宿主DNA区段。相反，异源DNA分子可包含12与外源启动子有效连接的内源结构基因。非宿主DNA分子编码的肽或多肽是"异源"肽或多肽。术语"选择性标记"表示允许在相应"选择剂"的存在下特异性选择或不选择携带该核酸的细胞的核酸。有用的阳性选择性标记是例如抗生素抗性基因。所述选择性标记允许在相应选择剂的存在下选择转化有该选择性标记的细胞；非转化细胞在选择性培养条件下，即在选择刑存在下不能够生长或存活。选择性标记可以是阳性的、阴性的或双功能的。阳性选择性标记允许选择携带所述标记的细胞，而阴性选择性标记允许特异性排除携带标记的细胞。通常，选择性标记将赋予对药物的抗性或补偿细胞中的代谢或分解代谢缺陷。对真核细胞重要的选择性标记包括，例如^tJ4t苷砩酸转移酶(APH)，如潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418APH、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(选择剂-引咪)、组氨醇脱氢酶(选择剂组氨醇D)，和提供嘌呤霉素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的基因。其他选择性标记才艮道于WO92/08796和WO94/28143。如本发明所用，术语"表达装置"表示细胞的酶、辅助因子等的总和，其参与从核酸或基因(即也称为"基因表达装置")转录开始到核酸编码的多肽进行翻译后修饰的过程。所述"表达装置"例如包括步骤DNA转录成前mRNA、前mRNA剪接成成熟mRNA、mRNA翻译成多肽并且所述多肽进行翻译后修饰。术语"在适合于异源多^达的条件下"表示用于培养表达异源多肽域技术人员也已知的是这些条件可根据所培养的哺乳动物细胞的类型和所表达的蛋白质的类型而变化。通常，所述哺乳动物细胞在例如20。C到40r之间的温度下，以0.1升到107升的体积培养足以允许有效蛋白质产生的时间，例如4到28天。术语"在适合于非转染细胞生长的条件下"表示通常用于培养同一细胞系的非转染细胞的条件。这些M是已知的或可通过本领域技术人员容易地测定。如本申请中所用，术语"回收异源多肽，，表示沉淀、盐析、超滤、渗滤、冷冻干燥、溶剂体积减少，以获得浓缩的溶液，或层析。通常层析方法用于分离和纯化多肽。充分建立了不同的方法并广泛用于蛋白质回收和纯化，如具有微生物蛋白质(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)的亲和层析、离子交换层析(例如阳离子交换(羧曱基树脂)、阴离子交换(M乙基树脂)和混合态交换)、亲硫吸附层析(例如具有P巯基乙醇和其他SH配基)、疏水性相互作用或芳香族吸附层析(例如具有苯基琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或m-^苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如具有Ni(II)-和Cu(II)-亲和金属)、大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。术语"免疫球蛋白"指基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或更多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及多种免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双体(例如Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国85(1988)5879-5883;Bird,R.E.等，Science242(1988)423-426;综述，Hood等，Immunology,BenjaminN.Y.，第2版(1984);和Hunkapiller，T.和Hood，L.，Nature323(1986)15-16)。免疫球蛋白通常包含两条所谓的轻链多肽(轻链)和两条所谓的重链多肽(重链)。每条重链和轻链多肽均含有可变域(可变区)(通常为多肽链的氨基端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每条重链和轻多肽链均包含恒定区(通常为羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体结合i)携带Fey受体(FcyR)的细胞，如吞噬细胞，或ii)携带也称为Brambell受体的新生Fc受体(FcRn)的细胞。其也介导结合一些因子，包括经典的补体系统的因子，如组分(Clq)。免疫球蛋白轻链或重链的可变域依次包含不同的区段，即四个框架区(FR)和三个高变区(CDR)。"免疫球蛋白片段"表示包含结构域组中至少一个结构域的多肽，所述结构域组包含免疫球蛋白重链的可变域、CHl结构域、铰链区、Ch2結14构域、CH3结构域、CH4结构域或免疫球蛋白轻链的可变域或CL结构域。也包含的是其衍生物和变体。此外，可存在其中一个或多个氨基酸或M酸区域缺失的可变区。"免疫球蛋白缀合物"表示通过肽键与其他多肽缀合的多肽，其包含免疫球蛋白重链或轻链的至少一个结构域。所述其他多肽是非免疫球蛋白肽，如激素、生长受体、抗融合肽(antifusogenicpeptide)等。本发明报道了具有核苷酸序列SEQIDNO:02或SEQIDNO:03或SEQIDNO:04或SEQIDNO:06的启动子。用于鉴定潜在高产细胞克隆的方法是通过内部核糖体进入位点(IRES)连接选择性标记基因和编码异源多肽的结构基因的表达。在该设计下，所述异源多肽的表达可与所述选择性标记的表W目关联。另一方法U因扩增。用载体/质粒转染其中缺少酶，二氢叶酸还原酶(DHFR)的细胞，所述载体/质粒含有用于表达DHFR蛋白质的第一个表达盒和用于表达异源多肽的第二个表达盒。通过使用缺少甘氨酸的培养基，建立次黄嘌呤和胸腺嘧咬核苷选择性培养条件。为了扩增，加入DHFR抑制剂氨甲蝶呤(MTX)(Kaufman,R.J"等，JMol.Biol.159(1982)601-621;US4,656,134)。通常可使用任何类型的基因，其表达产物作为富集和选择转染子的标记定位在细胞表面/可在细胞表面被检测。低亲和力神经生长因子受体的截短形式dLNGFR，因此对信号转导而言为灭活的，其在细胞表面上表达，并已经证明为对细胞生物学分析极其有用的标记(Philipps,K.等，Nat.Med.2(1996)1154-1156和Machl,A.W.等，Cytometry29(1997)371-374)。为了必要地减少目的异源多肽的产生，选择产生异源多肽的细胞，即成功转染的细胞所需的选择性标记的表达应该尽可能低，但仍然可检测。目前已经惊奇地发现该需要可通过本发明的启动子得以满足。通过使用本发明的启动子，可选择这样的细胞，其相比于在相同条件下选择的并不使用本发明启动子的细胞表达更高水平的异源多肽。已经惊奇地发现使用本发明的启动子，可在降低开支的情况下分离表达异源多肽的细胞。此外，已经发现通过使用本发明的启动子，相比于在相同条件和选择剂浓度的情况下通过^f吏用全长SV40启动子选择的细胞，可选择以更高水平表达异源多肽的细胞。如本申请中所用，术语"5，缩短的SV40启动子"表示野生型SV40启动子，其中已经删除了核酸序列5，末端一定数量的连续核苷酸。因此，本发明才艮道了具有，即具有核酸序列SEQIDNO:02的启动子。SEQIDNO:02包含野生型SV40启动子SEQIDNO:05的核苷酸61到348,即核苷酸l到60已经被删除。具有启动子SEQIDNO:02的制备示于实施例1中。本发明还报道了具有，即具有核酸序列SEQIDNO:03的启动子。SEQIDNO:03对应于野生型SV40启动子SEQIDNO:05的核苷酸130到348，即核苷酸1到129已经被删除。具有启动子SEQIDNO:03的制备示于实施例2中。本发明最后净艮道了具有，即具有核酸序列SEQIDNO:04的启动子。SEQIDNO:04是野生型SV40启动子SEQIDNO:05的核普酸177到348，即核苷酸l到176已经纟皮删除。具有启动子SEQIDNO:04的制备示于实施例3中。本发明最后报道了具有，即具有核酸序列SEQIDNO:06的启动子。SEQIDNO:06由野生型SV40启动子SEQIDNO:05的核苷酸203到348组成，即核苷酸1到202已经被删除。为了测定具有SEQIDNO:02到04和06的核酸序列的启动子的启动子强度，已经产生了表达质粒，其中每种不同启动子有效连接编码GFP(绿色荧光蛋白，SEQIDNO:07)的核酸。如从图7a)到c)可见，野生型SV40启动子核酸中核苷酸的5，缺失降低了启动子强度。启动子SEQIDNO:02与全长野生型SV40启动子具有大致相同的强度。启动子SEQIDNO:03和04分别具有大约56%和大约19%的启动子强度。因此，与野生型SV40启动子相比，使用本发明的启动子，有效连接到其上的核酸的表达可被降低或限制。在猴病毒40中是前面为两个72bp重复的SV40启动子。在本发明的一个实施方案中是第一个72bp重复缺失，而第二个72bp保留。在一个实施方案中，本发明的核酸包含核酸SEQIDNO:04前面的核酸SEQIDNO:14。在另一实施方案中，本发明的核酸包含猴病毒40启动子SEQIDNO:14的第二个72bp重复。在本发明的核酸的其他实施方案中，所迷SV40启动子的第一个72bp重复缺失，而SV40启动子的第二个72bp重复保留。这可用于异源多肽的表达。在该实施方案中是本发明的启动子(其仅含有野生型SV40启动子的第二个72bp重复)有效连接编码选择性标记的核酸。在该启动子的启动子强度降低的情况下，选择性标记的表达降低，而通过使用例如野生型SV40启动子SEQIDNO:05维持了异源多肽的表达。因此，已经发现相比于其中编码选择性标记的核酸以及编码目的异源多肽的核酸均有效连接野生型启动子的构建体，有效连接编码选择性启动子，例如SV40或CMV的组合导致异源多肽的表达升高。在稳定细胞克隆中，编码选择性标记的核酸和编码异源多肽的核酸，以及其相应的启动子共同整合到所述细胞的基因组中。因为基因组中的整合定位是随机过程，通常进行选择步骤。在该选择步骤中，仅选择这样的细胞，其中相连核酸整合到基因组中并位于转录高度活化位点附近。通过选择步骤去除已经整合远离该位点的核酸或已经整合不同位点的两种核酸的细胞。本发明的另一方面是由核断列SEQIDNO:02或SEQIDNO:03或SEQIDNO:04或SEQIDNO:06组成的核酸，当有效连接核酸SEQIDNO:07时，其具有野生型SV40启动子SEQIDNO:05的启动子强度的卯％或更高，或40%到{氐于90%，或^f氐于40%的启动子强度。当它们各自有效连接核酸SEQIDNO:07时，在优选的实施方案中具有核酸序列SEQIDNO:04并且启动子强度是野生型SV40启动子SEQIDNO:05的启动子强度的20%或更低的核酸。因为本发明的核酸和启动子分别各自具有降低的启动子强度，即当与野生型SV40启动子相比时，有效连接到其上的核酸以减少的量或减少的17速率进行转录，它们用于多种应用中。例如，它们可用于促进有效连接的选择性标记的表达，在不需要大部分细胞蛋白质表达装置能力的情况下允许选择携带该选择性标记的细胞。由此不负面影响例如共表达异源多肽的表达。本发明的另一方面是选择表达异源多肽的细胞的方法，其包括步骤a)用核酸转染真核细胞，所述核酸包含i)包含编码异源多肽的核酸的第一个表达盒，ii)包含第一个核酸SEQIDNO:04和编码选择性标记的第二个核酸的第二个表达盒，由此所述第一个核酸有效连接第二个核酸，b)在适合于非转染真核细胞生长的条件下培养所述转染细胞，c)选择步骤b)中繁殖的细胞，并且还i)在选择性条件下繁殖，或ii)表达所述选择性标记。适合于该方法的细胞是例如CHO细胞、BHK细胞、PERC6⑧细胞、HEK细胞、HeLa细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，在优选的实施方案中所述细胞选自CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或PER.C6细胞。异源多肽可以是任何目的异源多肽，如前体药物、酶、酶片段、酶抑制剂、酶激活剂、生物活性多肽、刺猬蛋白、骨形成蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、GCSF、白介素、干扰素、免疫球蛋白，或抗融合肽，或其片段，或其缀合物。在一个实施方案中，所述异源多肽M疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中，方法的步骤c)是在选择性培养条件，即存在选择剂的情况下选择步骤b)中繁殖的细胞。在另一实施方案中，方法的步骤c)是选择步骤b)中繁殖的细胞并表达所述第二种核酸编码的选择性标记。在第一个实施方案中是在选择剂存在下培养的转染细胞，所述选择剂抑制未转染细胞或不充分表达编码所述选择性标记的第二种核酸的细胞的繁殖。在第二个实施方案中是在选择剂缺失下培养的转染细胞，并且通过检测选择性标记的表达，例如通过FACS或目检进行选择。可以单一步骤或多个步骤进行细胞的选择。在单一/多个步骤方法中，基于例如选择性标记(如dLNGFR或GFP)的阈水平进行第一次选择。例如，对于通过流式细胞术(例如通过FACS-荧光激活细胞分选)进行的选择，设定荧光阈水平，选择荧光高于该阈水平的细胞。或者，可收集样品群体荧光强度前1-15%(即，具有最强检测标记的15%细胞)、或前1-10%、或前1-5%、或前5-10%的细胞。用于选择细胞的可选方法是免疫结合例如包被A蛋白质或特异性免疫球蛋白的磁珠。可将所选细胞组视为用于进一步选择步骤的基本群体，例如通过单个细胞播种、培养和ELISA分析(酶联免疫吸附测定)、或通过有限稀释克隆、或通过培养几天扩繁并进一步进行FACS选择、或通过更高阈水平的进一步FACS选择，其例如基于先前FACS选择中检测的荧光强度、或通过免疫沉淀方法(参阅例如WO2005/020924)。在一个实施方案中，可通过选自流式细胞术、ELISA、免疫沉淀、免疫亲和柱层析、磁珠免疫亲和分选、基于显微镜的分离方法，或免疫结合的方法进行选择本发明的细胞。在另一实施方案中，可通过选自流式细胞术、EL1SA、免疫沉淀、免疫亲和柱层析、磁珠免疫亲和分选、基于显微镜的分离方法，或免疫结合的方法，然后通过选自单细胞播种和培养、有限稀释、或培养扩繁的方法，然后通过选自FACS、免疫沉淀、免疫亲和柱层析、磁珠免疫亲和分选、基于显微镜的分离方法或ELISA进行选择本发明的细胞。本发明最后一方面是通过将本发明的启动子有效连接到编码所述异源多肽的核酸上，以在细胞中表达异源多肽的方法。该方法适合于表达例如具有低溶解性或慢折叠动力学的大蛋白质。如果异源多肽或核酸负面影响宿主细胞或降低有功能的，即正确折叠的异源多肽的总产量，那么异源多肽表达或核酸转录的量或速率的降低是可取的。因此，本发明的一方面是具有无功能，即未正确折叠的多肽的还原部分的异源多肽的表达或产生。如果宿主细胞中表达的异源多肽例如超过了重量、或氨基酸数量、或亚基数量、或翻译后修饰数量的某一值，那么可能在培养宿主细胞后获得无功能，即非活性或未正确折叠形式的异源多肽。防止该问题发生的一种可能是减少蛋白质表达的量，即速率。因为蛋白质的表达受有效连接的启动子强度的调节，所以本发明的启动子十分合适。因此，本发明包含用于表达或产生具有无功能多肽的还原部分的异源多肽的方法，其中所述方法包括这样顺式的以下步骤a)用包含表达盒的核酸转染哺乳动物细胞，所述表达盒包含有效连接编码异源多肽的核酸SEQIDNO:02或SEQIDNO:03或SEQIDNO:04或SEQIDNO:06的启动子，b)选择步骤a)中转染的细胞，c)在适合于所述异源多肽表达的条件下培养所选细胞，d)从所述细胞或培养基中回收所述异源多肽。在本发明该方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或PER,C6⑧细胞。在该方法的一个实施方案中，所述启动子是SEQIDNO:03或SEQIDNO:04。在另一实施方案中具有SEQIDNO:04的启动子。在另一实施方案中是编码异源多肽、编码免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物的核酸。在另一实施方案中包含编码选择性标记的第二个表达盒的核酸。提供以下实施例、序列表和附图帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中得以阐明。应理解在不背离本发明精神的情况下可在所述方法中进行修改。附图简述图1质粒5500的质粒图。图2质粒5501的质粒图。图3质粒4703的质粒图。图4质粒4712的质粒图。图5质粒4713的质粒图。20图6FACS分析HEK293EBNA细胞的dLNGFR表达，所述细胞转染有a)有效连接SEQIDNO:07的SEQIDNO:05的表达盒，b)有效连接SEQIDNO:07的SEQIDNO:04的表达盒，c)有效连接SEQIDNO:07的SEQIDNO:06的表达盒，图7FACS分析HEK293EBNA细胞的GFP表达，所述细胞转染有a)有效连接SEQIDNO:07的SEQIDNO:05的表达盒，b)有效连接SEQIDNO:07的SEQIDNO:03的表达盒，c)有效连接SEQIDNO:07的SEQIDNO:06的表达盒。实施例1核酸SEQIDNO:02的构建用有效连接编码dLNGFR(质粒4788)的核酸的全长SV40启动子作为模板经PCR反应获得5，缩短的SV40启动子SEQIDNO:02。PCR混合物为添加有2mMMgS04的1xPWO緩沖液(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,德国)、200|uMdNTPPCRNucleotideMix(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim，德国)、1|aM正向引物SEQIDNO:08、1|aM反向引物SEQIDNO:13、50ng质粒4788的模板DNA、2.5UPWO掘A聚合酶(PWO=Pyrococcuswoesei;RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,德国)、和100重蒸馏超纯水。PCR条件为94°Cl分钟，l个循环；94'C0.5分钟，25个循环；55°C0.5分钟，25个循环；72°Cl分钟，25个循环；72°C5分钟，1个循环。实施例2核酸SEQIDNO:03的构建用有效连接编码来自质粒4788的dLNGFR的核酸的全长SV40启动子作为模板经PCR反应获得5，缩短的SV40启动子变体SEQIDNO:03。PCR混合物为添加有2mMMgS04的1xPWO緩冲液、200nMdNTPPCRNucleotideMix、1pMSEQIDNO:09的正向引物、1JliMSEQIDNO:13的反向引物、50ng质粒4788的模板DNA、2.5UPWO-DNA聚合酶和100重蒸馏超纯水。PCR条件为94°C1分钟，1个循环；94"C0,5分钟，25个循环；55。C0.5分钟，25个循环；72'C1分钟，25个循环；72。C5分钟，l个循环。实施例3核酸SEQIDNO:04的构建用有效连接编码dLNGFR(质粒4788)的核酸的全长SV40启动子作为模板经PCR反应获得5，缩短的SV40启动子变体SEQIDNO:04。PCR混合物为添加有2mMMgS04的1xPWO緩冲液、200jiMdNTPPCRNucleotideMix、1juM正向引物SEQIDNO:10、1pM反向引物SEQIDNO:13、50ng质粒4788的模板DNA、2.5UPWO-DNA聚合酶和100pL重蒸馏超纯水。PCR条件为94°C1分钟，1个循环；94°C0.5分钟，25个循环；55°C0.5分钟，25个循环；72X:1分钟，25个循环；72°C5分钟，l个循环。实施例4其他启动子的构建用有效连接编码dLNGFR的核酸的全长SV40启动子作为模板经PCR反应产生其他5，缩短的SV40启动子变体。PCR混合物为添加有2mMMgS04的1xPWO緩冲液、200nMdNTPPCRNucleotideMix、1jaM正向引物SEQIDNO:11(产生SEQIDNO:06)或SEQIDNO:12、1MM反向引物SEQIDNO:13、50ng质粒4788的模板DNA、2.5UPWO-DNA聚合酶和100|nL重蒸馏超纯水。PCR条件为94'C1分钟，l个循环；94°C0.5分钟，25个循环；55°C0.5分钟，25个循环；72°Cl分钟，25个循环；72X:5分钟，1个循环。实施例5有效连接SEQIDNO:02、03、04和06的dLNGFR的表达获得核酸SEQIDNO:02、03、04和06所用的引物包含限制性内切酶Sail和EcoRI的限制性位点。使用这些限制性位点/限制性内切酶已将有效连接编码dLNGFR(对于LNGFR(低亲和力神经生长因子)参见例如Philipps，K.等，Nat.Med.2(1996)1154-1156;或Machl，A.W.等，Cytometry29(1997)371-374)的核酸的这些核酸连接至质粒4736-pUC-DHFR上，该质粒4736-pUC-DHFR已使用限制性位点Sail和PvuII将其线性化。所获质粒为5500-pUC-DHFR—dLNGFR—野生型SV40(图1中的质粒图)，5501-pUC-DHFR—dLNGFR—缩短—2(图2中的质粒图)，5502-pUCDHFR—dLNGFR—缩短一3，5503-pUC-DHFR—dLNGFR—缩短_4，5504-pUC-DHFR—dLNGFR缩短6。已用这些质粒转染HEK293EBNA细胞并瞬时表达编码的多肽。48小时后已经FACS验证dLNGFR的表达。对于测定不同启动子的启动子强度(表达强度)，经抗dLNGFR抗体对表达的表面标记dLNGFR进行焚光标记。对于每一测定，已通过每6孑L(GIBCOInvitrogen，Karlsruhe，德国)加入1mlAccutase⑧将约0.5乂106至l.OxlO6个细胞分离。将分离后的细胞转移至小瓶中并用添加有10%(v/v)胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次。随后通过离心(1,500转/分钟，5分钟)将细胞沉淀下来并去除上清。以下所有步骤在0至2"C的冰浴上或冰浴中进行。用100fil含30將/ml抗dLNGFR抗体的溶液将细胞沉淀重悬。30分钟的温育周期后，通过加入2ml水冷的RPMI1640培养基稀释样品并随后通过离心进行沉淀。在100pL浓度为20照/ml的二抗溶液中将沉淀重悬，所述二抗为与Phycoerythrin缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(CaltagLaboratories,Burlingame，CA，美国)。黑暗中水上温育样品30分钟。经洗涂和离心步骤之后在500jal培养基中将样品重悬并置于黑暗中水上保存直至测定。使用FACSCalibur软件(CellQuestPro)评估FACS分析。结果显示于图6中。FACS分析的结果23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>可见从质粒5504表达的标记dLNGFR的平均荧光强度显示出约85%下降的显著表达下降。实施例6有效连接SEQIDNO:02、03、04和06的GFP的表达获得核酸SEQIDNO:02、03、04和06所用的引物包含限制性内切酶Sail和EcoRI的限制性位点。使用这些限制性位点/限制性内切酶已将有效连接编码GFP(SEQIDNO:07)的核酸的这些核酸连接至质粒4703-pUC-OriP上(图3)，该质粒4703-pUC-OriP已使用限制性位点Sail和PvuII将其线性化。所获质粒为4712-pUC-Hyg—GFP—野生型SV40(图4中的质粒图)，4713-pUC-Hyg—GFP—缩短—2(图5中的质粒图)，4714-pUCHyg—GFP—缩短—3，4715-pUC-Hyg—GFP—缩短_4，4716-pUC-Hyg—GFP—缩短_6。对于每一测定，已通过每6孑L(GIBCOInvitrogen，Karlsruhe,德国)中加入1mlAccutase⑧将约5xl(^至lxl(^个细胞分离。将分离后的细胞转移至小瓶中并在3ml添加有10%(v/v)胎牛血清的RPMI1640培养基中重悬。随后通过离心(1,500转/分钟，5分钟)将细胞沉淀下来并去除上清。在500pl培养基中将细胞沉淀重悬。为了区分活细胞与死细胞，加入1pi碘化丙咬。在FACS测定前短暂重悬细胞。使用FACSCalibur软件(CellQuestPro)评估FACS分析。结果显示于图7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>可见从质粒4714或质粒4715表达的GFP的平均荧光强度分别显示出约为50%下降和75%下降的显著表达下降。质粒4716中未发现GFP可检测到的表达。权利要求1.启动子，其具有核酸序列SEQIDNO04。2.核酸，其特征在于其由核酸SEQIDNO:04组成；并且当有效连接核酸SEQIDNO:07时，具有SV40启动子SEQIDNO:05的20%或更低的启动子强度。3.根据权利要求2的核酸，其特征在于所述核酸包含核酸SEQIDNO:04之前的核酸SEQIDNO:14。4.根据权利要求2的核酸，其特征在于其包含猴病毒40启动子SEQIDNO:14的笫二个72bp重复。5.根据权利要求2-4中任一项的核酸，其特征在于所述核酸中SV40启动子的第一个72bp重复缺失而该SV40启动子的笫二个72bp重复保留。6.用于选择细胞的方法，其特征在于其包括以下步骤a)用核酸转染真核细胞，所述核酸包含i)包含编码异源多肽的核酸的第一个表达盒，ii)包含第一个核酸SEQIDNO:04和编码选择性标记的第二个核酸的第二个表达盒，由此所述第一个核酸与第二个核酸有效连接，b)在适合于所述非转染细胞生长的条件下培养所述转染细胞，c)在选择性培养条件下选择步骤b)中繁殖的细胞。7.根据权利要求6的方法，其特征在于所述方法的步骤c)是在选择性培养^H牛下选择步骤b)中繁殖的细胞。8.根据权利要求6的方法，其特征在于所述方法的步骤c)是选择步骤b)中繁殖的细胞并表达所述笫二个核酸编码的选择性标记。9.用于表达异源多肽的方法，其特征在于其包括以下步骤a)用包含表达盒的核酸转染真核细胞，所*达盒包含有效连接第二个核酸的笫一个核酸SEQIDNO:04,所述第二个核酸编码异源多肽，b)选择步骤a)中转染的细胞，c)在适合于所迷异源多肽表达的条件下培养步骤b)中的所选细胞，d)从所述细胞或培养基中回收所述异源多肽。10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述核酸包含编码选择性标记的第二个表达盒。11.根据权利要求6-10中任一项的方法，其特征在于所述真核细胞是哺乳动物细胞。12.根据权利要求ll的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或Per.C6⑧细胞。13，根据权利要求12的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。14.根据权利要求6-13中任一项的方法，其特征在于所述异源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。15.根据权利要求6-8和10-14中任一项的方法，其特征在于所述选择性标记是新霉素-氨基糖苷磷酸转移酶，或潮霉素-磷酸转移酶，或dLNGFR，或GFP。16.根据权利要求9-14中任一项的方法，其特征在于所述第一个核酸是根据权利要求2的核酸。17.根据权利要求16的方法，其特征在于所述第一个核酸仅含有野生型SV40启动子的第二个72bp重复。18.用于表达异源多肽的方法，其特征在于其包括i)有效连接编码选择性标记的核酸的核酸SEQIDNO:04，其含有野生型SV40启动子的第二个72bp重复，ii)核酸SEQIDNO:05或有效连接编码异源多肽的核酸的CMV启动子，iii)CHO细胞或HEK细胞，iv)用i)和ii)的核酸转染iii)中所述的细胞，v)在选择剂存在下选择iv)中转染的细胞，vi)在v)所用选择剂缺失的情况下，在适合于表达所述异源多肽的条件下培养V)中所述的所选细胞，vii)从培养基或细胞中回收所述异源多肽。19.根据权利要求6-18中任一项的方法，其特征在于通过选自流式细胞术、ELISA、免疫沉淀、免疫亲和柱层析、磁珠免疫亲和分选、基于显微镜的分离方法或免疫结合的方法进行所述选择。全文摘要本发明报道了具有核酸序列SEQIDNO02，或SEQIDNO03，或SEQIDNO04，或SEQIDNO06的启动子，其为启动子强度降低的5’缩短的SV40启动子，其尤其用于异源多肽或选择性标记的有限表达。文档编号C12N15/85GK101688222SQ200880022641公开日2010年3月31日申请日期2008年6月25日优先权日2007年6月29日发明者C·克莱因,E·科佩茨基申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司