重型血友病afⅷ基因内含子22重组基因型检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物与新医药技术领域，具体地说是一种在临床样本中检测重型血友 病A FM基因内含子22重组基因型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 1、关于血友病A
[0003] 血友病A化emopMlia A，HA)是最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，其病因是 由于凝血因子VDKcoagulation factorVDI ,FVni)基因缺陷而导致FVDI含量不足或功能缺陷， 从而引起凝血功能障碍。HA的人群患病率无种族和地区差异，有较高的基因自发突变率，约 30%的患者无家族史。HA是X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带，在男性人群中的发病率约 为1/5000,女性患者罕见。临床上根据患者FVDI促凝活性(FVDI coagulant activity FVni:C) 及症状严重程度将其分为重型、中型、轻型，比例分别为50%、10%和40%。重型HA患者关 节、肌肉等部位常会自发性出血不止，而中型与轻型HA患者一般是在创伤或手术后出血不 止，反复多次关节出血可导致患者致残，甚至危及生命。
[0004] 目前本病尚无根治方法，只能W凝血因子Μ相关制品替代治疗，给家庭带来了沉 重的经济负担和屯、理负担。因此，开展ΗΑ的携带者检测和产前诊断、阻止血友病A患儿及携 带者的出生是当前防治该病最有效的措施，具有重要的应用价值和社会效益。
[0005] 2、关于血友病A FM基因内含子22重组基因型
[0006] FVIII基因全长18化b，位于X染色体长臂远端(Xq28)，含有26个外显子和25个内含 子，编码2351个氨基酸。X染色体包含3个内含子22同源序列（intron 22 repeat homologous region，int2化），int2化-1位于FM基因内含子22内，大小为9.f5kb，在FM基因 端粒端0.4Mb和0.5Mb处有2个同源拷贝，包括int2化-2和int2化-3,序列分析相似度达 99.9%。111122}1-2与11112化-3方向相反，形成中屯、长为67.3化、两臂50.5邮的回文结构， int2化序列位于两臂内部，开始于中央环末端66化P处。int22h-2与int2化-3发生染色体内 重组，导致回文结构内部片段倒位，int22h-2与int2化-3交换位置，方向相反。因为int2化- 2与int2化-3在回文结构中空间距离比较近，二者之间的重组更容易发生。运种int2化-2与 int2化-3位置互换的重组并不致病，为Xq28区域的多态性，包括int2化-3与int2化-1反向 的hl-2-3和int2化-2与int2化-1反向的hl-3-2两种。
[0007] Lakich和化ylor于1993年最早发现约半数的重型HA患者是由F8基因内含子22倒 位（Int;ron22 inversion, Inv22)引起的。后来被证实是FVDI基因内int2化-1与同一染色体 内相反方向的int2化-3或int2化-2之间的重组产生内含子22倒位（Inv22)Jnv22导致FM 基因断裂成两部分，外显子1-22转移至基因上游，而外显子23-26仍位于原处，导致两部分 在转录翻译的过程中不能剪接到一起，从而引起重型HA"int22h-l与int2化-3发生的倒位 称为I型内含子22倒位（Inv22-I)，在内含子22倒位中约占84%，int2化-1与int2化-2发生 的倒位称为II型内含子22倒位(Inv22-II)，约占16%。
[000引 FVDI基因内int2化-1与同一染色体内、同源染色体间或染色单体间相同方向 int2化之间的重组导致运两个序列中间区域0.5Mb的缺失和复制，分别称为FM基因内含子 22缺失（Int;ron22deletion，Del22)和FVDI基因内含子22复制（Int;ron22d叩1 ication， 0啡22)。11^22仅仅发生于同一染色体内方向相反的11112化-3化1-2-3)或11112化-2化1-3- 2)与int2化-1之间的重组。Del22可W发生FM基因内int2化-1与同一染色体内、同源染色 体间或染色单体间相同方向的int2化-2化1-2-3)或int2化-3化1-3-2)之间的重组，Dup22 仅仅发生于染色单体或同源染色体之间方向相同的int2化-2化1-2-3)或int2化-3化1-3- 2)与int2化-1之间的重组。Dup22自然发生的几率应低于Del22,但是如果Dup22引起的症状 较Del22轻微，亦可在人群中获得较Del22及Inv22更高的F8基因内含子22重组基因型频率。 正如在Inv22-I型和II型所观察到的，由染色体hl-3-2结构中int2化-3与int2化-1之间的 重组导致的缺失或复制为Del22-I型或Dup-I型，int22h-2化1-2-3)与int2化-1之间重组引 起的复制或缺失为Del22-II型或Dup-II型，前者的基因频率预计为后者的4倍。
[0009] 目前文献已报道的Dup22女性携带者、Dup22男性患者及Del22女性携带者病例均 不能证明Dup22或Del22为血友病A的致病突变或与血友病A的临床表型有关。Dup22或Del22 包括0.5Mb的基因组DNA复制或缺失，该段基因包含大量基因，Dup22或Del22都可W引起其 他相应的症状。根据文献报道分析表明：Dup22女性携带者和男性患者虽然设及FM基因外 显子1~22片段的复制，但仍有一个完整FM基因，目前没有因 Dup22导致血友病A的临床表 现和出血症状的病例报道;Del22女性携带者带有FM基因 Del22的X染色体非随机失活，FM :C水平正常，无血友病A的临床表现和出血症状，并伴有反复自发性流产；目前仍无 De 122男 性患者病例的确切报道，推测因 X染色体包含大量基因的0.5Mb片段的缺失，Del22男性应是 胚胎致死，因而不可能有Del22男性患者出生。
[0010] Dup22或Del22影响了 int2化序列及临近区域，使得Inv22的检测变得复杂，可W导 致Inv22检测出现错误。因此，在进行重型血友病A Inv22基因检测时应该充分考虑到Dup22 或Del22的存在，检测并区分与HA无关的内含子22重组基因型Dup22或Del22,避免Inv22误 检，提高重型HA的分子诊断水平。
[0011] 3、现有重型血友病A FM基因内含子22重组基因型临床检测技术 [001^ (1)现有重型血友病A FVDI基因内含子22重组基因型临床检测产品
[0013]目前血友病A规范化诊断已建立了包括临床诊断、家系调查、实验检测等系列技术 平台。实验检测分为基因诊断和非基因诊断。目前市场上血友病A诊断产品大多为非基因诊 断，包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)、血浆FVIII :CW及FVHI抗 原检测等。运些产品可W对HA进行确诊，但无法检测HA患者的基因突变类型，更无法进行携 带者检测和产前诊断。目前我国能够应用于临床的血友病A基因诊断试剂仅有亚能生物技 术(深圳）有限公司开发的"重型血友病A FM基因内含子22倒位基因检测试剂盒化D-PCR 法），国械注准2015340166Γ-个。该试剂盒主要采用LD-PCR的技术原理进行检测，即在待 检的倒位基因片段两端设计特异引物进行扩增，再通过琼脂糖电泳法进行分析，根据片段 大小判断检测样品是否存在基因倒位。产品可用于体外定性检测人类全血样本中的X染色 体上FM基因内含子22倒位，能够检出倒位患者（简称I)、倒位携带者（简称C)和正常（简称 W)S种基因型。主要缺点：该试剂盒对于Inv22患者及携带者不区分I型内含子22倒位 (Inv22-I)和II型内含子22倒位（Inv22-II)，而且不可检测并区分与HA无关的内含子22重 组基因型Dup22或Del22,可能导致Inv22检测出现错误。
[0014] (2)现有重型血友病A FM基因内含子22重组基因型检测文献
[0015] 对于FM基因内含子22重组基因型Inv22的检测，最早的文献报道采用的方法是 Southern blot,该方法可W准确检测内含子22倒位，能够区分Inv22-I和Inv22-II，并可检 ilDup22或Del22,但操作繁琐，周期长，DNA用量大。随着分子生物学技术的发展，此陕速聚 合酶链反应(PCR)为基础的方法应运而生并逐步取代了Southern blot,不断有新的技术应 用到重型血友病A FM基因内含子22倒位检测。FM基因内含子22倒位的检测方法包括 Southern blot、LD-PCR(long-distance polymerase chain reaction，LD-PCR)与改良后 的LD-PCR(Discriminant LD-PCR)、反向PCR(inverse shifting-polymerase chain reaction, IS-PCR)与改良后的IS-PCR(Disc;riminant IS-PCR)。
[0016] Lakich和化ylor最早于1993年发现约半数的重型HA患者是由FM基因内含子22倒 位引起的，对该倒位的检测方法采用的是Southern blot。该方法可W准确检测内含子22倒 位，并能够区分Inv22-I和Inv22-II，并可检测Dup22或Del22,但操作繁琐，周期长。刘强、文IJ 敬忠等于1998年首次提出应用LD-PCR检测FM基因内含子22倒位。该方法根据长达10-。此 的扩增产物来电泳检测Inv22。此方法操作简单，周期短，但是扩增难度很大，模板质量要求 高，难W稳定检出，限制了其在基因诊断中的应用。Rossetti等于2005年在国际上首次提出 应用IS-PCR对FM基因内含子22倒位进行检测。该方法利用限制性内切酶Bell消化基因组 DNA(曲NA)，然后采用T4连接酶将酶切片段连接成"B-rings"，最后W "Brings"为模板进行 PCR，并凝胶电泳分析结果。LD-PCR和I-PCR不能区分Inv22-I型和Inv22-II型，更重要的是 也不能区分FM基因内含子22重组基因型Inv22与Del22或D叫22,可能把D叫22携带者、 Del22携带者和Dup22患者误检为Inv22携带者，Del22患者误检为Inv22患者。
[0017] 在2006和2008年，Bagnall等和Rossetti等分别将LD-PCR和IS-PCR进行优化和改 良，克服了 LD-PCR和IS-PCR不能区分Inv22-I和Inv22-II，也不能检测并