启动子的制作方法

专利名称：启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子，包括含有该启动子的结构和表达载体，以及含有该启动子的转化细胞。另外，本发明涉及含有该启动子的植物细胞以及植物。
背景技术：
在植物的生命周期中，植物基因的表达是以一种复杂方式控制的。有若干过程与基因表达的调控相关。其主要步骤有转录的启动；转录的终止；转录物的加工；将mRNA转运到核糖体上；以及翻译。
在Huang等(1996，生物科学生物技术生物化学60(2)233-239)的文章中披露了被表达的植物基因的三种例子，该作者报导了三个水稻蔗糖合成酶同源基因，这三个基因被称为RSus1、RSus2和RSus3。该作者还报导了这些基因表达的差异性调控。该作者指出，RSus2和RSus3的基因组构形式相同。
控制基因表达的一个主要过程是转录的启动。转录是通过RNA聚合酶与若干转录因子一起结合在启动子区上而启动的。启动子上的特殊的调控DNA序列(顺式作用因子)起着这些转录因子结合位点(反式作用因子)的作用。
存在于植物基因启动子上的顺式因子可以分成两类。第一类包括与转录启动相关的顺式因子。TATA框和CAAT框是参与转录启动的邻近的顺式因子的例子。CAAT框限定RNA聚合酶的结合位点，而TATA框将RNA聚合酶引导到正确的转录起始位点。多个CAAT框的存在，通常表示它是一种组成型启动子。在原核生物和真核生物之间，TATA和CAAT框是保守的，但对于植物基因启动子的作用来说并不是必需的。第二类启动子包括参与基因表达的时间和空间调控的顺式因子。编码种子储存蛋白(Glutamins、豆球蛋白、谷醇溶蛋白等)的基因是时间和空间调控基因的例子，因此这些基因是以组织专一性和发育方式表达的。胚乳专一性顺式因子的例子有AACA基序和胚乳框。造成胚乳储存蛋白基因以组织专一性和发育方式表达的上述顺式因子，在多种种子储存蛋白基因之间是保守的。
转录因子以复杂方式作用于特定顺式因子的方式，决定了基因在多大程度上是以组成形式表达的，或者是在发育期间的特定时间表达。另外，上述相互作用决定发生在诸如胚乳的特定组织中的表达是否表现在诸如种子的若干组织上，或者为植株所有部分所共有。有多种反式作用因子能够识别所述顺式因子共有序列的变体，并进行竞争结合，从而产生复杂的表达形式。每一种植物基因启动子都有一套转录因子和其他的反式作用因子，这些因子与启动子序列和RNA聚合酶相互作用，从而以独特方式调控基因表达。
众所周知的是，需要在诸如植物的生物的特定组织中指导感兴趣的核苷酸序列(NOI)表达。NOI通常编码一种感兴趣的产物(POI)。例如，有可能需要生产具有优化的氨基酸组成的作物蛋白产品，以便提高该作物的营养价值。甚至有可能需要利用作物来表达诸如编码哺乳动物产物基因的非植物基因。后一种产物的例子包括干扰素、胰岛素、血液因子和纤溶酶原激活物。
不过，尽管有可能需要在特定组织中实现NOI的表达，但有时确保NOI不在其他组织中以会产生有害作用的方式表达是重要的(如果不是必需的话)。而且，重要的是不将有关生物的正常代谢上调到会产生有害作用的程度。例如，植物叶片或芽中正常代谢的紊乱有可能导致植物的矮化生长。
利用植物启动子导致一种NOI在植物组织中表达的一个例子可以参见CA-A-2006454，该文献披露了一种表达框的DNA序列，其中，存在马铃薯块茎专一性调控区，该表达框含有一个patatin基因和一个patatin基因启动子。用农杆菌将该DNA序列转入植物基因组。根据CA-A-2006454，该DNA序列能够在作物中制备异源产物。
不过，在植物转化过程中，转化和再生通常都是低效率的，这严重减缓了载体的开发，因为它们限制了可以测试的遗传结构的数量。研究不同转录启动子的强度和组织专一性，可以极大地影响遗传操作的效果，如果是在稳定转化体上进行的话，其劳动强度是无法控制的。这导致了使用强的组成型启动子的倾向，这种启动子不以组织专一性形式指导在稳定转化体中进行转基因表达，例如，来自病毒(花椰菜花叶病毒35S启动子)和农杆菌属(胭脂氨酸合成酶启动子(NOS))。在尝试通过反义转录降低基因表达时，出现了该方法的并非最不重要的有问题的因素，因为无目的的抑制所有组织中的基因表达，可能导致非目标组织的发育延缓，或者削弱转化体。在这种情况下，只有那些遗传结构仅微弱抑制基因表达的转化体在筛选中才有希望存活。对使用组织专一性转录启动子指导反义转录的需求很大。不过，在很多作物物种上，由于转化和再生的低效率，要赋予稳定转化体这样的启动子并不容易。
尽管事实上在本领域中已经存在某些启动子，但仍然需要更多的启动子，特别是在其进行NIO表达的能力方面具有高效和/或选择性的启动子。
因此，本发明试图提供一种能够导致NOI表达(转录)的启动子。
更具体地讲，本发明试图提供一种能够指导感兴趣的核苷酸序列在特定组织中，或者是在一种生物，通常是植物的一种特定组织中表达(转录)的启动子。本发明总的特征本发明的方面在权利要求书和下面的说明中提供。
简单地说，本发明的某些方面涉及1.一种能够选择性表达的新型启动子。
2.新型启动子核苷酸序列。
3.含有所述启动子的表达系统。
4.用所述启动子表达的方法。
5.含有所述启动子的转化宿主/宿主细胞。
在本发明中所使用的术语“表达”(expression、expresses、expressed和expressable)和相应的术语“转录”(transcription、transcribes、transcribed和transcribable)是同义词。因此，如果NOI是编码序列的话，那么其表达产物还可以被称为转录产物，反之亦然。类似的，如果NOI是反义核苷酸序列的话，那么其转录产物还可以被称为表达产物，反之亦然。
在以下说明中所提到的“本发明的核苷酸序列”包括“本发明的启动子”的含义，反之亦然。另外，术语“本发明的核苷酸序列”与“本发明的多核苷酸序列”是同义词。
有关本发明启动子和/或核苷酸序列的其他方面包括含有本发明序列的结构；含有本发明序列的载体；含有本发明序列的质粒；含有本发明序列的转化细胞；含有本发明序列的转化组织；含有本发明序列的转化过的器官；含有本发明序列的转化过的宿主；含有本发明序列的转化过的生物。本发明还包括用所述启动子表达NOIs的方法，如在宿主植物细胞中表达；包括转移所述启动子的方法。
为方便起见，本发明的启动子有时被称作RSus3启动子(或者甚至是RSus3启动子或者甚至是RSus3启动子)，不过，必须指出的是，本发明的启动子在Huang等(同上)的文献中并没有披露。而且，与该作者的说法相反，我们发现RSus3启动子与RSus2启动子完全不同(该作者认为(RSus2和RSus3的基因组构形式相同))。
就此而言，我们发现了RSus3启动子和RSus2启动子之间以及RSus2启动子和RSus1启动子之间的低度的同源性(即相同性)，如下面的表格所示。
RSus1、RSus2、RSus3的同源性得分
1同源性评分基于多重排比(翻译起始密码子上游的所有启动子区包括以下内含子RSus1(2663bp)、RSus2(2900bp)、RSus3(2667bp))。
2同源性评分基于多重排比(在切除内含子1之后的RSus1、RSus2、RSus3)。
在上表中所提供的同源性得分证实了RSus1、RSus2、RSus3的启动子区之间的低度的相似性。
百分同源性是用DNASISTM(日立软件)中的多重排比特征计算的，该软件是类似于CLUSTAL的一种程序(Higgins DG&Sharp PM(1988)，基因73(1)237-244)。
另外，对RSus3启动子和RSus1启动子和RSus2启动子的序列所作的序列分析的结果是，我们发现除了保守的TATA框和内含子剪接位点之外，它们没有共同的基序。
因此，与以前的介绍不同，我们发现RSus2和RSus3的基因组构不同。
为了便于阅读，本发明的方面将在下面的合适的小节标题下面讨论。不过，每一部分下面的内容并不一定局限于每一个特定的部分。本发明的详细方面根据本发明的第一方面，提供了一种具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其变体、同源物、片段或衍生物的启动子。
换句话说，本发明提供了一种选自下面一组的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1所示核苷酸序列；(b)作为SEQ ID NO1所示核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的核苷酸序列；(c)作为SEQ ID NO1所示核苷酸序列的互补体的核苷酸序列；(d)作为SEQ ID NO1所示核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的互补体的核苷酸序列；(e)能够与SEQ ID NO1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(f)能够与SEQ ID NO1所示核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段杂交的核苷酸序列；(g)作为能够与SEQ ID NO1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列的互补体的核苷酸序列；(h)作为能够与SEQ ID NO1所示核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段杂交的核苷酸序列的互补体的核苷酸序列；(i)能够与SEQ ID NO1所示核苷酸序列的互补体杂交的核苷酸序列；(j)能够与SEQ ID NO1所示核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的互补体杂交的核苷酸序列；(k)含有(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)和/或(j)中的任一种的核苷酸序列。
在一个优选方面，所述启动子可以从稻属植物，优选从水稻中获得(尽管实际上并不是必须从这些植物中获得)。
本发明的另一方面包括本发明的分离的核苷酸序列。
本发明的另一方面包括将所述启动子用于在体外(例如，在诸如培养液的培养基中(和/或体内)(例如，在转化的生物中)表达NOI。
在一个高度优选的方面，本发明提供了一种在胚乳中表达NOI的方法(优选在胚乳中进行选择性表达)，该方法包括在NOI可操作地连接于本发明的启动子上的情况下表达该NOI。
本文所使用的术语“选择的”和“选择性的”分别与术语“专一的”和“专一性的”是同义词。就此而言，由本发明启动子在胚乳层中进行的选择性的或专一的表达意味着相对其他组织类型或细胞而言，在胚乳中进行的表达水平较高。
在某些场合下，NOI以高的选择性在胚乳中表达。在这一方面，由本发明启动子在胚乳中进行的高选择性或专一性表达意味着相对其他组织类型或细胞而言，在胚乳中进行的表达占据优势，并且在某些场合下，几乎只能在胚乳层中表达。
转化宿主/宿主细胞优选为植物/植物细胞。
植物可以是任何合适的单子叶植物(如玉米)和任何合适的双子叶植物(如大豆或瓜尔豆)。
所述植物优选为胚乳类禾本科植物或豆科植物。
在一个优选方面，所述植物是禾本科植物的一员-如小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦或水稻中的任一种。
在另一个优选方面，所述植物是豆类-如瓜尔豆或角豆中的任一种。
因此，转化的宿主优选是禾本科(有可能被称为Poaceae)或豆科(它可以被称作Fabaceae)分类类型的转化过的成员或其细胞或组织。
因此，转化的植物优选是转化过的禾本科或转化过的豆科植物。
另外，转化过的植物细胞优选是转化过的禾本科植物细胞或转化过的豆科植物细胞。
本发明由于多种原因而具有优越性。
举例来说，本发明的优点体现在可以获得NOI表达产物的理想的水平。在这里，NOI表达产物举例来说，可以是对人类或动物有益的理想化合物，例如具有有益效果的理想的饲料或酶，所述有益效果如饲料加工效果或药用效果。另外，所述产品可以是容易回收的。
另外，NOI表达产物可以影响有关宿主的代谢。在某些场合下，NOI表达产物可以是宿主代谢所必需的成分。在这种情况下，从宿主中回收POI是不重要的。在某些场合下，不从宿主中回收POI可能是重要的。
本发明的优点还体现在它能让转化的植物或植物细胞表达理想水平的NOI表达产物。
本发明的优点还在于，它能够使转化的植物或植物细胞在特定组织或细胞类型中表达理想水平的NOI表达产物。
本发明启动子的优点还在于，它能在植物细胞中在瞬时表达条件下提供NOI的良好的表达水平。
在一个优选方面，所述启动子连接于SEQ ID NO2所示核苷酸序列或其变体、同源物、衍生物或片段上。术语“连接”包括直接或间接(如通过提供合适的间隔序列)连接。
SEQ ID NO2所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段优选位于本发明的启动子或NOI之间。
在这一方面，我们发现在诸如转化过的植物(如转化过的瓜尔豆)的某些转化过的宿主中，NOI的表达水平可以提高。如果需要这种较高的表达的话这种作用是重要的。
所述启动子可以与一种或多种其他表达因子同时使用-这些因子还可以被称为“功能性因子”。上述其他的表达因子可以连接于本发明的启动子上。术语“连接”包括直接或间接连接(如通过提供合适的间隔序列)连接。
所述其他表达因子可以增强表达或抑制不希望的表达。
所述其他表达因子甚至可以是启动子，其中，该启动子可以与本发明的启动子相同或不同，甚至可以是本发明启动子的一部分。
本发明还包括启动子的重复单位(如包括至少两个启动子因子的串联重复-其中的一个是本发明的启动子-如三个启动子因子)。
所述其他表达因子优选位于本发明启动子和NOI之间。如果需要的话，本发明的其他表达因子和启动子可以由合适的限制位点分离。
在这一方面，我们发现在诸如转化过的植物(如转化过的瓜尔豆)的某些转化过的宿主中，NOI的表达水平可以提高。如果需要这种较高的表达的话这种作用是重要的。
在一个方面，NOI是反义核苷酸序列。
在这一方面，NOI优选是与编码差向异构酶，特别是UDP半乳糖差向异构酶，更优选是UDP半乳糖-4-差向异构酶(EC5.1.3.3)的基因的全部或部分反义的序列。
如果NOI是编码UDP半乳糖差向异构酶-更优选是UDP半乳糖-4-差向异构酶(EC5.1.3.3)的基因的全部或部分的反义序列的话-由本发明启动子所启动的该反义序列的表达可以影响半乳糖甘露聚糖或其他胞外多糖上的半乳糖单位(如，导致其减少)。
在另一方面，NOI是正义核苷酸序列。
在这里，NOI可以是构成编码UDP半乳糖差向异构酶，更优选是UDP半乳糖-4-差向异构酶(EC5.1.3.3)的基因的全部或部分的序列。启动子因此，本发明涉及一种新型调控序列，即启动子——我们称之为RSus3启动子。
术语“启动子”以本领域的普通含义使用，例如，RNA聚合酶结合位点。
所述启动子可以与天然存在的形式相同——对这一方面来说所述启动子不存在于其天然环境中。另外，或者在另一种情况下，启动子是分离和/或纯化的形式。本发明的启动子可以是天然存在的启动子的变体、同源物、片段或衍生物。所述启动子可以从天然的或非天然的任何合适的来源获得或用所述来源生产，或者可以是合成的、半合成的或重组的。
在


图1中示意性地给出了一种含有本发明的启动子和其他相关核苷酸序列的核苷酸序列(不是按比例显示)。在这一方面，启动子序列SEQ ID NO1被显示为框A。如图所示，框A包括两个单位-被示意性地表示为框B和框C。框B相当于SEQ ID NO6，而框C相当于SEQID NO4。SEQ ID NO6是延伸到TATA框的序列。SEQ ID NO4是一个外显子序列的第一部分。
根据本发明，我们发现在缺乏SEQ ID NO4的全部或部分的情况下，用本发明的启动子仍然能在某些宿主细胞中实现表达。在这一方面，本发明的启动子可以表示为SEQ ID NO6，有关SEQ ID NO1的说明同样适用于SEQ ID NO6。
图1中还示出了框D-它相当于SEQ ID NO2。SEQ ID NO2是内含子序列。根据本发明，我们惊奇地发现在缺少SEQ ID NO2的全部或部分的情况下，用本发明的启动子仍然能实现表达。因此，在本发明的一种实施方案中，本发明的启动子不是与SEQ ID NO2的全部或部分组合使用。
不过，在某些场合下，我们惊奇地发现，SEQ ID NO2能提高NOI的表达水平和/或提高该表达的选择性。因此，在本发明的另一种优选实施方案中，本发明的启动子与SEQ ID NO2的全部或部分组合使用。
图1还示出了框E-它相当于SEQ ID NO5。SEQ ID NO5是与序列C相关的外显子序列的第二部分。对于某些用途来说，本发明的启动子序列包含在一种核苷酸序列之内，其中，SEQ ID NO4与SEQ IDNO5融合。
因此，示意性地举例来说，本发明的启动子可以表示为下列一组中的任一种或多种框A；框B；有或没有框C；框A，有框D；框B-有或没有框C-有框D；框A，有框E；框B-有或没有框C-有框E；框A，有框D和框E；框B-有或没有框C-有框D和框E。
应当理解的是框A表示SEQ ID NO1或其变体、同源物、片段或衍生物，框A优选表示SEQ ID NO1；框B表示SEQ ID NO6或其变体、同源物、片段或衍生物，框B优选表示SEQ ID NO6；框C优选表示SEQ ID NO4或其变体、同源物、片段或衍生物，框C优选表示SEQ ID NO4；框D表示SEQ ID NO2或其变体、同源物、片段或衍生物，框D优选表示SEQ ID NO2；框E表示SEQ ID NO5或其变体、同源物、片段或衍生物，框B优选表示SEQ ID NO5。
我们在分析本发明的启动子时鉴定了多个感兴趣的表达因子/功能因子，它类似于共有序列或其部分。
所鉴定的序列在下面的表1中示出。
表1
1.与共有序列的差别用草写体表示。
目前，我们相信所鉴定序列的至少一种或多种，如全部与应当出现在本发明启动子序列上的共有序列相同或相似。
如上文所述，所述启动子还可以包括能确保或加强在合适的宿主中表达的特征或与这些特征一起使用。例如，所述特征可以是保守区，如Pribnow框或TATA框。
所述启动子甚至可以包括能影响(如维持、增强、减弱)本发明核苷酸序列的表达水平的其他序列或者与所述其他序列一起使用。例如，合适的其他序列可以包括Sh1-内含子或ADH内含子。其他序列可以包括诱导型因子-如温度、化学、光或胁迫诱导型因子。另外，还可以存在能增强转录或翻译的合适因子。后一种因子的例子是TMV5’信号序列(参见Sleat，基因217217-225；和Dawson，植物分子生物学2397)。
本发明的启动子可以与一种或多种其他表达因子或功能因子或调控因子组合使用。
术语“表达因子”、“功能性因子”和“调控因子”包括增强子、表达调控信号、分泌前导序列、启动子共有序列、终止序列、甚至可以包括其他启动子。
本发明还包括杂合启动子，它包括本发明启动子的至少一部分以及另一种启动子的至少一部分。
杂合启动子还可用于改善表达结构诱导型调控。
如上文所述，本发明还包括串联启动子，其中，至少一个启动子是本发明的启动子。如果其他启动子是本发明的启动子或其一部分的话，那么其组合就可以被称为串联重复。
所述其他启动子甚至可以是另一个启动子或其一部分。举例来说，所述其他启动子可以根据其指导NOI在需要的表达宿主中表达的效率进行选择。
在一种实施方案中，可以选择组合型启动子，以便指导NOI的表达。所述表达结构可以提供其他优点，因为它可以避免在含有诱导底物的培养基上培养所述表达宿主的必要性。优选用于真菌表达宿主中的强组合型和/或诱导型启动子的例子是那些可以从真菌基因中获得的启动子，如木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亚基9(oliC)、磷酸三糖异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AthA)、α-淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG-来自glaA基因)、乙酰胺(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子。强酵母启动子的例子是可以从编码醇脱氢酶、3-磷酸甘油酯激酶和磷酸三糖异构酶的基因获得的启动子。强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和SP02启动子，以及来自胞外蛋白酶基因的启动子。强植物启动子的例子是CaMV启动子和SV40 35S启动子和NOS启动子。
对某些用途来说，所述启动子优选被稳定整合到转化生物的基因组中。
术语“转化过的”是术语“转基因”的同义词。
在一个优选方面，所述启动子连接于SEQ ID NO2所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段上。天然存在的在本文中，“天然存在的”是指自然存在的启动子序列-即野生型启动子。分离的/纯化的在本文中，术语“分离的”和“纯化的”是指从其天然环境中取出，并且与和它天然结合的至少一种其他成分分离或分开的核酸序列。具有生物学活性的在本文中，“具有生物学活性的”是指本发明的启动子-如重组型启动子-具有与天然存在的启动子类似的结构功能(但不一定有相同的程度)和/或类似的调控功能(但不一定有相同的程度)和/或类似的生化功能(但不一定有相同的程度)。具体地讲，本发明的启动子具有在胚乳中表达NOI的能力，优选在胚乳中选择性地表达。缺失在本文中，“缺失”被定义为核苷酸序列上所发生的缺少一个或多个核苷酸的变化。插入/添加在本文中，“插入”或“添加”是指核苷酸上所发生的相对天然存在的启动子而言导致增加了一个或多个核苷酸的变化。取代在本文中，“取代”是指用一个或多个不同的核苷酸取代一个或多个核苷酸所产生的结果。变体/同源物与本发明核苷酸序列相关的术语“变体”或“同源物”与该序列的等位变异是同义词。
具体地讲，本文所使用的术语“同源性”可能与术语“相同性”等义。在这里，与本发明核苷酸序列相关的序列同源性可以通过对一种或多种所述序列和另一种序列进行简单的“肉眼”比较(即精确比较)确定，以便确定所述其他序列是否与该序列具有至少75％的相同性。相对序列同源性(即序列相同性)还可以用市场上销售的计算机程序测定，该程序能计算两种或两种以上序列之间的百分同源性。所述计算机程序的一个典型例子是CLUSTAL。
序列同源性(或相同性)甚至可以用任何合适的同源性程序，使用诸如预设参数的方法测定。优选采用BLAST程序，使用设定的预设参数值。BLAST程序详细披露在http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast-help.html，有关内容被收作本文参考。检索参数的限定如下，并且优选设定为确定的预设参数。
优选的是，由BLAST所得出的“显著同源性”等于与EXPECT值的吻合值至少为大约7，优选至少大约9，最优选大约10或10以上的序列。BLAST检索中的EXPECT预设阈值通常为10。
BLAST(基础局部排比检索工具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn、和tblastx所采用的启发式检索程序；该程序采用作了一些改良的Karlin和Altschul的统计学方法(参见http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast-help.html)评估其发现的显著性。对BLAST程序进行修改，以便进行序列相似性检索，例如鉴定查询序列的同源物。该程序通常不适用于基序类型的检索。有关序列数据库的相似性检索的基础问题的讨论可以参见Altschul等(1994)自然遗传学6119-129。
在http//www.ncbi.nih.gov上有五种BLAST程序，可以执行以下任务blastp将一个氨基酸查询序列与蛋白序列数据库进行比较。
blastn将一个核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库进行比较。
blastx将核苷酸查询序列(两条链)的6框概念翻译产物与蛋白序列数据库进行比较。
tblastn将蛋白查询序列与以所有6个读框进行动态翻译(两条链)的核苷酸序列数据库进行比较。
tblastx blastp将核苷酸查询序列的6框翻译与核苷酸序列数据库的6框翻译进行比较。
BLAST使用以下检索参数矩形图 表示每一个检索的得分的矩形图；预设值为是(参见BLAST手册中的参数H)。
说明将报导的比较序列的短的说明的数量限制为特定数量；预设极限为100个说明(参见手册页的参数V)。还可以参见预期值和截断值。
排比 将数据库序列限制为报导过高得分片段对(HSPs)的特定数量；预设极限为50；如果多于该数量的数据库序列偶尔满足报导的统计学显著性阈值(参见下面的预期值和截断值)，仅报导具有最大统计学显著性的排比(参见BLAST手册中的参数H)。
预期值报导与数据库序列进行比较的统计学显著性阈值；其预设值为10，按照Karlin和Altschul(1990)的随机模型，这10个匹配预计仅仅是偶然出现的。如果一种比较的统计学显著性大于所述预期的阈值，就不报导该比较。较低的预期阈值更严格，会导致有更少的偶然匹配被报导。分数值是可以接受的(参见BLAST手册中的参数E)。
截断值报导高得分片段对的截断得分。其预设值是由预期值(见上文)计算出来的。数据库序列的HSPs被报导的先决条件是，由它所产生的统计学显著性至少与具有与截断值相等的得分的单独的HSP所产生的显著性一样高。截断值越高越严格，会导致有较少的偶然匹配被报导(参见BLAST手册中的参数S)。通常，用预期值可以更直观地控制显著性阈值。
基质表示BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的另一种评分基质。预设的基质为BLASUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。有效的替代选择包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。BLASTN没有替代的评分基质。规定在BLASTN中运行的基质需要恢复一个误差响应。
链将TBLASTN检索仅仅局限于数据库序列的上链或下链；或将BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索仅仅局限于查询序列的上链或下链上的读框。
过滤器过滤掉查询序列的具有低组成复杂性的片段，组成复杂性是用Wootton & Federhen(1993)的SEG程序(计算机和化学17149-163)测定的；或过滤掉由短的周期性内部重复所组成的片段，这种重复是用Claverie & States(1993)的XNU程序(计算机和化学17191-201)测定的；或者对于BLASTN来说，通过Tatusov和Lipman的DUST程序(参见http//www.ncbi.nih.gov)。过滤能够从blast输出结果中消除统计学上显著的、但生物学上不感兴趣的报导(例如，对常见酸性、碱性或富含脯氨酸区域的选中)，留下查询序列的在生物学上更有意义的区域与数据库序列进行特定比较。
通过过滤器发现的低复杂性序列在核苷酸序列中用字母“N”代替(例如，“NNNNNNNNNNNNN”)，而在蛋白序列中用字母“X”表示(例如，“XXXXXXXXX”)。
过滤仅在查询序列(或其翻译产物)上进行，不对数据库序列进行过滤。BLASTN的预设过滤为DUST，其他程序的预设过滤为SEG。
在用于SWISS-PROT中的序列时，常见的SEG、XNU或二者什么也过滤不掉是常见的，因此，不要希望过滤总是能得到一个结果。另外，在某些情况下，序列被完全过滤掉，这表明在未过滤过的查询序列上所报导的任何匹配的统计学显著性是值得怀疑的。
NCBI-gi导致在输出结果中除了进入和/或局部名称之外，还显示NCBIgi识别器。
序列比较优选使用在http//www.ncbi.nih.gov/BLAST提供的简单的BLAST检索程序进行的。
测定两个序列之间相同性和相似性的其他计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux等1984核酸研究12387)和FASTA(Atschul等1990分子生物学杂志403-410)。
在测定序列相同性时，如果使用缺口补偿的话，优选使用以下参数
最优选的是，序列比较用DNASISTM完成。
在本文中，术语“变体”、“同源物”、 片段”和“衍生物”包括该序列的等位变异。
术语“变体”还包括互补于能够与本文所提供的核苷酸序列杂交的序列的序列。杂交本文所使用的术语“杂交”应当包括“一条核酸链通过碱基配对与一条互补链连接的过程”(Coombs J(1994)生物技术词典，Stockton出版社，纽约)以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中所进行的扩增过程，该技术披露于Dieffenbach CW和GS Dvekler的著作中(1995，PCR引物，试验室手册，冷泉港出版社，Plainview NY)。
杂交条件取决于核酸结合复合体的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel所述(1987，分子克隆技术指南，酶学方法，152卷，学术出版社，San Diego CA)，并产生下文所述的特定的“严格性”。
杂交的严格性是指使多核酸杂合体保持稳定的条件。所述条件为本领域普通技术人员所了解。正如本领域技术人员所了解的，杂合体的稳定性体现在杂合体的解链温度(Tm)上。序列同源物每降低1％，解链温度降低大约1-1.5℃。一般，杂合体的稳定性受钠离子浓度和温度的影响。通常，杂交反应是在较高严格性的条件下进行，然后进行各种严格性的洗涤。
在本文中，高严格性是指仅能使能在1M钠离子中在65-68℃下形成稳定杂合体的核酸序列杂交的条件。
最大严格性通常出现在大约Tm-5℃(低于探针Tm的5℃)。
高严格性通常出现在低于探针Tm的5-10℃。例如，高严格条件可以通过含有6×SSC、5×Denhardt’s、1％SDS(十二烷基硫酸钠)、0.1焦磷酸钠和0.1毫克/毫升变性鲑精DNA作为非特异竞争剂的水溶液中杂交提供。在杂交之后，高严格洗涤可以用若干步骤进行，最后洗涤(大约30分钟)是在杂交温度下在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中进行。
中等或中度严格性通常出现在低于探针Tm的大约10-20℃。
低严格性通常出现在低于探针Tm的大约20-25℃。
正如本领域技术人员所了解的，最严格的杂交可用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严格杂交可用于鉴定或检测相似的或相关的核苷酸序列。
中等严格性是指与在上述溶液中进行的杂交相同的条件，所不同的是温度为大约60-62℃。在这种情况下，最终的洗涤是在杂交温度下在1×SSC、0.1％SDS中进行。
低严格性是指与在上述溶液中进行的杂交相同的条件，所不同的是温度为大约50-52℃。在这种情况下，最终的洗涤是在杂交温度下在2×SSC、0.1％SDS中进行。
应当理解的是，上述条件可以使用诸如基于甲酰胺缓冲液的多种缓冲液和温度进行调整和重复。Denhardt’s和SSC为本领域技术人员所熟知，其他合适的杂交缓冲液也为本领域技术人员所熟知(例如，参见Sambrook等著，1989，分子克隆试验室手册，冷泉港试验室出版社，纽约或Ausubel等著，1990，当代分子生物学方法，JohnWiley&Sons公司)。最佳杂交条件必须评经验确定，因为探针的长度和GC含量也起作用。核苷酸序列本文所使用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变体、同源物、片段和衍生物(如它的一部分)。所述核苷酸序列可以是来源于基因组的或合成的或重组的，它可以是双链的或单链的，可以代表正义链或反义链。
术语“核苷酸序列”优选表示DNA。
在一种优选实施方案中，本发明的核苷酸序列本身不包括存在于其天然环境中的本发明的天然核苷酸序列。在天然环境中，本发明的核苷酸序列连接于同样存在于其天然环境中的其天然结合的序列上。为了便于引用，我们将这一优选的实施方案称为“非天然核苷酸序列”。
通常，本发明的核苷酸序列是用重组DNA技术制备的(即重组DNA)。不过，在本发明的另一种实施方案中，所述核苷酸序列的全部或部分可以是用本领域所熟知的化学方法合成的(参见CaruthersMH等，1980，核酸研究Symp Ser215-223，HornT等，1980，核酸研究Symp Ser225-232)。
本发明还包括互补于本文所提供的序列或其任何衍生物、片段或衍生物的核苷酸序列。如果该序列互补于其片段的话，那么该序列就可以被用作探针鉴定其他生物中的相似序列等。
本发明还包括能够与本文所提供的序列、衍生物或其片段或衍生物杂交的核苷酸序列。
本发明还包括能够与互补于本文所提供的序列或其任何衍生物、片段或衍生物的序列杂交的核苷酸序列。
术语“变体”还包括互补于能够与本文所提供的核苷酸序列杂交的序列的序列。
术语“变体”优选包括互补于能够在严格条件下(例如，65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M氯化钠，0.015柠檬酸钠，pH7.0})与本文所提供的核苷酸序列杂交的序列的序列。
本发明还涉及能与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文所提供序列的互补序列)。
本发明还涉及互补于能够与本发明的核苷酸序列杂交的序列的核苷酸序列(例如，65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M氯化钠，0.015柠檬酸钠，pH7.0})。
本发明还包括能够在中等到最严格的条件下与本文所提供的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在一个优选方面，本发明包括能够在严格条件下(例如65℃和0.1×SSC)与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明优选提供能够在严格条件下与SEQ ID NO1的片段杂交的核酸序列。所述片段的长度优选为15-50个碱基。优选的是，其长度为大约25个碱基。
通过了解本文所述提供的核酸序列，有可能设计出部分和完整长度的核酸序列，如cDNA和/或基因组克隆。通过PCR获得的核酸序列-如完整长度序列的片段，优选具有独特序列的片段-随后可用于通过杂交文库筛选技术获得相同的或相似的序列。所述片段长度可以是10-100个核苷酸。所述片段的长度优选为15-90个核苷酸。所述片段的长度更优选为20-80个核苷酸。
举例来说，可以用放射性原子标记PCR克隆，并用于从其他物种，优选从其他植物物种中筛选基因组文库。杂交条件通常是中等到高严格条件(例如，0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，温度为大约50-大约60℃)。
编码所述氨基酸序列的全部或部分的简并核酸探针也可用于从其他物种，优选其他植物物种或真菌物种中检测cDNA和/或基因组文库。不过，优选首先通过PCR技术获得单一序列，以便用于进一步的筛选过程。
用上述技术所获得的本发明的多核苷酸序列可用于通过上述技术获得其他同源序列和变体。
因此，本发明的多核苷酸可用于生产引物，例如PCR引物，用于其他扩增反应的引物，探针，例如通过常规方法用放射性或非放射性标记标记过的具有识别标记的探针，或可以将所述多核苷酸克隆到载体上。所述引物、探针和其他片段的长度至少为15，优选至少20，例如，至少25、30或40个核苷酸，它们也包括在本发明所使用的术语多核苷酸的范围内。
本发明的多核苷酸或引物可以具有识别标记。合适的标记包括放射性同位素，如32P或35S，酶标记，或其他标记，如生物素或洋地黄毒苷。可以使用DIGTM系统(Boehringer Mannheim)，因为它是一种非常诱人的非放射性系统。该DIGTM系统基于甾醇半抗原洋地黄毒苷，洋地黄毒苷仅存在于洋地黄植物中，因为它避免了在诸如生物素的其他半抗原上所出现过的内源背景问题。所述标记可以添加到本发明的多核苷酸或引物上，并可以通过本身已知的技术检测。
本发明的多核苷酸，如DNA多核苷酸和引物可以通过重组、合成、或本领域技术人员所了解的任何方法生产。还可以用标准技术进行克隆。一般，引物通过合成方法生产，包括每次生产所需核酸序列的一个核苷酸的逐步生产过程。用自动化技术实现这一目的的技术在本领域中是很容易获得的。
较长的多核苷酸通常是用重组方法生产的，例如，使用PCR克隆技术。该技术包括制备一对针对需要克隆的核苷酸序列的一部分的引物(例如大约15-30个核苷酸)，让所述引物与从真菌、植物或原核细胞中获得的mRNA或cDNA接触，在能发生目的片段扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，和回收扩增的DNA。所述引物可以被设计成包括合适的限制酶识别位点，以便扩增的DNA能够克隆到合适的克隆载体上。
可以对本发明的核苷酸序列进行工程操作，以便为了多种目的而改变其活性，这些目的包括，但不限于改变其加工和/或表达的变化。例如，可以用本领域熟知的技术，如定向诱变引入突变，以便插入新的限制位点，改变糖基化方式或改变密码子偏倚性。作为进一步的例子，还可以对本发明的核苷酸序列进行修饰，以便优化在特定宿主细胞中的表达-如包括其他启动子或其部分，以便提供串联重复，和/或提供诸如内含子序列的其他表达因子。为了引入限制酶识别位点，可能需要其他序列改变。启动子核苷酸序列的变体、同源物和片段与本发明核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源物”、或“片段”在该序列上所进行的一个(或多个)核酸的取代、改变、修饰、置换、缺失或添加的任一种，使所得到的核苷酸序列具有作为启动子的能力，优选至少具有与SEQ ID NO1所示序列的启动子相同的生物学活性。具体地讲，术语“同源物”包括针对结构和/或功能的同源性，使所得到的核苷酸序列具有作为启动子的能力。就序列同源性而言，与SEQ ID NO1所示序列的同源性优选为至少75％，更优选为至少85％，更优选为至少90％。与SEQ ID NO1所示序列的同源性更优选为至少95％，更优选为至少98％。
本发明还涉及包括SEQ ID NO1的DNA序列或所述序列的等位变异的DNA片段。所述片段能够起着调控区/单位的作用。SEQ ID NO2的核苷酸序列的变体、同源物和片段与本发明核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源物”、或“片段”在该序列上所进行的一个(或多个)核酸的取代、改变、修饰、置换、缺失或添加的任一种，使所得到的核苷酸序列具有提高表达水平的能力，优选至少具有与SEQ ID NO2具有相同的生物学活性。具体地讲，术语“同源物”包括针对结构和/或功能的同源性，使所得到的核苷酸序列具有提高表达水平的能力。就序列同源性而言，与SEQID NO2所示序列的同源性优选为至少75％，更优选为至少85％，更优选为至少90％。与SEQ ID NO2所示序列的同源性更优选为至少95％，更优选为至少98％。
本发明还涉及包括SEQ ID NO2的DNA序列或所述序列的等位变异的DNA片段。所述片段能够提高表达水平。在表1中所确定的核苷酸序列的任一种或多种的变体、同源物和片段与表1中所列举的任一种核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源物”、或“片段”包括在该序列上所进行的一个(或多个)核酸的取代、改变、修饰、置换、缺失或添加的任一种，使所得到的核苷酸序列具有影响表达的能力。优选至少具有与SEQ ID NO1所示序列的启动子相同的生物学活性。具体地讲，术语“同源物”包括针对结构和/或功能的同源性，使所得到的核苷酸序列具有影响表达的能力。就序列同源性而言，与表1中所示相应序列的同源性优选为至少75％，更优选为至少85％，更优选为至少90％。与表1中所示相应序列的同源性更优选为至少95％，更优选为至少98％。NOI/POI在一个优选方面，本发明涉及用本发明的启动子表达一种或多种合适的NOIs。
因此，在一个优选方面，所述启动子可操作地连接于NOI上。
术语“可操作地连接”是指一种关系-如合适的并列关系-其中，所述成分的关系使得它们能够以预期的方式起作用。“可操作地连接”于NOI上的调控序列是以如下方式连接的，编码序列的表达是在与所述调控序列相容的条件下实现的。
NOI可以编码POI。
除了正常情况下与本发明的启动子结合的完整的天然序列之外(在这种情况下NOI可操作地连接于其天然环境中的启动子上)，NOI可以是编码感兴趣的多肽的任何合适的序列。
NOI优选不包括与本发明的野生型启动子天然结合的核苷酸序列的全部。
NOI可以是任何核苷酸序列，它可以是有关生物-它可以是丝状真菌或植物的外源(异源)或天然(同源)的序列。
通常，POI可以是感兴趣的任何合适的原核或真核异源或同源肽或蛋白。
对某些用途来说，POI可以是分泌的和/或回收的。
对某些用途来说，POI是分泌的和/或回收的是重要的。
对某些用途来说，POI可能不是分泌的和/或回收的。
对某些用途来说，POI可能不是分泌的和/或回收的是重要的。
NOI可以是能够表达核酸的序列，例如，能够调控生物代谢的调控RNA，如反义RNA或核糖酶、mRNA、或tRNA或rRNA。
NOI还可以是业已诱变过的同源核苷酸序列，如通过插入、添加、缺失或改变而进行过诱变，使它不再与天然同源核苷酸序列相同。
POI可以是单链多肽分子，以及多种多链多肽复合体，其中，单独的组成多肽通过共价或非共价方式连接。在这里，术语“多肽”包括具有两个或更多个氨基酸的肽，通常具有5个以上，或10个以上或20个以上氨基酸。
NOI的典型例子包括编码能改变代谢和分解过程的蛋白和酶的序列。所述异源核苷酸序列可以编码能导入或增强病原体抗性的制剂。所述异源核苷酸序列可以是用于改变存在于相关组织中的天然转录物表达的反义结构。
所述异源核苷酸序列可以是能赋予一种食品或作物营养价值的蛋白。典型的例子包括能帮助人类或动物消化、抑制反营养因子形成的植物蛋白，以及具有更理想的氨基酸组成的植物蛋白(例如，与非转基因植物相比具有更高的赖氨酸含量)。
例如，POIs的非限定性例子包括与细胞分裂调控相关的蛋白，例如，生长因子，包括神经营养生长因子、细胞因子(如α-、β-、或-γ-干扰素，白介素，包括IL-1、IL-2，肿瘤坏死因子，或胰岛素样生长因子I或II)，蛋白激酶(如MAP激酶)，蛋白磷酸酶和上述任一种的细胞受体。
POI还可以与细胞代谢途径相关的酶，例如，与糖类生物合成或降解、氨基酸生物合成或降解(如酪氨酸羟化酶，嘌呤或嘧啶生物合成或降解，以及诸如多巴胺的神经递质生物合成或降解相关的酶，或与上述途径调控相关的蛋白，例如，蛋白激酶和磷酸酶。
POI还可以在植物收获加工之后起作用-例如，在酿造或烘烤过程中起作用。
POI还可以是转录因子或与其调控相关的蛋白，例如，Rb家族的穴蛋白，如Rb或p107，膜蛋白，结构蛋白或热激蛋白，如hsp70。
NOI可以编码具有特定核苷酸序列的内含子，其中，该内含子可以呈正义或反义方向。
POIs的非限定性例子包括与淀粉代谢相关的蛋白或酶，与糖原代谢相关的蛋白或酶，乙酰酯酶，氨基肽酶，淀粉酶，阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶，羧基肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，壳多糖酶，凝乳酶，角质酶，脱氧核糖核酸酶，差向异构酶、酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡聚糖酶，葡聚糖裂解酶，内切-β-葡聚糖酶，葡糖淀粉酶，葡萄糖氧化酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，葡糖醛酸酶，半纤维素酶，己糖氧化酶，水解酶，转化酶，异构酶，漆酶，脂酶，裂解酶，甘露糖苷酶，氧化酶，氧化还原酶，果胶酸裂解酶，果胶乙酰酯酶，果胶脱聚合酶，果胶甲基酯酶，果胶分解酶，过氧化物酶，酚氧化酶，植酸酶，聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶，鼠李糖-半乳糖醛酸酶，核糖核酸酶，奇甜蛋白，转移酶，转运蛋白，转谷氨酰胺酶，木聚糖酶，或其组合。NOI甚至可以是这些序列中任一种的反义序列。
NOI可以是编码外切-淀粉酶的核苷酸序列，该内容是PCT专利申请PCTIB99/00649的主题(被收作本文参考)。
NOI可以是编码木聚糖酶的核苷酸序列及其突变体，该内容是英国专利申请GB99078057的主题(被收作本文参考)。
NOI可以是编码阿拉伯糖呋喃糖苷酶的核苷酸序列，该内容是PCT专利申请PCT/EP96/01009的主题(被收作本文参考)。
NOI可以是编码ADP-葡萄糖焦磷酸酶的任何核苷酸序列，该内容是PCT专利申请PCT/EP94/01082的主题(被收作本文参考)。
NOI可以是编码α-葡聚糖裂解酶的任何核苷酸序列，该内容披露于PCT专利申请PCT/EP94/03397(被收作本文参考)。
NOI可以是编码T.lanuginosus淀粉酶的任何序列，该内容披露于PCT专利申请PCT/EP95/02607，被收作本文参考。
NOI可以是编码葡聚糖酶的任何核苷酸序列，该内容披露于PCT专利申请PCT/EP96/01008(被收作本文参考)。
NOI可以是编码UDP-半乳糖差向异构酶的任何核苷酸序，及其反义序列，该内容披露于PCT专利申请WO-A-98/54335中(被收作本文参考)。
NOI可以是来自红藻Chondrus crispus的hox，或来自黑曲霉的lipA。
POI可以是披露于WO-A-97/03574中的PME，或披露于WO-A-94/25575或WO-A-97/31102中的PME，以及披露于上述专利申请中的序列的变体、衍生物或同源物。
POI甚至可以是融合蛋白，例如以便有利于提取和纯化。
融合蛋白配偶体的例子包括麦芽糖结合蛋白，谷胱苷肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。常见的是，还可以在所述融合成分之间包括一个蛋白裂解位点。
POI甚至可以与分泌序列融合。分泌前导序列的例子有源于淀粉葡糖苷酶基因、α-因子基因、α-淀粉酶基因、脂酶A基因、木聚糖酶A基因的前导序列。
其他序列也可以促进分泌或提高分泌的POI的产量。所述序列可以编码伴侣蛋白，例如在英国专利申请9821198.0中所披露的黑曲霉cypB基因的产物。
可以对NOI进行工程操作，以便为了多种目的而改变其活性，包括，但不限于改变其表达产物的加工和/或表达的变化。例如，可以用诸如定向诱变的本领域所熟知的技术引入突变，以便插入新的限制位点，从而改变糖基化方式或改变密码子偏倚性。作为进一步的例子，还可以对NOI进行修饰，以便优化在特定宿主细胞中的表达。为了引入限制酶识别位点，可能需要其他序列改变。
NOI还包括合成的或修饰过的核苷酸。有多种对寡核苷酸的不同类型的修饰为本领域所公知，其中包括磷酸甲酯和硫代磷酸酯主链，在有关分子的3’和/或5’末端添加丫啶或聚赖氨酸链。对于本发明来说，应当理解的是，可以用本领域所有的任何方法修饰NOI。可以进行所述修饰，以便提高NOI的体内活性或生命周期。
还可以对NOI进行修饰，以便增加其细胞内稳定性和半衰期。可行的修饰包括，但不限于添加该分子的5’和/或3’末端的旁侧序列，或在该分子的主链内使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶连键。结构术语“结构”-与诸如“缀合物”“框”和“杂合体”的术语是同义词-包括直接或间接连接于NOI上的本发明的核苷酸序列。间接连接的一个例子是在启动子和NOI之间提供合适的间隔基团，如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合”的情况也是如此，它包括直接或间接连接。在每一种情况下，该术语不包括在其天然环境中野生型基因启动子及其相关的核苷酸序列的天然组合。
所述结构甚至可以包括或表达一种标记，该标记使得能够在诸如转入了该结构的植物细胞中选择该遗传结构。
所述选择标记可以存在于其他载体上，或者可以包括在含有该表达系统的核酸分子内。所述选择标记的性质取决于宿主的性质和培养条件。最适用于工业化微生物的选择系统是在宿主生物中不需要突变的一类选择标记。
US-A-5358864提供了一部分可用于本发明中的合适的选择标记-其例子包括真菌选择标记，如编码乙酰胺酶(amdS)、ATP合成酶、亚基9(oliC)和benomyl抗性(benA)的基因。
非真菌选择标记的例子有编码β-葡糖醛酸酶(GUS)的细菌G418抗性基因(该基因可用于酵母中，但不能用于真菌中)，氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)、新霉素(芽孢杆菌属)和大肠杆菌uidA基因。
在本发明的某些方面，可以优选使用ble标记-它能产生对phleomycin/博来霉素/zeocin的抗性。不过，可以使用本领域公知的其他选择标记。营养缺陷型标记的例子有选择尿苷原氧型的pyrG，选择精氨酸原氧型的argB，选择硝酸原氧型的niaD，选择色氨酸原氧型的typC，选择加强利用乙酰胺作为唯一氮源的amdS。可以选择显性抗性标记，由oliC3产生对寡聚霉素的抗性，由hph产生对潮霉素B的抗性，由BAR产生对bialaphos的抗性或由NPTII产生对G418的抗性。
所述结构甚至可以包括或表达一种标记，该标记的表达使得能够在诸如转入了该结构的细菌，优选芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌，或植物，如马铃薯、甜菜等中选择该遗传结构。
所述结构甚至可以包括或表达使得能够在诸如植物的生物中选择该遗传结构的标记。存在可以使用的各种标记，如编码甘露糖6-磷酸异构酶、葡糖胺6-磷酸脱氨酶/酮异构酶、木糖异构酶的标记，或能产生抗生素抗性的标记-例如，对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。载体术语“载体”包括表达载体、可复制的载体、转化载体和穿梭载体，包括它们的载体组合。
术语“表达载体”表示能够进行体内或体外表达的结构。
所述表达载体优选整合到有关生物的基因组中。术语“整合”优选包括稳定整合到基因组中。
本发明的载体优选包括本发明的结构。换句话说，本发明的启动子优选存在于一种启动子上，其中，该启动子可操作地连接于NOI上，使得该启动子能够提供由合适的宿主生物所进行的编码序列的表达，即该载体是表达载体。
术语“转化载体”表示能够从一个实体转移到另一个实体中的结构-所述实体可以是同一物种或不同物种。如果该结构能够从一个物种转移到另一个物种中的话-从大肠杆菌质粒转移到诸如芽孢杆菌属的细菌中，那么该转化载体有时候被称为“穿梭载体”。它甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移到农杆菌属、转移到植物中的结构。
本发明的载体可以转入合适的宿主细胞中，以便进行POI的表达。
因此，在另一方面，本发明提供了一种制备本发明的POI的方法，该方法包括在能进行由本发明的启动子所启动的编码POI的NOI表达的条件下培养用一种表达载体或转染过的宿主细胞，和选择性地回收所表达的POI。
通常，本发明的核苷酸序列可以整合到重组型可复制载体上。该载体可用于在相容的宿主生物中复制所述核酸。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种将本发明的核苷酸序列导入一种可复制载体的方法，将该载体导入相容的宿主生物，并在能进行由本发明的启动子所启动的NOI表达的条件下生长所述生物。然后可以从所述宿主生物中回收POI。合适的宿主生物包括植物或植物细胞。
NOI可以整合到可复制载体上，例如，克隆或表达载体，它包括本发明的启动子。所述载体还可用于在相容的宿主细胞中复制NOI。
因此，在另一种实施方案中，本发明提供了一种制备NOIs的方法，该方法是这样实现的将NOI导入包括本发明启动子的可复制载体中，将该载体导入相容的宿主细胞，并在能进行载体复制的条件下生长所述宿主细胞。该载体可以从所述宿主细胞中回收。例如，所述载体可以是质粒、或噬菌体载体。除了本发明的启动子之外，所述载体可以具有任何一种或多种复制起点，可操作地连接于用于表达NOI的启动子上的NOI，以及该启动子的调控子。
例如，载体可用于体外或体内转染或转化宿主生物。
所述载体可以转化或转染到合适的宿主生物中，以便进行本发明蛋白的表达。这一过程可能包括在能由所述载体表达编码所述蛋白的编码序列的条件下培养用上述表达载体转化过的宿主生物，和选择性地回收所表达的蛋白。
还可将本发明的载体导入宿主生物，以便复制该载体/核苷酸序列和/或表达NOI。在一个优选方面，所述宿主生物是植物细胞。
可以用本领域所公知的多种技术将本发明的载体导入合适的宿主生物，如转染、转化和电穿孔。另一种方法是原生质体转化方法(Winer等，微生物学，1985，468，美国微生物学协会)。
载体可以在体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。组织本文所使用的术语“组织”包括组织本身和器官。宿主细胞与本发明相关的术语“宿主细胞”包括可以含有本发明启动子的任何细胞和/或由它所获得的产物，其中，所述启动子在存在于所述宿主细胞中时能够表达NOI。
因此，本发明的另一种实施方案提供了用本发明的启动子转化或转染过的宿主细胞。所述启动子优选携带在用于复制并表达NOI的载体上。应当对细胞进行选择以便与所述载体相容，例如，它可以是原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
宿主细胞优选是植物细胞。
格兰氏阴性细菌大肠杆菌被广泛用作异源基因表达的宿主。不过，大量异源蛋白倾向于积累在细胞内部。随后要从大量的大肠杆菌细胞内蛋白中纯化所需要的蛋白可能是困难的。
与大肠杆菌相反，来自芽孢杆菌属的细菌非常适合作为异源宿主，因为它具有将蛋白分泌到培养基中的能力。适合作为宿主的其他细菌有来自链霉属和假单胞属的细菌。
根据编码POI的NOI的性质和/或对表达蛋白进行进一步加工的需要，可以优选诸如酵母或真菌的真核宿主。一般，酵母细胞优于真菌细胞，因为它更容易操作。不过，有些蛋白要么不好从酵母细胞中分泌，要么在某些场合下不能进行正确加工(例如，在酵母中过度糖基化)。在上述场合下，应当选择真菌宿主生物。
本发明范围之外的合适表达宿主的例子有真菌，如曲霉菌(如披露于EP-A-0184438和EP-A-0284603的曲霉菌)和木霉菌；细菌，如芽孢杆菌(如披露于EP-A-0134048和EP-A-0253455中的芽孢杆菌)，链霉菌和假单胞菌；以及酵母，如克鲁维酵母菌(如披露于EP-A-0096430和EP-A-0301670中的酵母菌)和酵母菌。举例来说，典型的表达宿主可以选自巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、黑曲霉、黑曲霉tubigenis变种、黑曲霉泡盛变种、棘孢曲霉、构巢曲霉、米曲霉、雷氏木霉、枯草芽孢杆菌、地衣型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母。
使用合适的宿主细胞-如酵母、真菌和植物宿主细胞-可以根据需要进行翻译后修饰-(例如肉豆蔻酸化、糖基化、截短、lapidation以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，以便赋予本发明的重组表达产物最佳的生物学活性。
因此，本发明还提供了一种用SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其衍生物、同源物、变体或片段转化宿主细胞的方法。
用可操作地连接于NOI上的本发明的启动子转化过的宿主细胞，可以在适于表达的条件下培养，并从细胞培养物中回收POI。根据其序列和/或所使用的载体，POI可以是分泌型的或者包含在细胞内。正如本领域技术人员所能理解的是，含有可操作地连接于NOI上的本发明的启动子的表达载体可以设计成具有信号序列，该序列能指导NOI/POI通过特定的原核细胞或真核细胞膜进行分泌。其他重组构建，可以将NOI连接到编码一种多肽结构域的核苷酸序列上，它有利于可溶性蛋白的纯化(Kroll DJ等，1993，DNA细胞生物学12441-53)。生物与本发明相关的术语“生物”包括含有本发明核苷酸序列的任何生物，其中，所述启动子能够在该生物中表达NOI。生物的例子可以包括真菌、酵母或植物。
与本发明相关的术语“转基因植物”包括含有本发明核苷酸序列的任何生物，其中，所述启动子能够在该生物中表达NOI。所述核苷酸序列优选整合到该生物的基因组上。
术语“转基因生物”不包括存在于其天然环境中的本发明的天然核苷酸序列，此时，它可操作地连接于同样处在天然环境中的其相关的编码序列上。
因此，本发明的转基因生物包括含有下列任一种或其组合的生物本发明的核苷酸序列，本发明的结构(包括其组合)，本发明的载体，本发明的质粒，本发明的细胞，本发明的组织或其产物。转化过的细胞或生物能够制备可制备可接受数量的POI。在某些场合下，POI可能容易从细胞或生物中回收。宿主细胞/宿主生物的转化如上文所述，宿主生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的例子包括大肠杆菌或枯草杆菌。对原核宿主转化的介绍在本领域中有大量文献，例如，参见Sambrook等(分子克隆，实验手册，第2版，1989，冷泉港试验室出版社)和Ausubel等，现代分子生物学方法(1995)，John Wiley & Sons公司。
如果使用原核宿主，在转化之前可能需要对NOI进行适当地修饰-如去掉内含子。转化过的真菌宿主生物可以是真菌-如霉菌。所述宿主的合适的例子包括属于高温霉属、小枝顶孢霉属、曲霉属、青霉属、毛霉属、脉胞霉属、木霉属等的任何成员-如毛状高温霉、产黄小枝顶孢霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、产黄青霉、爪哇毛霉、粗糙脉孢菌和绿色木霉等。
在一种实施方案中，宿主生物可以是丝状真菌。
在将近一个世纪的时间里，丝状真菌一直被广泛用于很多行业，用于生产有机化合物和酶。例如，传统的日本曲和大豆发酵都使用了曲霉菌。另外，在本世纪内，黑曲霉被用于生产有机酸，特别是柠檬酸，并用于生产在工业上使用的各种酶。
丝状真菌在工业上被如此广泛地应用有两大原因。首先，丝状真菌能够产生大量的胞外产物，例如，酶和有机化合物，如抗生素或有机酸。其次，丝状真菌能够在低成本底物，如谷物、稃皮、甜菜浆等上生长。基于同样的原因，丝状真菌是作为本发明的异源表达宿主的有吸引力的生物。
为了制备转基因曲霉菌，通过将本发明的核苷酸序列(可选地包括NOI)插入为了在丝状真菌中表达而设计的结构上制备了表达结构。
业已开发出了用于异源表达的若干种类型的结构。这些结构优选包括下列一种或多种引导要被分泌的POI的信号序列，它通常来源于真菌，和终止子(通常在真菌中起作用)，它能终止该表达系统。
业已在真菌上开发了另一种类型的表达系统，其中，本发明的核苷酸序列(选择性地包括NOI)可以融合到编码一种稳定蛋白的真菌基因的较小或较大的部分上。这样可以稳定POI。在这样一种系统中，可以在真菌蛋白和POI之间引入一个由特定蛋白酶识别的裂解位点，以便所述特定蛋白酶能够在该位点上裂解所产生的融合蛋白，从而释放出POI。举例来说，可以引入一个能够由至少存在于某些曲霉菌中的KEX-2样肽酶的位点。这种融合会导致体内裂解，从而导致表达产物的产生，而不是产生较大的融合蛋白。
业已报导了编码细菌、真菌、脊椎动物和植物蛋白的若干基因在曲霉属中进行的异源表达。如果本发明的核苷酸序列(或者甚至包括NOI)不与信号序列融合的话，这些蛋白可以沉积在细胞内部。所述蛋白能在细胞质中积累，并且通常不会被糖基化，这可能是某些细菌蛋白的一个优点。如果本发明的核苷酸序列(或者甚至包括NOI)具有一个信号序列的话，所述蛋白会积累在细胞外部。
就产物稳定性和宿主菌株修饰而言，某些异源蛋白在分泌到真菌培养液中时不是很稳定。大多数真菌产生几种胞外蛋白酶，它能降解异源蛋白。为了避免这一问题，业已将具有较低蛋白酶产量的特殊真菌菌株用作异源生产的菌株。
在US-A-5741665中对转化丝状真菌的介绍作了综述。该专利指出，转化丝状真菌和培养所述真菌的标准技术在本领域中是众所周知的。例如，对用于粗糙脉胞菌上的技术的深入综述可以参见Davis和de Serres，酶学方法(1971)17A79-143。通常用标准方法维持菌株并制备分生孢子。菌丝体通常在液体培养基中生长大约14小时(25℃)，如Lambowitz等所述，细胞生物学杂志(1979)8217-31。宿主菌株通常可以在补充了合适的营养成分的Vozel’s或Ories基本培养基中生长，例如，所述成分可以是下列任一种或多种组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、对氨基苯甲酸和肌醇。
对转化丝状真菌的进一步的介绍在US-A-5674707中作过综述，该文献指出一旦获得一种结构，即可以显性形式或质粒形式，例如，pUC-基或其他载体，导入特定的丝状真菌宿主中，使用诸如DNA介导的转化、电穿孔、粒子枪轰击、和原生质体融合之类的技术。另外，Ballance1991(同上)指出，用于制备转化过的真菌的转化方法基于原生质体的制备和用PEG和氮离子将DNA导入原生质体。然后让转化过的原生质体再生，并用各种选择标记筛选转化过的真菌。
为了筛选所得到的转化体，所述转化通常还包括一种选择基因标记，它与表达框存在于同一个载体上或者通过共转化导入该基因标记可以选择的宿主菌株。现有各种标记/宿主系统，包括与构巢曲霉的营养缺陷型菌株一起使用的pyrG、argB和niaD基因。与米曲霉营养缺陷型一起使用的pyrG和argB基因；与产黄青霉菌营养缺陷型一起使用的pyrG、trpC和niaD基因；以及与雷氏木霉菌营养缺陷型一起使用的argB基因。显性选择标记包括amdS、oliC、hyg和phleo，它们目前也可用于诸如黑曲霉、米曲霉、无花果曲霉、产黄青霉菌、顶头孢、异旋孢腔菌、围小丛壳、Fulvia fulva和斑形小球腔菌的丝状真菌(有关综述参见Ward，现代微生物遗传学，1991，Wiley-Liss公司，455-495页)。一种常用的转化标记是构巢曲霉的amdS基因，它的高拷贝数使得该真菌能够以丙烯酰胺为唯一的氮源生长。
为了转化丝状真菌，业已开发了用于多种真菌的若干种转化方法。用于转化的标记包括多种营养缺陷型标记，如argB、trpC、niaD和pyrG，抗生素抗性标记，如benomyl抗性，潮霉素抗性和phleomycin抗性。
在一个方面，宿主生物可以是曲霉属的，如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉属还可以通过Rambosek，J.和Leach，J.1987披露的方法制备(丝状真菌的重组DNA进展和展望，CRC生物技术评述6357-393)，Davis R.W.1994(曲霉属中的异源基因表达和蛋白分泌，参见Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(著)曲霉属工业微生物学的五十年发展，29卷，Elsevier阿姆斯特丹1994，525-560页)，Balance，D.J.1991(丝状真菌的转化系统和真菌基因结构的概况，参见Leong，S.A.Berka R.M.(著)分子工业霉菌学，丝状真菌的系统和应用，Marcel Dekker公司，纽约1991，1-29页)和Turner G.1994(遗传操作载体，参见Martinelli S.D.Kinghorn J.R.(著)曲霉属工业微生物学的五十年发展，29卷，Elsevier阿姆斯特丹1994，641-666页)。转化过的酵母在另一种实施方案中，转基因生物可以是酵母。
就此而言，酵母业已被广泛用作异源基因表达的载体。
例如，酿酒酵母具有很长的工业应用历史，包括将其用于异源基因表达。Goodey等对在酿酒酵母中进行的异源基因表达作过(1987，酵母生物技术，D R Berry著，401-429页，Allen和Unwin，伦敦)综述，还可以参见King等(1989，酵母分子和细胞生物学，E F Walton和G T Yarronton著，107-133页，Blackie，Glasgow)。
由于几方面的原因，酿酒酵母很适合异源基因表达。首先，对于人体来说，它不是致病性的，并且它不能产生某些内毒素。其次，它具有很长的安全使用历史，在几个世纪中为了各种目的而进行过商业开发。这使得它广泛地被公众接受。第三，对该生物的广泛的商业应用和研究，导致了对酿酒酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特征的充分了解。
E Hinchcliffe E Kenny对在酿酒酵母中进行的异源基因表达的原理和基因产物的分泌作过综述(1993，作为异源基因表达载体的酵母，酵母，5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison著，第2版，学术出版有限公司。
现有几种类型的酵母载体，包括整合载体，它需要与宿主基因组进行重组以便保持，以及自主复制的质粒载体。
为了制备转基因酵母，通过将本发明的核苷酸序列插入为了在酵母中表达而设计的结构上制备了表达结构。业已开发了若干种类型的用于异源表达的结构。所述结构可以含有在酵母中起作用的启动子，如源于酵母的启动子，如使用GAL1启动子。通常使用来自酵母的信号序列，如编码SUC2信号肽的序列。由一个在酵母中起作用的终止子终止该表达系统。
为了转化酵母，业已开发了若干种转化方案。例如，本发明的转基因酵母可以通过披露于以下文献中的方法制备Hinnen等(1978，美国科学院院报，75，1929)；Beggs，J D 1978，自然，伦敦，275，104)；和Ito，H等(1983，细菌学杂志，153-168)。
可以用各种选择标记对转化过的宿主细胞进行选择。用于转化的标记包括多种营养缺陷型标记，如LEU2，HIS4和TRP1，以及显性抗生素抗性标记，如氨基糖苷抗生素标记，例如，G418。转化过的植物/植物细胞适用于本发明的一种优选宿主是植物。
在这一方面，建立遗传上修饰过的植物的基本原理是将遗传学信号插入植物基因组，以便获得所插入遗传材料的稳定保持。
现有若干种将插入遗传信息的技术。两个主要的原则是，将遗传信息直接导入以及利用载体系统导入遗传信息。一般技术的综述可以参见以下文献Potrykus(植物生理学植物分子生物学年度综述，1991，42205-225)和Christou(农业-食品-工业高技术，3月-4月，1994，17-27)。
尽管在EP-B-0470145和CA-A-2006454中没有披露本发明的启动子，但这两份文献提供了对可用于制备本发明转基因植物的技术类型的某些有用的背景评论。这些背景介绍的某些内容将包括在下面的说明中。
建立遗传上修饰过的植物的基本原理是将遗传学信号插入植物基因组，以便获得所插入遗传材料的稳定保持。
因此，在这一方面，本发明涉及一种载体系统，该载体具有本发明的核苷酸序列或结构，并且能够将该核苷酸序列或结构导入诸如植物的生物的基因组中。
所述载体系统可以包括一种载体，但它可以包括两种载体。在具有两种载体的情况下，该载体系统通常被称为二元载体系统。GynheungAn等对二元载体系统作过详细说明(1980，二元载体，植物分子生物学手册A3，1-19)。
一种具有特定启动子或核苷酸序列或结构的被广泛用于转化植物细胞的系统是基于来自根癌农杆菌的Ti质粒或来自发根农杆菌的Ri质粒的使用(An等，1986，植物生理学81，301-305，和Butcher D.N.等，1980，植物病理学组织培养方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson著，203-208。
业已建立了几种不同的Ti和Ri质粒，它们适用于建立上述植物或植物细胞结构。这样一种Ti质粒的非限定性例子是pGVC850。
本发明的核苷酸序列或结构优选插入Ti质粒中位于T-DNA的末端序列之间或靠近T-DNA序列，以避免破坏靠近T-DNA边界两侧的序列，因为这些部分中至少有一个似乎是将修饰过的T-DNA插入植物基因组所必须的。
通过以上说明可以理解，如果生物是植物的话，本发明的载体系统优选是这样一种系统，它含有感染植物所必需的序列(例如，vir区)以及T-DNA序列的至少一个边界部分，该边界部分与该遗传结构位于同一个载体上。该载体系统优选是根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌Ri质粒，或其衍生物，因为这些质粒是众所周知的并且被广泛用于建立转基因植物，现有的很多载体系统都是基于上述质粒或其衍生物。
在建立本发明的转基因植物时，可以首先在微生物中建立本发明的核苷酸序列或结构，其中，所述载体可以复制，并且在插入植物中之前容易操作。一种有用的微生物的例子是大肠杆菌，但可以使用具有上述特征的其他微生物。如果上述载体系统的一种载体是在大肠杆菌中建立的话，必要时将其转入合适的农杆菌属菌株，例如，根癌农杆菌。因此，优选将获得了本发明核苷酸序列或结构的Ti质粒转入合适的农杆菌属菌株，例如，根癌农杆菌，以便获得具有本发明核苷酸序列或结构的农杆菌属细胞，然后将该DNA转入待修饰的植物细胞。
正如CA-A-2006454中所报导的，现有大量的克隆载体含有可以在大肠杆菌中复制的系统，以及能够选择转化过的细胞的标记。例如，所述载体包括pBR322、pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。
通过这种方式，可以将本发明的核苷酸或结构导入所述载体的合适的限制位点上。将所包含的质粒用于转化大肠杆菌。在合适的营养培养基中培养大肠杆菌细胞，然后收获并裂解。然后回收所述质粒。作为分析方法，通常使用序列分析、限制性分析、电泳和其他生物化学-分子生物学方法。在每一次操作之后，可以对所使用的DNA序列进行限制消化，并与其他的DNA序列连接。每一种序列可以克隆在相同的和不同的质粒上。
在每一次将所需要的本发明的启动子或结构或核苷酸序列导入植物之后，可能需要存在和/或插入其他DNA序列。例如，如果用Ti或Ri质粒转化植物细胞的话，可以连接Ti和Ri质粒T-DNA的右侧边界，不同通常是右侧和左侧边界作为导入基因的旁侧序列。对于用T-DNA转化植物细胞业已作过充分研究，并披露于以下文献中EP-A-120516；Hoekema，参见二元植物载体系统Offset-drukkerij KantersB.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley等，植物科学评述，41-46；和An等，EMBO杂志，1985，4277-284。
用农杆菌直接感染植物组织是一种被广泛采用的简单技术，并且该技术披露于以下文献中Butcher D.N.等，1980，植物病理学组织培养方法，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson著，203-208。对这一主题的进一步的介绍可以参见Potrykus(植物生理学植物分子生物学年度综述1991，42205-225)和Christou(农业-食品-工业-高技术3月/4月1994，17-27)。采用该技术，可以在植物的特定部分或组织上对植物进行感染，即在植物的叶片、根、茎部分或其他部分。
通常，在用具有所述启动子和/或GOI的农杆菌属直接感染植物组织时，要创伤待感染的植物，例如，通过用刀片切割或用针头穿刺植物或用刷子摩擦植物。然后用所述农杆菌属接种伤口。然后让接种过的植物或植物部分生长在合适培养基中，并让其发育成成熟的植株。
在建立植物细胞时，可以按照众所周知的组织培养方法生长并保持这些细胞，如通过在补充了诸如氨基酸、植物激素、维生素等的必需生长因子的合适的培养基中培养所述细胞。可以用从细胞或组织培养物再生植株的已知方法实现将转化过的细胞再生成遗传修饰过的植物，例如，通过用一种抗生素筛选转化过的芽，并将所述芽在含有合适养分、植物激素等的培养基上继代培养。
用于转化植物的其他技术包括冲击转化、碳化硅须技术(参见Frame BR，Drayton PR，Bagnaall SV，Lewnau CJ，Bullock WP，WilsonHM，Dunwell JM，Thompson JA&Wang K1994，通过碳化硅须介导的转化生产可育的转基因玉米植物，植物杂志6941-948)和病毒转化技术(例如，参见Meyer P，Heidmann I&Niedenhof I 1992，用木著花叶病毒作为植物的载体系统，基因110，213-217)。
有关植物转化的进一步介绍可以参见EP-A-0449375。植物和植物组织的冲击转化起初为了生产难于用根癌农杆菌转化的植物物种的稳定的转化体而开发的植物组织的冲击转化方法，能将金属颗粒表面上的DNA导入细胞，业已发现该方法可用于检验遗传结构在瞬时表达期间的性能。这样，可以在瞬时转化的细胞中研究基因表达，而不需要感兴趣基因的稳定整合，因此不需要花费时间的产生稳定转化体。
更具体地讲，冲击转化技术(或者被称为粒子轰击技术)最初是由Klein等，Sanford等和Klein等披露的，并且由于其容易操作并且不用对感兴趣的细胞或组织进行预处理而得到推广。
粒子轰击技术的原理是通过驱动力(例如，发电或压缩空气)将涂有DNA的微小颗粒直接送入完整的植物细胞。所述微小的颗粒能穿透细胞壁和细胞膜，只对其造成小的损伤，随后转化过的细胞能表达所述启动子结构。
一种粒子轰击技术是用一种粒子输入枪(PIG)进行的，这种枪是由Finer等和Vain等开发并披露的。PIG可以通过部分真空在流动的氦气流中将微小颗粒加速使其进入植物细胞。
PIG的一个优点是，微小颗粒的加速可以通过定时继电电磁阀控制并通过所提供的氦气压力调控。用高压氦气作为驱动力的优点是它是惰性的，不会留下残余物，并且能进行可重复的加速。所述真空能够减轻对颗粒的吸力，并通过在冲击之前分散氦气气体减轻对组织的损伤[Finer等，1992]。
在某些情况下，由于PIG系统的效果和方便性，使得它成为制备瞬时转化过的瓜尔豆组织的好的选择，对该组织的启动子/报导基因融合体的瞬时表达进行检测。瓜尔豆如上文所述，在一个方面，优选的转化过的生物是转化过的瓜尔豆。
瓜尔豆(Cyamopsis teragonoloba)是耐干旱的物种，它起源于印度和巴基斯坦，但它在诸如美国的很多其他国家被处于工业目的载培。瓜尔豆在分类上与豌豆和菜豆同属于豆科植物。豆科植物是双子叶植物，其特征是具有宽叶片和两个子叶，与单子叶植物不同的是，单子叶具有‘牧草样’形态，并且仅具有一个子叶。其他双子叶植物的例子有烟草和马铃薯，单子叶植物的例子有诸如小麦、水稻、玉米和大麦的谷类。不过，瓜尔豆与诸如豌豆和菜豆的大多数豆科作物不同，其种子碳水化合物储存物不是储存在子叶中的淀粉，而是积累在胚乳中的半乳甘露聚糖。其胚乳是非光合组织，在组织是它仅靠种衣下面包着子叶，并且可以从其他种子组织剥离。瓜尔胶瓜尔豆是作为动物饲料和人类消费的作物种植。不过，瓜尔豆的一个重要用途是提取瓜尔胶，这种胶被用作食品中的功能性成分，例如作为冰淇淋的增稠剂。瓜尔胶由半乳甘露聚糖组成-它是位于胚乳中的胞外细胞壁多糖。
在一个优选方面，本发明涉及用本发明的启动子使得能够影响瓜尔胶合成的NOI表达。半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖由具有取代过的半乳糖基团的甘露糖主链组成，其结合为(1→6)-α-D-半乳糖(1→4)-β-D-甘露聚糖，该聚合物的分子量为220,000道尔顿(Whistler&Hymowitz1979)。
不同的豆科物种之间半乳甘露聚糖的取代程度，以及半乳糖和甘露糖残基之间的比例不同。在瓜尔豆中该比例大约为0.56，成熟的种子含有大约35％-42％的半乳甘露聚糖(Whistler&Hymowitz1979)。
在一个优选方面，本发明涉及用本发明的启动子引起能够影响半乳甘露聚糖合成的NOI表达。胚乳表达在一个优选方面，本发明的启动子能在植物组织的胚乳中起作用。
在这一方面，胚乳-以及胚-是在开花植物的种子发育早期形成的。具体地讲，胚乳是在双受精期间形成的，其中，一个精核与一个卵细胞融合，产生胚，而另一个精核与两个极性细胞核融合，形成三倍体胚乳[Lopes&Larkin 1993]。在某些植物(但不是所有植物)中，该组织起着种子的储存库的作用，这些植物包括瓜尔豆和谷类植物。不过，在其他物种上，子叶扮演着种子的主要储存组织的角色，而胚乳则退化了。
在诸如水稻、小麦、大麦和玉米的谷类作物上，储存在胚乳中的主要的碳水化合物是淀粉，它积累在细胞内的被称为造粉体的质体内。不过，在瓜尔豆胚乳中，主要的储存碳水化合物是半乳甘露聚糖，它积累在胞外的胞间隙中，并因此被分泌到细胞外面。
在成熟期间，由于细胞的明显膨大，和碳水化合物、蛋白和脂类的积累，使得发育中的种子的体积和质量增加，所积累的物质在发芽期间被用作碳源和氮源。在成熟之后，在诸如脱落酸(ABA)的植物激素的作用下种子进入休眠期[Wert&Harada1993]，从而避免过早发芽[Thomas1993]。在瓜尔豆种子发芽时，甘露聚糖酶和半乳糖甘酶起作用，降解胚乳的半乳甘露聚糖。而所释放的甘露糖和半乳糖能支持幼苗的发育。碳水化合物代谢在一个优选方面，本发明涉及用本发明的启动子引起能影响碳水化合物代谢，如蔗糖代谢的NOI的表达，特别是在植物组织中表达。
在这一方面，蔗糖是主要的光同化产物，它在植物中被输送很长距离，从光合‘资源’组织到达异养耗能‘库’组织，其中，它是碳水化合物营养的支柱。
蔗糖合成的最初前体是磷酸三糖，它是在光合细胞的叶绿体中，在固碳(卡尔文)循环中合成的。这种磷酸三糖(甘油醛3-磷酸)被转运到细胞质中，并转化成果糖6-磷酸和葡萄糖1-磷酸。葡萄糖1-磷酸被转化成UDP-葡萄糖，它与果糖6-磷酸一起通过蔗糖磷酸合成酶转化成蔗糖6-磷酸。蔗糖6-磷酸是蔗糖的直接前体，并且其转化是通过蔗糖磷酸酶催化的。
在叶肉细胞的细胞质中合成蔗糖之后，它由伴细胞输送到韧皮部，并分配到库组织中。所述转运过程是通过由于源和库之间的蔗糖浓度梯度所产生的渗透压力推动的‘物质流’。蔗糖在绿色组织中的积累会减慢光合作用。因此，很多人认为它是一种按需要进行的过程，通过将蔗糖卸载到发育中的库组织中，由维管组织联系对碳水化合物的需求。
发育中的种子是储存活跃的库器官，因此是蔗糖的最大用户。发育中的种子将蔗糖用于若干种目的，其目的的一种例子是合成储存多糖，如瓜尔豆胚乳中的半乳甘露聚糖。
蔗糖被蔗糖合成酶降解成果糖和UDP-半乳糖(UDPG)，并通过一系列转化形成GDP-甘露糖(GDPM)和UDPG。GDPM和UDPG是半乳甘露聚糖的直接前体，并且它的合成是由甘露聚糖合成酶和半乳糖基转移酶催化的。半乳甘露聚糖是在高尔基体中合成的，并从高尔基转运到胞外间隙。半乳甘露聚糖合成另一种关键酶是UDP半乳糖4-差向异构酶。
蔗糖在植物中降解可以通过两种酶的活性实现转化酶(E.C.3.2.1.26)和蔗糖合成酶(E.C.2.4.1.13)。‘蔗糖合成酶’的名称意味着这种酶能催化蔗糖的合成，但是，蔗糖合成酶的代谢作用是分解而不是合成，并且蔗糖合成酶优选在体内裂解蔗糖。与这一作用吻合，蔗糖合成酶在诸如发育中的种子的库组织中含量丰富，而在全感受态的光合组织中不丰富。在UDP存在的条件下，蔗糖合成酶能催化将蔗糖裂解成UDP-葡萄糖和果糖。通过在UDP存在的条件下裂解蔗糖，将蔗糖糖苷键的高能量保存在UDP-葡萄糖中，它可以作为进一步反应的糖苷供体。另一方面，转化酶能够催化将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且在较少程度上起着用于储存碳水化合物的作用，但可以满足发育的直接能量需求。
在一个优选方面，本发明涉及用本发明的启动子引起能影响半乳糖4-差向异构酶的原位活性的NOI表达。GUS报导基因在本发明的某些研究中，用大肠杆菌uidA基因(又被称作GUS基因)作为报导基因。在这里，GUS基因被用作本发明启动子能引起一种NOI表达的证据。不过，应当指出的是，本发明不局限于NOI仅仅是GUS基因。
更具体地讲，GUS基因编码β-葡糖醛酸酶(GUS)，它是一种水解酶，能够催化β-葡糖醛酸的裂解，例如，X-gluc和MUG。
用于高等植物的GUS报导基因系统是由Jefferson1987开发的。
采用uidA基因的系统可以与启动子融合，并导入植物细胞进行表达。通过分析转基因组织中GUS蛋白的活性，可以监测特定启动子的活性。在我们的某些研究中，对大肠杆菌uidA基因进行过修饰，以避免在植物中糖基化，它能够保持GUS针对内质网(ER)的活性。
为了进行瞬时表达研究，将X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基b-D-葡糖醛酸)用作GUS组织化学检测的底物(定性检测)，并将MUG(4-甲基伞形基葡糖醛酸)用作荧光检测的底物(定量检测)。对无色X-Gluc底物的酶促裂解能够在裂解部位产生靛蓝沉淀物。这种沉淀是由通过裂解X-Gluc所产生的吲哚氧基衍生物的氧化二聚体化所引起的。因此，可以在转基因组织中检测并分析GUS活性，而不必在进行分析之前提取有关的酶。POI的生产含有本发明载体的宿主生物可用于利用本发明的启动子表达POI。在这一方面，宿主生物可以在能够表达POI的合适条件下培养宿主生物。在某些场合下，POI的表达可以是组成型的，以便能够持续产生，或者是诱导型的，需要一种诱导物来启动表达。在诱导型表达的情况下，蛋白生产可以在需要时通过诸如向培养基中添加诱导物质的方法启动。
一旦将所述载体转化到或转染到合适的宿主生物中，就可以对宿主生物进行培养。这方面的内容可以简单地参考US-A-5543322，该专利说为了培养转化体，可以使用含有能够被转化体同化的碳和氮源等的培养基。可以使用任何能够被转化体同化的碳源。其例子包括葡萄糖、蔗糖、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、和n-石蜡等，以及有机酸(例如，乙酸、富马酸、苯甲酸等)、醇(例如，甲醇、乙醇、丁醇等)、脂肪和油(大豆油、猪油等)等。以上成分可以单独使用或组合使用。作为氮源，举例来说，有蛋白胨、大豆粉、棉籽粉、肉膏、酵母提取物、干酵母、玉米浆、玉米谷蛋白粉、尿素、铵盐(例如氯化铵、硫酸铵等)、硝酸盐(例如，硝酸钾、硝酸铵等)、其他有机或无机含氮材料等。它们可以单独使用或组合使用。另外，可以适当添加无机盐(例如，磷酸盐等)，微量金属盐(例如，镁盐、钙盐、锰盐等)。
如果需要，可以本领域已知的多种技术从宿主生物中提取POI，这些方法包括酶促、化合和/或渗透压裂解和物理破碎。对某些用途来说，一种优选的提取/纯化方法可能包括一个离心步骤，随后，如果需要的话使用诸如离子交换或亲和层析的柱层析。
因此，在培养基中已经积累了需要的产物(例如，POI)之后，可以通过离心或过滤获得含有POI的上清液。另一方面，在培养之后，当所述生物中已经积累了POI时，可以通过已知方法收集该生物，并通过合适的方法回收需要的产物。例如，可以将所述生物悬浮在含有诸如盐酸胍的蛋白变性剂的缓冲液中，在冷藏环境中搅拌该悬浮液，然后通过离心之类的方法获得含有所需产物的上清液。
另外，在将所述生物悬浮在缓冲液中之后，可以通过玻璃珠研磨所述生物，或者通过弗氏压碎器、超声波、或酶促处理等将其破碎，然后通过离心之类的方法获得上清液。
为了从上述上清液中分离和纯化POI，可以参见US-A-554332，该文献指出，可以对本身已知的分离和纯化方法进行适当地组合。例如，已知的分离和纯化方法有利用溶解度差异的方法(例如，盐析、用容器沉淀等)，主要利用分子量差异的方法(例如，透析、超滤、凝胶过滤等)，利用电荷差异的方法(例如，离子交换层析等)，利用特殊亲和性的方法(例如，亲和层析等)，利用疏水性差异的方法(例如，反相高效液相层析等)，和利用等电点差异的方法(例如，等电聚胶等)等。分泌在某些场合下，希望POI能从其表达宿主中分泌到培养基中。可以从培养基中更方便地回收POI。根据本发明，可以根据所需要的表达宿主选择分泌前导序列。在本发明中，还可以使用杂合的信号序列。
外源分泌前导序列的典型例子有源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-包括18个和24个氨基酸的形式，例如，源于曲霉属)、α-因子基因(酵母，例如酵母属和克鲁维酵母属)或α淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的分泌前导序列。检测有多种检测和测定POI表达的方法为本领域所公知。其例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。可以使用采用了能与POI上的两个不相干表位起反应的单克隆抗体的基于双部位单克隆的免疫测定，或者利用竞争性结合测定。对上述及其他测定的介绍可以参见Hampton R等(1990，血清学方法，试验室手册，APS出版社，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，实验医学杂志15，8121 1)。有多种标记和缀合技术为本领域技术人员所公知，并可将其用于各种核酸和氨基酸测定中。生产用于检测POI的标记过的杂交或PCR探针的方法包括用标记过的核苷酸进行的寡聚体标记、缺口翻译、末端标记或PCR扩增。另外，可以将NOI或其任何部分克隆到载体上，以便生产mRNA探针。所述载体为本领域所公知，并且被作为商品出售，可将其用于通过添加合适的RNA聚合酶，如T7、T3和SP6以及标记过的核苷酸体外合成RNA探针。
有多家公司提供上述方法所使用的商品化试剂盒和方法，例如Pharmacia生物技术公司(Piscataway，NJ)、Promega公司(Madison，WI)、和美国生化公司(Cleveland，OH)。合适的报导分子或标记包括放射性核素、酶、荧光素、化学发光剂、或生色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂、和磁性颗粒等。介绍所述标记使用的专利包括US-A-3817837；US-A-3850752；US-A-3939350；US-A-3996345；US-A-4277437；US-A-4275149；和US-A-4366241。另外，可以按照在US-A-4816567中所披露的方法生产重组免疫球蛋白。
对POI表达进行定量的其他方法包括放射性标记(Melby PC等1993免疫方法杂志159235-44)或生物素化(Duplaa C等1993分析生物化学229-36)核苷酸，对照核酸的共扩增，以及插入了实验结果的标准曲线。通过在ELISA设计中进行测定可以加快对多个样品的定量，在所述设计中，感兴趣的寡聚体以各种稀释比存在，并可以对分光光度或量热反应进行快速定量。
尽管标记基因表达的存在/缺乏可以暗示感兴趣的基因是否存在，但应当证实其存在和表达。例如，如果NOI被插入标记基因序列内的话，可以通过标记基因功能的缺乏鉴定含有NOI的重组细胞。另外，标记基因可以与NOI串联结合，受本发明启动子或其他启动子(优选本发明的相同的启动子)控制。标记基因因为诱导而进行的表达或分泌通常也表明了POI的表达。
另外，可以通过本领域技术人员所公知的多种方法鉴定含有NOI的宿主细胞。这些方法包括，但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术，其中包括用于对核酸或蛋白进行检测和/或定量的膜基、溶液基、或芯片基技术。总结总而言之，本发明涉及一种启动子，还涉及含有该启动子的结构。具体地讲，本发明涉及用一种启动子在一种生物中表达NOI。
在一个优选方面，本发明涉及通过用本发明的新型启动子转化(遗传操作)植物，导致能影响碳水化合物代谢的NOI表达，来改变碳水化合物的代谢。
在一个优选方面，本发明涉及通过用本发明的新型启动子转化(遗传操作)豆科植物瓜尔豆，导致能影响半乳甘露聚糖合成的NOI表达，来改变半乳甘露聚糖合成。保藏物根据布达佩斯条约规定将以下样品能在被认可的保藏机构国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，23St.Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，英国，B2 1RY，保藏日期是1999年5月19日微生物 菌株号NCIMB 编号大肠杆菌 TOP10(Invitrogen)+pTBR-ScaK3 NCIMB41011NCIMB41011包括本发明的新的核苷酸序列。
在图3中示出了本发明新型核苷酸序列的限制图谱。
本发明还包括由上述保藏物所衍生的序列以及包括该序列的实施方案。本发明还包括由上述保藏物所衍生的部分序列和包含所述序列的实施方案，其中，所述部分序列编码调控因子。
本发明的启动子可以用图2中所示出的任一种合适的限制酶从所述保藏物中分离。或者，可以用PCR技术“PCR生产出”所述启动子序列。在这里，合适的启动子应当以SEQ ID NO1所示序列为基础。
举例来说，为了从pTBR-ScaK3扩增全长RSus3启动子启动子(2700bp)，可以使用引物对“M13正向”和“RSusNcoI”。上部的M13正向引物与距离克隆位点大约110bp的该克隆的pCR2.1-TOPO部分退火，而上部“RSusNcoI”引物与RSus3的翻译起始密码子退火，或者，可以使用引物对“AP2”和“RSusNcoI”，以便分离相似的片段(AP2与克隆片段的接头部分退火)。
为了从pTBR-ScK3扩增没有内含子RSus启动子，可以使用引物对“AP2”和“Lowexon1/2”。下部的Lowexon1/2引物是按以下方式设计的该引物的3’末端相当于位于内含子1的5’剪接位点上游的24bp的序列。该引物的5’末端相当于位于3’剪接位点和ATG-密码子之间的27bp的序列，并整合了NcoI位点。
因此，总而言之，本发明涉及一种能用于使NOI在转化过的植物的胚乳组织/细胞中进行选择性表达的启动子。所述NOI和/或启动子对转化过的植物来说可以是异源的-就是说，NOI和/或启动子不是天然存在于非转化植物中。本发明的启动子被定义为具有相当于SEQ IDNO1所示的核苷酸序列或其变体、同源物、片段或衍生物。对实施例部分和附图的介绍。
下面将结合附图只是以举例的方式对本发明进行说明。其中
图1是示意2是示意3是示意4是照片图5是示意6是示意7是示意8是示意9是示意10是示意11是曲线12是示意13是示意14是示意15是照片
图16是一系列照片
图17是曲线18是曲线19是示意20是示意21是示意22是示意23是示意24是示意25是示意26是曲线图。
第一部分-附图的更详细的说明
图1是本发明启动子及其某些相关序列的示意图(不成比例)。
图2是pScaK3(pTBR-ScaK3)中RSus3序列的图谱，具有旁侧限制位点。其他的克隆与它类似，但某些具有相反的取向。
图3是本发明启动子的限制图谱。
图4表示半嵌套PCR结果的琼脂糖凝胶。泳道1和12标记II；泳道2-6EcoRV、DraI、PvuII、ScaI和SspI，使用缓冲液F；泳道7-11相同，采用缓冲液H。
图5用引物M13正向和RSusNco扩增来自pScaK3和pSspK3的启动子区。含有XhoI和NcoI位点的扩增产物能以XhoI/NcoI片段形式直接克隆到pGUSNSt上的独特的SalII和NcoI位点上。
图6是一种结构的示意图。
图7是一种结构的示意图。
图8是一种结构的示意图。
图9是一种结构的示意图。
图10是一种结构的示意图。
图11表示在瓜尔豆胚乳发育期间蔗糖合成酶活性的时间进程。在开花后7-41天测定来自各个发育阶段的瓜尔豆胚乳的提取物中蔗糖合成酶的比活性。每一个时间点上的值是由3-4个独立测定所获得的平均蔗糖合成酶活性，其中，收集来自每一个豆荚的至少5个胚乳。
图12表示所述对pTBR-ScaK3进行测序的计划。箭头表示测序引物，数字表示测序引物的5’末端相对RSus3ATG密码子的大致位置。
图13各种RSus3/GUS/NOSt结构的示意图。数字表示相当翻译起始密码子的碱基对。
图14各种串联的RSus3结构的示意图。数字表示相当翻译起始密码子的碱基对。
图15表示串联重复克隆的对照消化结果的琼脂糖凝胶。泳道1pTandem leg/pro的HindIII消化，它产生了740bp的特殊片段。泳道2pTandem豆球蛋白的NheI消化，它产生了570bp的特殊片段。泳道DNA标记VI。泳道4pTandem谷醇溶蛋白的HindIII消化，它产生了160bp的特殊片段。
图16a是用含有GUS表达核苷酸序列的ENOS对照质粒轰击转化过的瓜尔豆子叶组织的照片。这是一个对照研究。正如所看到的，观察到了GUS的高水平的瞬时表达。
图16b是用含有GUS表达核苷酸序列的ENOS对照质粒轰击转化过的瓜尔豆胚乳组织的照片。这是一个对照研究。正如所看到的，观察到了GUS的瞬时表达。
图16c是用含有GUS表达核苷酸序列的RSus3结构质粒p1730(它含有单拷贝的本发明的核苷酸序列)轰击转化过的瓜尔豆子叶组织的照片。正如所看到的，观察到了GUS的极低水平的瞬时表达。
图16d是用含有GUS表达核苷酸序列的RSus3结构质粒p1730(它含有单拷贝的本发明的核苷酸序列)轰击转化过的瓜尔豆胚乳组织的照片。正如所看到的，观察到了GUS的良好水平的瞬时表达。
图16e是用含有GUS表达核苷酸序列的RSus3结构质粒pTandemleg/pro(它含有串联拷贝的本发明的核苷酸序列)轰击转化过的瓜尔豆子叶组织的照片。正如所看到的，观察到了GUS的极低水平的瞬时表达。
图16f是用含有GUS表达核苷酸序列的RSus3结构质粒pTandemleg/pro(它含有串联拷贝的本发明的核苷酸序列)轰击转化过的瓜尔豆胚乳组织的照片。正如所看到的，观察到了GUS的高水平的瞬时表达。
图17表示用RSus3结构轰击之后在纠正组织大小之后瓜尔豆胚乳中GUS瞬时表达的组织图。所提供的数据是以每个胚乳的兰色斑点平均数与计算出的标准误差一起的形式表达的。
图18表示用RSus3结构轰击之后，在纠正组织大小之后瓜尔豆组织中GUS瞬时表达的组织图。所提供的数据是以每个子叶的兰色斑点平均数与计算出的标准误差一起的形式表达的。材料和方法DNA的分离本研究所使用的质粒是用由Qiagen(Hilden，德国)提供的QiaprepSpin微量制备试剂盒和质粒Maxi试剂盒分离的。上述试剂盒能够提供非常纯净的质粒制剂。将其直接用于克隆、测序和瞬时表达测定。因此不必进行进一步的纯化。用10mMTris-HCl，pH8.5作为洗脱缓冲液和储存缓冲液。所有DNA在-20℃下保存。
通过在PowerwaveTM200分光光度剂上在260纳米波长下测定吸收值测定质粒制剂的浓度。大小为1的OD260相当于大约50微克/毫升DNA。通过比较琼脂糖凝胶中溴化乙锭染色的DNA的荧光估算分离片段中DNA的量。限制酶用购自NEB和Boehringer M的限制酶进行酶消化。在反应中使用由供应商所提供的缓冲液。在进行双重消化时，选择对两种酶相容的缓冲液(例如，在含有BSA的NEBuffer2中进行NheI和NcoI的消化。电泳电泳被用于分离并鉴定DNA。用荧光染料溴化乙锭对DNA进行染色，溴化乙锭以0.6微克/毫升的浓度掺入凝胶中。将合适量的DNA与加样缓冲液(0.1％溴酚兰，16％Ficoll400)混合，并加样到Nusieve或Seakem琼脂糖凝胶上(FMC Bioproducts)。用TBE缓冲液(0.1Mtris，0.09M硼酸，0.001M EDTA)作为电泳缓冲液。根据感兴趣的电泳带的大小通过在0.5-2％(w/v)琼脂糖凝胶中电泳分离DNA。对于小于1000bp的带来说，使用2％Nusieve GTG琼脂糖凝胶，而对于大于1000bp的带来说，使用0.5-1.5％Seakem LE琼脂糖凝胶。
用DNA分子量标记I、II、IV、VI和VII(Boehringer M)评估电泳的DNA。提供浓度为0.25微克/微升的标记，并按以下方法稀释2微升DNA标记，2微升加样缓冲液和8微升水。根据孔的大小将4微升或10微升该混合物加样到凝胶上。
使用Qiaquick凝胶提取(Qiagen)，通过最低UV辐射从凝胶上分离选择的带。连接所有连接是用T4 DNA连接酶在由生产商(Amersham生命科学)所提供的反应的缓冲液(66mMTris-HCl，pH7.6，6.6氯化镁，10mM二硫苏糖醇，66μMATP)中进行的。用1个单位的T4连接酶连接具有粘性末端的片段，而平端片段用5单位的酶连接。
为了避免开放质粒的分子内再连接，用从嗜冷小虾Pandalusborealis中提取的碱基磷酸酶(Boehringer M)进行处理。这种酶能催化所述质粒DNA上的5’磷酸的脱磷酸化作用，但通过在加热到60℃保持15分钟容易避免对随后进行的连接的干扰。转化所有质粒用于转化并且在超级感受态TOP10 One ShotTM细胞(Invitrogen)基因型中繁殖F mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80/acZΔM15Δ/lacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara-leu)7697 galUgalK rpsL endA1 nupG。
将50微升超级感受态细胞与1-5微升连接混合物仔细混合，并在冰上培养30分钟，然后进行30秒的热激，然后在冰上恢复2分钟。最后添加250微升SOC培养基，并在37℃下在定轨摇床上培养所述细胞30分钟，然后将其铺在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板上。聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应是基于特定DNA序列的体外扩增的技术，它利用该序列旁侧的合成的引物和热稳定性DNA聚合酶(例如，TaqDNA聚合酶)进行DNA的复制。
有多种PCR技术被广泛用于本研究中，例如，热启动、TouchDown、LongPCR、嵌套PCR和测序PCR。为了优化PCR反应，采用PCR optimizerTM试剂盒(Invitrogen)。该试剂盒包括具有四种不同pH值的16种缓冲液，各自具有一定范围的四种不同的镁离子浓度，并且便于优化PCR反应。
使用以下聚合酶●AmpliTaq GoldTM(Perkin-Elmer)●ExpandTM高保真PCR系统(Boehringer M)●Taq DNA聚合酶(Pharmacia生物技术)ExpandTM高保真PCR系统是Taq和Pwo聚合酶的聚合酶混合物，它被设计用于扩增以高的专一性扩增高达12kb的PCR产物。Taq具有5’→3’转移酶活性，并产生具有单一3’A突出末端，而Pwo具有3’→5’外切核酸酶活性，并且能产生具有平端的产物。
除了循环测序之外，本文所报导的所有PCR反应使用热启动技术，它能降低在低温下引物与模板上配对较差的位点的结合，并且减少随后扩增在第一轮反应中所形成的假的延伸产物。这一目的是通过避免在大体上的模板变性时期之前防止聚合而实现的，并且是根据聚合酶的类型以两种不同的方式实现。
当使用ExpandTM或AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶时，将一个蜡丸放在含有除了聚合酶之外的所有成分的反应混合物上。以95℃的温度用2分钟时间熔化所述蜡丸，然后冷却到4℃，这会导致蜡的硬化，在该反应混合物顶部形成一个薄的表面，在该表面上添加1微升聚合酶，然后将该试管放入事先预热到95℃的热循环仪中，并马上启动PCR程序。
AmpliTaq GoldTM是一种热激活的聚合酶混合物，它能够进行热启动，没有将聚合酶放在固体蜡表面的不方便之处。所提供的这种酶上结合有失活的抗体，该聚合酶是通过初步的加热步骤激活的，通过使抗体变性使得这种酶活化。这样能够进行热启动PCR，而没有将聚合酶放在固体蜡表面的不方便之处，并且变性时间明显较长，因此也更充分。在上述反应中，所有成分是与蜡丸一起加入的，并且按上述方法启动反应。
当需要扩增长的PCR产物时，需要增加所述PCR程序中延伸步骤的时间。
PCR反应是在Mastercycler(Eppendorf)中进行的。
上述反应的一个典型的例子归纳在下面的表中。
秒”，而分钟’PCR产物的克隆将分离的PCR产物克隆到以具有单一的3’-T突出端和TOPO异构酶的线性化片段形式提供的pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。该系统利用了Taq聚合酶在扩增产物两端添加单一的突出3’-A末端的倾向。TOPO异构酶同时具有裂解和连接活性，它能裂解该载体的CCTTT位点，从而产生单一3’-T突出末端，它能与具有单一5’-A突出末端的PCR产物重新连接。因此该系统能够克隆Taq扩增的PCR产物，而不必用T4连接酶进行连接。
pCR2.1-TOPO的克隆位点位于lacZ基因的断裂基因座上，这样可以通过在存在β-半乳糖苷酶(x-gal)的生色底物的条件下通过兰色/白色筛选选择具有插入片段的克隆。通过限制性消化、PCR和/或测序分子来自白色克隆的微量制备DNA。
用酶消化某些PCR片段，并直接克隆到质粒载体上，不进行亚克隆步骤。当用这种方法通过限制酶能产生粘性末端，并用于直接克隆时，可以实现对时间的明显的节省。引物相关的引物在下面所提供的表中示出。
测序用ALFexpressDNA测序仪对RSus3启动子区进行测序。ALFexpressDNA是为了自动检测通过电泳分离的荧光标记的DNA分子而设计的。
用pCR2.1-TOPO载体的Cy5标记的荧光M13反向和正向引物对克隆的PCR产物的5’和3’末端进行测序。除了Cy5标记的测序引物之外，还利用公开的OLIGOTM程序-Windows5.0版(国家生物科学公司，Plymouth，Ma)设计了针对RSus3启动子区的特定区域的引物。测序材料●ALFexpressTMDNA测序仪(Pharmacia生物技术公司)●热测序酶荧光标记引物循环测序试剂盒，具有7-脱氮-dGTP(Amersham Pharmacia生物技术)●ReproGelTMLong Read，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用ALF
家族的仪器(Amersham Pharmacia生物技术)●ReproSetTM，用于ReprogelTM的紫外线聚合(AmershamPharmacia生物技术)●ALFwinTM序列分析仪2.00，由基于Windows95的程序控制AFLexpress(Amersham Pharmacia生物技术)在热循环反应中进行双脱氧终止子测序，该反应使用由AmershamPharmacia生物技术提供的特殊突变型聚合酶ThermoSequence，选择这种聚合酶是为了能接受荧光标记过的引物，并具有对四种双脱氧链终止子相等的亲和力。通过在该反应中使用7-脱氮-dGTP限定凝胶上的带压缩。序列分析利用F.G.Hansen(微生物学系，DTU，丹麦)所开发的Winseq1.0基组装所得到的序列。在进行上述初步的序列组装之后，用相同的程序进行序列分析。从水稻基因组DNA中分离RSus3启动子区用由Siebert等1995所披露的染色体步行技术从水稻基因组DNA分离水稻蔗糖合成酶3(RSus3)启动子区，这是一种为了扩增已知序列旁侧的未知序列而设计的接头介导的PCR方法。
首先用能产生平端产物的酶消化基因组DNA(Dral，EcoRV、PvuII、ScaI或SspI)，在所述产物连接接头。结果产生了5个DNA文库，可将其用作PCR的模板，使用一种对已知序列专一的引物和对接头专一的引物有关内容披露于Siebert等(同上)的文献中。
提供了接头序列和接头引物(AP1)以及嵌套接头引物(AP2)。将所述接头设计成在其3’末端有一个氨基基团。它可以避免从AP1引物结合位点开始扩增，除非已经从诸如基因专一性引物开始进行了最初的一轮扩增[Siebert等1995]。
所述接头整合了两种特征，它能确保在两个末端都具有接头结合位点的模板不被扩增。首先，由于在该接头3’末端的氨基基团，避免了通过延伸下部链的3’末端而产生AP1引物结合位点。因此，在PCR中形成AP1引物结合位点的唯一情况是从结合在该限制片段内的一个引物上进行了最初的一轮扩增。其次，可以抑制通过由AP1开始的非专一性启动所产生的模板的扩增。以这种方式所产生的片段在单链产物上含有颠倒的末端重复，它将形成一种二级分支环结构，它比模板引物杂合体更稳定。分支环结构的形成能避免引物退火，这样能抑制非专一PCR产物的扩增。通过用嵌套PCR引物再次扩增该产物可以进一步提高该方法的专一性。基因组DNA的制备从水稻中获得基因组DNA。用20单位的下列任一种平端酶在50微升的总体积中消化微克上述DNADral，EcoRV、PvuII、ScaI或SspI。
让消化产物通过酶清除柱(Amicon)，并通过醇沉淀浓缩，然后溶解在20微升TE中。
通过在22微升的总体积中混合Oligo1和Oligo2各800皮摩尔制备所述接头。通过加热到94℃1分钟使该混合物变性，并转移到冰上。用T4 DNA连接酶连接过量的接头和平端消化产物。让4微升接头和13微升的消化产物与10单位的T4 DNA连接酶在30微升的总体积中混合，并在室温下培养24小时。
在连接之后，用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)除去过量的接头，它能回收大于100bp的PCR产物，因此也能除去过量的接头。RSus3启动子区的PCR筛选为了分离RSus3启动子区，设计了以下序列专一性引物5’-ACG ACG GAA TGG ATA ATA GCA GAT A-3’该反义引物的3’末端与RSus3的ATG下游大约300bp退火。
以热启动方式在Mastercycler(Eppendorf)中进行扩增，它是一种两个步骤的PCR(68/94℃)。为了确保最佳产物长度，并限制误差，使用校正热稳定DNA聚合酶混合物ExpandTM(Boehringer M)。
为了进一步优化扩增，进行具有一种嵌套引物的PCR。在最初的PCR(引物对为AP1/RSus3)之后，用最初的扩增产物作模板进行二级半嵌套扩增(引物对为AP2/RSus3)。
所述最初PCR的组成和反应条件归纳在下面的表中
分钟’和秒”为PCR optimizerTM试剂盒(Invitrogen)选择缓冲液E、F、G、和H，以便优化缓冲条件。
按下表所示进行半嵌套PCR
分钟’和秒”
与SalI相容，并且由于在RSus3上面不存在内部XhoI位点，该XhoI位点表示所有天然RSus3片段的5’末端。
测序发现，RSus3上ATG起始密码子周围的序列是CAATGG。将NcoI(CCATGG)引入ATG周围的共有序列只能影响单一的碱基对。因此，为了产生该启动子区的3’末端，将RSus3Nco引物设计成在ATG起始密码子处有NcoI位点，以便使扩增的启动子片段与pGUSNOSt上的uidA基因进行翻译融合。
为了扩增两种RSus3片段(1450bp和2700bp)，使用引物对M13正向/RSusNco，并且由pSspK3和pScaK3扩增RSus3片段。让M13引物与pSsp和pSc克隆的pCR2.1-TOPO部分退火，该部分距离克隆位点大约110bp。
按照以下方案扩增两种RSus3片段
pSspK3或pScaK3的Qiagen微量制备将所得到的产物克隆到pCR2.1-TOPO上，然后再以XhoI/NcoI片段形式亚克隆到pGUSNOSt上。通过对微量制备DNA进行限制作图鉴定阳性克隆。尽管pGUSNOSt是用SalI和NcoI线性化的，在连接之前要对该载体进行磷酸酶处理，以避免仅由一种酶裂解的质粒再次连接，这种连接是由于SalI和NcoI位点挨的很近(G/TCGA/CATGG)。
用E357/E356引物对以266bp片段形式扩增来自pDB2的NOS终止子，所述引物对各自含有一个位于退火区5’一侧的EcoRI。将扩增的片段克隆到pCR2.1-TOPO上，鉴定阳性克隆，被命名为pNOSt9。用通用和反向测序引物(pCR2.1-TOPO)从两个方向对它进行测序，并用BLAST在Entrez检索机器上工作证实所得到的序列。用EcoRI从pCR2.1-TOPO上切除NOSt，并克隆到该酶在pGUSN358→S上的独特位点上，通过PCR用引物对E357/pGUSlower检测该片段在pGUSN358→S上的取向是正确的，并用引物对E356/pGUSlower检测其反向取向(350bp的产物)。选择具有正确取向的NOSt的克隆，并命名为pGUSNOSt2(5253bp)，以下将称之为pGUSNOSt，而选择反向NOSt克隆，并命名为pGUSNOSt1。RSus3启动子克隆在pGUSNOSt上最初的目的是将尽可能多的RSus3启动子克隆到pGUSNOSt上，而不对启动子序列作任何改变。
RSus3启动子的限制作图具有以下特征1.内部HindIII位点，在ATG密码子上游大约1200bp。
2.PstI位点存在于源于用ScaI消化过的水稻DNA模板的克隆中(pSca克隆)，但不存在于SspI消化过的克隆中(pSsp克隆)。
3.在pSca和pSsp克隆中都存在若干SphI位点。
4.在任何克隆片段上都不存在SalI和NcoI位点。
以上特征限制了用于将RSus3启动子克隆到pGUSNOSt上的独特的限制位点。只有SalI和NcoI可用于克隆RSus3启动子。
克隆的策略是制备两个具有与SalI和NcoI位点相容的末端的RSus3上游片段(1450bp和2700bp)，以便进行RSus3启动子和uidA基因的定向和翻译融合。该克隆策略示于图5中。
来自染色体步行技术的接头含有XhoI位点，因此，pSsp和pSca克隆上的分离的RSus3启动子都含有位于该启动子区5’末端的XhoI位点。通过用XhoI裂解所产生的突出末端与SalI相容，并且由于在RSus3上不存在内部XhoI位点，该XhoI位点表示所有天然RSus3片段的5’末端。
测序发现，RSus3中的ATG起始密码子周围的序列是CAATGG。将NcoI(CCATGG)引入ATG周围的共有序列，只会影响一个碱基对。为了产生该启动子区的3’末端，将RSus3Nco引物设计成有一个NcoI位点位于ATG起始密码子处，以便使扩增的启动子片段与pGUSNOSt上的uidA基因进行翻译融合。
为了扩增两种RSus3片段(1450bp和2700)，使用引物对M13正向/RSus3Nco，并从pSspK3和pScaK3上扩增RSus3片段。让M13引物与pSsp和pSca克隆上的pCR2.1-TOPO部分退火，该部分距离克隆位点大约110bp。
按照以下方案扩增以上两种RSus3片段
pSspK3或pScaK3的Qiagen微量制备将所得到的产物克隆到pCR2.1-TOPO上，然后以XhoI/NcoI片段形式亚克隆到pGUSNOSt上。通过对微量制备DNA进行限制作图鉴定阳性克隆。尽管pGUSNOSt是用SaII和NcoI线性化的，在连接之前要对该载体进行磷酸酶处理，以避免仅由一种酶裂解的质粒再次连接，这种连接是由于SalI和NcoI位点挨的很近(G/TCGAC/CATGG)。
一个阳性1450bp的克隆被命名为“p1450”，而一个阳性2700bp的克隆被命名为“p2700”。RSus3启动子的缺失为了鉴定克隆的启动子区的能产生活性和专一性的部分，我们对克隆的片段进行了分子解剖，我们从有关DNA序列上被示为含有基序的部分进行了一系列的缺失，所述基序是在其他基因的启动子上鉴定的。
RSus3启动子的缺失的产生包括对来自该启动子区的特定部分进行PCR扩增，并将所述片段克隆到基于p1450结构的结构上。确定启动子的所有截短都在TATA框的上游，它位于距离翻译起始密码子5’末端989bp处，并且在内含子1上游大约100bp。这种方法提供了保留或者是随后从结构上去掉内含子1的选择，同时集中缺失存在所有被认可的启动子基序的区域。
如上文所述，在pGUSNOSt MCS上只有有限数量的限制位点可用于截短的启动子插入片段的克隆。实际上，在所得到的克隆的pGUSNOSt部分上没有留下单一的位点。不过，在克隆的1450bp和2700bp片段的接头部分有多个限制位点。
在p2700和p1450结构的RSus3部分仅有少数的限制位点是单一的。其中，只有BamHI、BglII、BsiVVI和ClaI能产生粘性末端，因此有利于克隆，不过，BamHI位于内含子1下游，而BglII位于它内部。另一方面，BsiVVI和ClaI位于距离MSC仅300-400bp处，因此，仅留下可以被截短的很少的序列。
因此，由于缺乏可以使用的克隆位点，导致了以下方法的形成通过部分消化将MCS HindIII位点转变成NheI位点，然后用Klenow补平，并对所得到的平端片段进行重新连接。然后，可以将具有NheI/HindIII位点的PCR扩增片段可以直接克隆到所产生的单一的NheI和HindIII位点上。
该方法具有若干优点，尽管它十分烦琐。
1)产生了一种标准的测试质粒，它含有单一的NheI和HindIII位点，可将PCR扩增产物直接克隆到它上面。
2)从所有截短的克隆上获得的HindIII/NcoI片段的序列都相同，从而避免了在该部分由于PCR产生的突变而出现的可能的变异。为了直接克隆PCR缺失而进行的HindIII→NheI的转变将MCS HindIII位点向NheI位点的转化包括用HindIII进行部分消化，用Klenow片段补平其5’单链突出末端，并进行再连接，从而形成NheI位点。用HindIII进行部分消化反应条件根据经验确定，使用下面表格中所示范围的酶的稀释液，并通过在25℃下，而不是37℃下进行反应降低反应速度。部分消化的反应方案
稀释液0.25微克/微升质粒和0.02单位/微升HindIII在25℃下在Mastercycler(Eppendorf)中培养部分消化物15分钟，然后在65℃下培养10分钟。在1％Seakem琼脂糖凝胶上评估所得到的结果，样品2和3产生了最佳结果。在以上两个样品中有4条带，两条带来自未裂解过的质粒，一条带来自单用HindIII裂解，而一条弱的带来自裂解两个HindIII位点。后一条带在随后的样品中的强度得到增强，其代价是缺少了所述单一裂解带。
在连接之前用DNA聚合酶I大片段(Klenow)(NEB)填充部分HindIII消化过的1450bp的结构。在有dNTP’s的条件下，Klenow片段能保持EcoRI DNA聚合酶I的聚合真实性，而不会降解5’末端。按以下方法进行Klenow片段处理14微升部分消化过的质粒2微升10mMdNTP混合物(Invitrogen)0.6微升NE缓冲液2(NEB)2.9微升水0.5微升Klenow片段(NEB)该反应物在25℃下培养15分钟，并在75℃下培养10分钟。在所述补平反应之后，从凝胶中分离单一切割过的质粒带，连接并分离阳性克隆。该方法产生了两种不同类型的克隆，一种具有上游NheI位点(p2700(上游NheI)1和3)，另一个具有下游NheI位点(p2700(下游NheI)7和10)。尽管后一种类型的克隆不适合进行启动子截短研究，但它随后可用于构建启动子基序的串联重复。
另外，用相同的方法将不含有RSus3序列的亲本质粒pGUSNOSt的MCS上的HindIII位点改变成NheI位点，以便形成pGUSNOStNheI2和3，不过，理所当然的是没有必要对该质粒上单一的HindIII位点进行部分消化。在p2700上克隆三种RSus3缺失(上游NheI)参见图6。
使用具有不同的上部引物但具有相同的下部引物的三个引物对产生三种缺失Nhedel1/Dellow1、Nhedel2/Dellow1和Nhedel3/Dellow1，将Nhedel1-3引物设计成具有NheI位点，而将Dellow1引物设计成与内部HindIII位点的下游退火。因此上述引物对导致了三种不同PCR产物的产生(650bp、590bp和480bp)，以2700bp结构为模板，各自具有NheI/HindIII位点，以便克隆在p2700(上游NheI)上。
扩增是以下表所示二步PCR(68/94℃)形式在Mastercycler(Eppendorf)中进行的。
将PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO上，并通过限制作图鉴定阳性克隆。从阳性克隆上分离NheI/HindIII片段，并克隆到p2700(上游NheI)1上。
鉴定了三个阳性克隆，并命名为“p1730”克隆3，“p1670”克隆3和“p1560”3。P1160结构参见图7。
该缺失是通过用HindIII裂解p2700结构所产生的。对该载体进行重新连接，并将两个阳性克隆命名为“p1160”克隆1和2。P2700-谷醇溶蛋白结构参见图8。
尽管上述所有RSus3缺失都是5’末端缺失，但该截短包括在RSus3启动子上位于内部HindIII位点和TATA框之间的161bp的内部缺失。根据RSus3序列，设计了用于扩增1020bp片段的引物对(RSusTATA/RSusNco)，HindIII位点在一个末端，而NcoI位点位于另一个末端。因此，该产物包括其旁侧为TATA框和ATG翻译起始密码子的内含子1。引物RSusTATA包括一个内部HindIII位点，并且与TATA框上游退火。引物RSusNco含有一个位于ATG起始密码子处的NcoI位点，用于使扩增的启动子片段与uidA基因进行翻译融合，与上述第五部分中的内容相同。
在Mastercycler(Eppendorf)中进行反应之后，以两步PCR(68/94℃)形式进行PCR反应
通过PCR产生1220bp的HindIII/NcoI产物，并克隆到pCR2.1-TOPO上。鉴定阳性克隆，并将HindIII/NcoI片段克隆到2700bp片段上(上游NheI)(用HindIII和NcoI线性化，以便取代相应的1160bp的片段)。分离阳性克隆，并命名为“p2700-谷醇溶蛋白”克隆1。去掉RSus3启动子区上的内含子1为了产生缺乏内含子1的启动子，首先考虑在水稻cDNA文库中筛选RSus3克隆5’非翻译区，并将其剪接到已经克隆的上游启动子基序上。不过，序列分析发现，内含子1的3’受体剪接位点位于ATG-密码子上游仅27bp处。因此，一种优选方案是，将该27bp下游非编码外显子的序列整合到下部链PCR引物上，用于扩增该启动子。
参见图9。
设计引物对，以便PCR扩增来自pSca和pSsp克隆的RSus3启动子区。下部引物(Lowexon1/2)的设计如下该引物的3’末端相当于内含子1上推测的5’剪接位点上游的24bp的序列，该引物的5’末端相当于3’剪接位点和ATG密码子(NcoI)之间的27bp的序列。将上部引物UppCR2.1设计成与pCR2.1-TOPO的44bp的序列退火，位于M13反向引物位点上游，以便从pSca和pSsp克隆上扩增没有内含子的RSus3启动子。
这两种引物都相当长(Lowexon1/2为56bp，而UppCR2.1为44bp)，并确保它具有完整长度，对其进行顺序HPLC纯化。UppCR2.1具有以56℃的解链温度形成发卡环的可能性，并有一个内部BamHI位点形成一种稳定的引物二聚体，因此该PCR扩增是用AmpliTaq Gold和两步程序进行的(68℃/94℃)。
由于这种长的引物具有在其3’末端形成部分错配双链二级结构的潜力，用AmpliTaq Gold代替ExpandTM聚合酶，以便避免校正Pwo聚合酶对该寡核苷酸的修饰。结果得到了具有正确大小的非常微弱的带，因此用纯化的产物作模板，用M13反向/RSusNco进行半嵌套PCR扩增。
这种嵌套PCR得到了一条更强的带，将其克隆到pCR2.1-TOPO上。鉴定阳性克隆，并将XhoI/NcoI片段克隆到pGUSNOSt上(类似于来自pScaK3和pSspK3的XhoI/NcoI片段的亚克隆)。将阳性克隆命名为“p1450-内含子”克隆2。制备串联重复RSus3启动子为了增强RSus3启动子的活性，将RSus3中的TATA框上游的多种序列加倍。该方法得到了三种串联重复的RSus3启动子，其中，将RSus3启动子区的不同部分加倍了。
参见
图10。
DNA序列分析是在700bp内的推测的顺式因子的主要部分进行的(-1709bp至-1027bp)，在TATA框上游。因此，这700bp含有要加倍的因子。
通过扩增该启动子的特定序列构建上述三种串联重复启动子，将其克隆到pCR2.1-TOPO上，并最后将克隆的片段亚克隆到p1730结构上的NheI位点或HindIII位点上。串联的豆球蛋白用与p1730上所述NheI/HindIII产物相同的方法扩增串联的豆球蛋白启动子上的重复的序列，不过用p2700(下游NheI)作模板。由此得到一种类似的产物，它仅有两个NheI位点，在将其克隆到pCR2.1-TOPO上之后再以NheI片段形式克隆到p1730的NheI位点上。通过NheI消化鉴定阳性克隆，并通过用该亚克隆作模板进行重复PCR确定其方向。所得到的克隆被命名为“pTandem豆球蛋白”。pTandem leg/pro以类似方法构建这种串联重复启动子。设计一个引物对，以便扩增来自p2700结构的750bp的片段。该引物对各自具有一个NheI位点(Nhedel1用于p1730，和NheGCN4)。再次进行引物对Nhedel1/NheGCN4的扩增，按照与p1730结构相同的方法进行，并得到了750bp的产物(在两端具有NheI位点)，将其克隆到pCR2.1-TOPO上，然后亚克隆到p1730结构的NheI位点上。通过限制消化鉴定阳性克隆，并用相同方法确定其取向，将该克隆命名为“pTandem leg/pro”。pTandem谷醇溶蛋白用几乎与pTandem leg/pro相同的方法制备该串联重复的启动子。该引物对具有相同的上部引物和具有HindIII位点的类似的下部引物(HindGCN4)。将所得到的产物克隆到pCR2.1-TOPO上，并将来自于它的170bp的HindIII/HindIII片段亚克隆到p1730结构的HindIII位点上。通过限制消化鉴定阳性克隆，并通过用该亚克隆作模板进行重复PCR确定其取向。所得到的克隆被命名为“pTandem谷醇溶蛋白”。用粒子输入枪(PIG)进行瞬时轰击转化用于本研究的粒子输入枪(PIG)如Finer等1992和Vain等1993所述。PIG-它被放置在无菌工作台上，以便减少污染-包括一个具有数字真空传感器的真空腔，一个连接在氦气筒调节器上的电力操纵的电磁阀气体阀门(1-16巴)，以及一个连接在真空泵上的三通阀门。由所述电磁阀调节氦气流，并通过一个定时继电器操纵。它能使脉冲形式的选通流动下降到25毫秒。PIG是通过一个具有定时继电器、数字显示真空计和点火按钮的控制面板操纵的。
所述真空腔由3毫米不锈钢制成，具有20毫米的丙烯酸门和10毫米厚的聚丙烯内衬，具有间隔20毫米的槽以便安放支架。在所述腔和门之间用硅氧烷泡末垫圈密封该真空腔。
在初步的实验中用类似于PIG的轰击转化装置检验通过粒子轰击转化瓜尔豆胚乳的可行性。制备用于转化的瓜尔豆组织本研究中粒子轰击主要目标是瓜尔豆胚乳，不过也要将发芽的和发芽之前的子叶以及新生的叶片用作对照组织。胚乳和发芽的子叶是从3-4周龄瓜尔豆豆荚中分离的，与发芽之前的子叶是从12和20日龄体外生长幼苗上收获的，而新生叶片是从成熟的瓜尔豆植株上收获。瓜尔豆组织的分离在无菌条件下按以下方法从瓜尔豆种子中分离胚乳。
将消过毒的瓜尔豆豆荚打开，并取出种子。将每一粒种子上的外衣小心地剥去，并将其余部分分成胚乳和胚胎。将胚乳分成相等的两半，并将这两半的突出的背侧作为粒子轰击的靶表面。这种平分和方向减少了氦气轰击组织的分散。发芽前的子叶是从胚胎上分离，而发芽后的子叶是从按照12小时白天/黑夜方案在体外生长的幼苗上分离的。从生长完全的植株上切除幼小的瓜尔豆叶片。
将分离的组织转移到装有固体琼脂糖培养基和滤纸片的60毫米培养皿上(参见1.4.3节)。组织的放置如下将胚乳放在培养皿中央，使背面向上；来自幼苗的子叶放在培养皿中央上面一侧向上；胚胎子叶与胚乳一起。
粒子轰击实验包括用每一种结构进行5-6次重复的轰击。PIG每一次放电对6-8个胚乳，2-3个来自幼苗的子叶，或6-7个胚乳和4-5个发芽前的子叶进行轰击。为了进行比较分析，在同一个实验中对子叶和胚乳进行轰击。瓜尔豆组织的消毒在转化中不使用抗生素，因此必须避免微生物污染。因此，严格的消毒过程是非常重要的。
按以下方法对来自成熟的瓜尔豆植物的瓜尔豆豆荚进行消毒在无菌水中洗涤豆荚，在96％的乙醇中浸泡1分钟，最后用无菌水洗涤3次。没有必要对瓜尔豆豆荚和种子作进一步的消毒。
按以下方法对来自成熟的瓜尔豆植株的新生叶片进行消毒在无菌水中洗涤叶片，在96％的乙醇中浸泡10秒，并在0.15NaOCl和0.05％Triton X-100中浸泡20分钟。最后用无菌水洗涤叶片3次，并保存在水中待用。
来自体外生长的幼苗的子叶是无菌的，因此没有必要进行消毒。培养基在以下培养基上轰击并培养所述组织。该培养基是固体培养基，并且以Donovan&Lee1977的配方为基础，对成分的浓度作了一些改进。
1MS基础盐混合物M5524粒子轰击方法按以下所述完成本研究中的粒子轰击实验。金颗粒的DNA包衣用单一质粒进行的典型的转化，包括用PIG进行5次重复放电，采用3毫克金颗粒。在实践中，每一次要新制备比这一用量更大的一批金颗粒，并在随后马上用于若干次转化。对下面所披露的用于制备3毫克金颗粒的方法进行调整，以便其用量和体积随着材料的数量成比例的增加。
1.用50微升99.9％的乙醇(Danisco Distillers)处理3毫克金颗粒(1.6微米，Biorad)。
2.在乙醇中涡旋搅拌金颗粒3分钟(最大速度)，并以10000g离心1分钟。
3.除去上清液，并重新悬浮在50微升无菌水中。
4.以10000g离心颗粒1分钟，除去上清液，并用水反复洗涤。
5.将颗粒重新悬浮在50微升50％w/v甘油(无菌)中。
然后按以下方法用质粒DNA对所述金颗粒进行包衣。
1.在一台热搅拌仪(Eppendorff)上进行涡旋搅拌(14000/分钟)，并在搅拌期间除去50微升金颗粒悬浮液。
2.在对这50微升金颗粒样品进行涡旋搅拌(14000/分钟)过程中，依次添加以下成分。
10微升质粒(10微克/微升)50微升2.5M氯化钙20微升0.1M亚精胺3.以16000/分钟的速度继续涡旋搅拌3分钟。然后以10000g使该样品沉淀10秒，并除去上清液。
4.将该样品重新悬浮在250微升99.9％的乙醇中，并以相同的离心力离心10秒。
5.除去上清液，并将颗粒重新悬浮在40微升99.9％的乙醇中。
6.将DNA包衣过的微颗粒保存在冰上待用。
由于金颗粒在水溶液中有发生不可逆转的聚合的倾向，必须在即将使用之前制备[Kikkert1993]。氯化钙可以在4℃下保存，但亚精胺(N-[3-氨基丙基]-1，4-丁二胺)脱氨，因此，必须每个月新制备溶液，并在-20℃下保存。
在该包衣方法中使用亚精胺的目的是通过屏蔽DNA磷酸主链上的负电荷因而使得疏水性相互作用占主导地位而使得DNA缩合[Bloomfield1991]。操纵PIG按以下方法操纵PIG1.将装有靶组织的培养皿(直径60毫米)放入真空室中。
2.将不锈钢网(250微米-网，直径13毫米)放入过滤装置中。
3.将5微升DNA包衣的微颗粒悬浮液加到所述钢网的中央。
4.组装所述过滤装置，并与氦气电磁阀连接。
5.将250微米-目不锈钢保护屏放在培养皿顶部。
6.关闭舱门和阀，并开始对所述室抽真空。
7.当正好达到所需要的真空度时通过按下点火按钮释放氦气冲击。
8.通过打开排气孔解开真空，并取出组织。
9.重复以上过程，直到所有样品都受到了轰击。在用每一种新的结构进行轰击时更换过滤装置、不锈钢网和防护屏。轰击条件用以下轰击条件对瓜尔豆胚乳、胚胎、和子叶进行轰击转化取得了良好结果。
●将真空室抽真空到0.1巴的部分真空度。
●将靶组织放置在从过滤装置中的网到靶组织16厘米处。
●将调节器上的氦气压力设定为5巴。
●将时间继电器设定为50毫秒。
●将不锈钢防护屏(250微米-目)放置在靶组织上方大约2厘米处。
●用直径为1.6微米(Biorad)的金微颗粒携带质粒DNA。轰击之后在轰击之后，密封装有轰击过的组织的培养皿，并在25℃下培养48小时。胚乳和胚胎在黑暗中培养，叶片和子叶按照12小时白天/黑夜的方案培养。GUS测定按照Jefferson1987所披露的方法进行组织化学GUS测定。在以上培养时期时候，将轰击过的组织转移到微量滴定板上，浸泡在GUS测定缓冲液中，并在37℃下，在黑暗中培养24小时。
GUS测定缓冲液100mM磷酸钠缓冲液pH7.50.5mM氰铁酸钾(III)0.5mM氰亚铁酸钾(II)10mM EDTA二钠(三联体III)1.9mM X-Gluc采用Knudsen&Muller的方法通过记数兰色斑点测定GUS表达，并因此测定启动子活性。在轰击、培养和GUS测定之后，在显微镜下记数兰色斑点(表达单位)，并以相对检查的面积的形式表示。
通过若干洗涤步骤用96％的乙醇清洗子叶和叶片，并在70％乙醇中保存，直到记数兰色斑点。
胚乳上的兰色斑点必须在GUS培养基之后马上记数。既不能在醇中也不能在水中保存，因为半乳甘露聚糖和水的含量很高。水会导致胚乳膨胀，而乙醇会导致胚乳收缩。这种变化会破坏在胚乳表面上的表达形式。蔗糖合成酶在瓜尔豆胚乳中的存在通过连续的蔗糖合成酶测定在来自瓜尔豆胚乳的提取物中证实了与种子充实吻合的蔗糖合成酶典型的随着发育的提高(参见
图11)。蔗糖合成酶测定的细节如下。蔗糖合成酶测定按照蔗糖裂解方向测定发育中的瓜尔豆胚乳中蔗糖合成酶的活性。在有UDP的条件下蔗糖合成酶能催化蔗糖裂解成果糖和UDP-葡萄糖蔗糖+UDP<＝>果糖+UDP-葡萄糖按照Keller等所披露的方法(KellerF，Frehner M&Wiemken A(1988)蔗糖合成酶，耶路撒冷菊芋原生质体中的胞质酶，植物生理学88，239-241)通过在连续酶反应中监测UDP-葡萄糖的形成测定蔗糖合成酶的活性。在有UDP-葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.1.22)的条件下，UDP-葡萄糖的形成与NAD+的减少相关，它能催化UDP-葡萄糖氧化成UDP-葡糖醛酸UDP-葡萄糖+2NAD+H2O<＝>UDP-葡糖醛酸+2NADH从发育中种子上分离胚乳，合并并在Hepes/氢氧化钾缓冲液(20mM，pH8.00)中用旋转研棒匀浆。在此过程中，通过添加β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78，Megazyme)实现对半乳甘露聚糖主链的酶促降解。在20000g下将样品离心20分钟，并用SephadexG-25柱(NAPTM-5Pharmacia生物技术)对所得到上清液进行脱盐)，以便从粗制提取物中除去内源糖。
将合适量的酶提取物添加到蔗糖合成酶测定缓冲液中(1毫升)20mM HEPES/氢氧化钾(pH8.0)200mM蔗糖2mM UDP1.5mM NAD+20mU UDP-葡萄糖脱氢酶(Sigma)在NAD+还原成NADH之后，在分光光度计上在340纳米下连续测定吸收值(25℃，εNADH＝6300L/摩尔/厘米)。由所得到的吸收曲线的斜率计算所产生的UDP-葡萄糖的量(微摩尔/分钟)。用牛血清白蛋白作标准物，通过Biorad蛋白测定测定残留上清液中总的蛋白量，并计算蔗糖合成酶的比活性(每毫克蛋白的蔗糖合成酶单位数，或微摩尔/分钟/毫克)。
在来自开花之后7-41天的各个发育阶段的瓜尔豆胚乳提取物中测定蔗糖合成酶的活性。通过3-4个独立的测定得到每一个发育阶段的平均蔗糖合成酶活性，每一次测定是从同一个豆荚上的至少5个胚乳所获得的提取物进行的。
结果RSus3启动子区的分离用Siebert等1995所披露的染色体步行技术从水稻基因组DNA中分离水稻蔗糖合成酶3(RSus3)启动子区。在半嵌套PCR反应之后，在以下反应物中出现了三条带DraiI(≈700bp)，ScaI(≈3000bp)和SspI(≈1800bp)。
通过单引物对照反应证实了1800bp和3000bp产物是从引物对AP2/RSus3所获得的特定产物。
该单引物对照反应的结果表明，来自AP2/RSus3引物对的特定扩增的1800bp和3000bp不是单引物产物。来自AP2的单引物产物更像是由两种接头扩增的结果。
将1800bp和3000bp产物克隆到pCR2.1-TOPO上。分离1800bp连接的9个克隆和3000bp连接的7个克隆。用EcoRI限制作图表明，4个1800bp的克隆和6个3000bp的克隆具有在两个EcoRI之间的插入片段。
用对pCR2.1-TOPO专一的M13通用和反向测序引物对具有1800bp和3000bp插入片段的所得到的pCR2.1克隆进行部分测序。用Winseq程序中的排比特征将1800bp和3000bp克隆下游的序列与RSus3序列的公开部分进行比较[Huang等1996(GenBank保藏号L03366)]。
所有4个1800bp的克隆都被证实具有RSus3插入的转录区的上游部分(每一种方向有两个克隆)。将这些克隆命名为pSspA2，K1，K3和K4。
4个3000bp克隆也被证实具有RSus3插入的转录区的上游部分(出现了两种方向)。将这些克隆命名为pSca K3，K5New1和65New5。
参见图2。提供序列资料选择克隆pTBR-ScaK3(PscaK3)，对RSus3的启动子区进行全面测序。按照
图12所示出的测序方案对该克隆的两条链进行测序。
对上述其他阳性RSus3克隆进行部分测序，对RSus3克隆的测序导致了ATG密码子上游2700bp的测定(参见SEQ ID NO1)。DNA序列分析对RSus3启动子区的序列进行分析，寻找与基因表达调控有关的推测的顺式因子的存在。检查翻译起始密码子上游区的保守的TATA和CAAT共有序列的存在，并检查该区域中推测的胚乳或种子专一性因子的存在。
另外，检查TATA框和翻译起始密码子之间内含子供体和受体剪接位点的存在。
选择翻译起始密码子作为确定RSus3启动子中碱基的基础，即将ATG中的A编号为+1(例如，在CAATGG周围的碱基对被编号为-2，-1，+1，+2，+3和+4)。
对RSus3启动子区和来自RSus1的启动子区(GenBank保藏号X59046)和来自RSus2(GenBank保藏号X64770)的启动子区进行排比没有发现明显的相似性。
DNA序列分析的结果归纳在表1中(见上文)。GCN4框和三个胚乳框是与胚乳专一性有关的顺式因子，而豆球蛋白框是与组织专一性有关的顺式因子。另外，-1072bp胚乳框和GCN4基序构成了推测的谷醇溶蛋白因子，它也与胚乳专一性相关，尽管在RSus3上胚乳框和GCN4基序之间的距离比这大(34bp)，该序列表现出与所述共有序列有高的相似性。
GCN4框、两个胚乳框和豆球蛋白框的主要部分位于从-1023bp-1707bp之间的700bp内。这700bp的序列正好位于TATA框的上游。
在本文的图3中示出了RSus3启动子区的限制图谱。提供RSus3/GUS/NOSt结构在本研究中，将各种RSus3启动子序列与uidA基因融合，以便产生一系列RSus3/GUS表达框。构建RSus3启动子的特殊缺失，以便鉴定该启动子上与组织专一性相关的部分。构建一系列串联重复启动子，以便增强启动子活性，并从启动子区上去掉内含子1，以便确定它是否在瓜尔豆胚乳中表达所必需的。
所述结构是通过PCR或亚克隆扩增特定片段而产生的。为了证实所得到的结构，通常用HindIII、NheI和NcoI进行对照限制消化。另外，在某些场合下进行对照PCR或测序反应。
RSus3启动子的所有变体的共同特征是与uidA基因的翻译融合，TATA框的存在，以及下游的区域的保留(所不同的是从它上面去掉了内含子的单一结构)。这一系列的RSus3启动子结构集中在上游700bp区域周围，远离TATA框。如上文所述，该序列包括与专一性相关的推测的顺式因子的大部分。
各种RSus3启动子结构归纳在
图13中。p2700结构(质粒大小7938bp)首先构建2700bp的RSus3启动子。该结构构成了完整长度的RSus3启动子，并且是通过将来自pTBR-ScaK3的2700bp的XhoI/NcoI片段扩增到pGUSNOSt上的SalI/NcoI上制备的。通过NcoI/HindIII消化证实阳性克隆，由此得到两个特殊片段，其大小为1160bp和1540bp，另外还有来自pGUSNOSt部分的5230bp NcoI/HindIII片段。p1730结构(质粒大小6963bp)RSus3的这种5’截短是通过制备跨过-1160bp至-1730bp的571bpNheI/HindIII片段而构建的。将p2700上的上游HindIII位点转变成NheI位点之后，将所产生的NheI/HindIII片段亚克隆到该p2700上(上游NheI)。通过NheI/HindIII对照消化鉴定阳性克隆，由此得到了与亚克隆的片段大小相同的特定片段。p1670结构(质粒大小6907bp)该5’截短类似于p1730，包括一个515bp而不是571bp的NheI/HindIII片段，用相同的方法鉴定阳性克隆。p1560结构(质粒大小6791bp)该5’截短也类似于p1730，包括一个400bp而不是571bp的NheI/HindIII片段，用相同的方法鉴定阳性克隆。p1450结构(质粒大小6704bp)该结构类似于p2700，连接由pSspK3模板扩增的1450bp XhoI/NcoI片段，而不是连接来自pScaK3的相同的扩增片段。除了5230bp的pGUSNOSt片段之外，NcoI/HindIII消化产生了两种大小为1160bp和290bp的特殊带。p1160结构(质粒大小6390bp)该截短的启动子构成了内部HindIII位点上游1540bp的去掉，并且是通过用HindIII裂解p2700产生的，然后进行连接。通过HindIII消化鉴定阳性克隆，由此得到了阳性克隆中的单一片段。p2700-谷醇溶蛋白结构(质粒大小7777bp)这种161bp的内部截短是通过将含有TATA框的1020bp的片段扩增到ATG密码子上产生的。将该片段以HindIII/NcoI片段形式克隆到p2700上(上游NheI)。通过HindIII/NcoI消化证实阳性克隆，由此得到了大小为1000bp的特定片段和大小6770bp的片段。p1450-内含子(质粒大小5837bp)在该结构中，通过精确剪切推测的内含子受体和供体剪接位点除去内含子1。内含子1的这种内部缺失了通过扩增p1540的片段而产生的，它相当于缺少内含子1的RSus3。在克隆到pCR2.1-TOPO上之后，将含有它的XhoI/NcoI片段亚克隆到pGUSNOSt上。通过用HindIII/NcoI进行限制消化鉴定阳性克隆，并通过测序证实3’启动子末端。pTandem豆球蛋白(质粒大小7536bp)这种串联重复的启动子是通过PCR制备跨越-1160bp至-1730bp的570bpNheI片段而构建的。将该片段亚克隆到p1730上的NheI位点上。通过对照消化鉴定阳性克隆，并用Nhedel1/Dellow1进行对照PCR反应证实其方向。正确的取向会得到大小为650bp和1300bp的两条带，而相反的取向只能得到650bp的产物。pTandem leg/pro(质粒大小7704bp)这种串联重复启动子是通过PCR扩增跨越-990bp-至1730bp的740bpNheI片段而构建的。将该片段亚克隆到p1730上的NheI位点上。通过NheI消化鉴定阳性克隆，并用HindIII消化确定具有合适取向的克隆。这可能是由于该启动子中的内部HindIII位点，它在结构上是重复的。正确的取向会产生740bp的HindIII片段，而反向取向会产物114bp的HindIII片段。pTandem谷醇溶蛋白(质粒大小7135bp)这种串联重复启动子是通过PCR制备跨越-990至-1160bp的170bp的HindIII片段而构建的，将其亚克隆到p1730的HindIII位点上。通过对照消化鉴定消化阳性克隆，并通过对照PCR确定正确取向。用引物对Nhedel1/HindGCN4扩增得到了具有正确取向的克隆的600bp和750bp的两条带，并且得到了具有反向取向的克隆的300bp和750bp的两条带。
参见
图15。瞬时表达实验将上述RSus3表达框用于通过粒子轰击技术实施瓜尔豆组织的瞬时转化。
上述实验是为了得到若干目的。首先，要测试用于制备瞬时转化的瓜尔豆组织的方法的用途。其次，其目的在于在Danisco生物技术，Holeby建立并优化粒子输入枪(PIG)。最后，其主要目的是评估诸如RSus3的启动子在瓜尔豆组织中的强度和专一性。对照通过对照实验，构建了含有与ENOS启动子融合的uidA基因的对照质粒。众所周知，ENOS启动子在胚乳和叶片组织中具有高水平的表达。RSus3/GUS/NOSt在瓜尔豆组织中的瞬时表达为了测试RSus3启动子区的启动子强度和专一性，进行了总共11个粒子轰击实验。在此期间测试了上述RSus3/GUS/NOSt结构。轰击的方法、制备瓜尔豆组织的方法以及对金颗粒进行包衣的方法如上文所述。
第一种方法是测试RSus3启动子在瓜尔豆胚乳中是否具有活性。将p2700和p1450轰击到瓜尔豆胚乳中，并且结果表明这两种结构在胚乳中都具有显著的GUS表达，不过其表达水平低于ENOS对照。上述结果大有希望，所以随后的工作主要是围绕该启动子进行。
第二种方法是测试RSus3对胚乳是否具有专一性或者它是否能在植物的其他部分表达。在用来自体外生长的幼苗的子叶进行的初步实验证实了p2700和p1450之间的表达的差异。p2700在子叶中几乎没有GUS的表达，而某些用p1450转化过的子叶具有明显较高的表达。
为了测试p2700和p1450的这种表达方式在叶片中是否相同，还将上述结构用于对来自成熟植株的新生叶片进行瞬时转化。这种转化被证实为困难的，因为氦气轰击会到叶片组织造成严重的损伤。不仅仅是RSus3的表达集中在叶片的维管组织，而且ENOS对照也表现出相同的表达方式，这表明有必要对叶片的转化方法进行优化。不过，由于时间的限制，后来放弃了这种优化实验，而代之以排它性地选择对来自幼苗和组织的子叶进行轰击。
由两种RSus3启动子结构p2700和p1450指导的瞬时GUS表达证实了对启动子强度和组织专一性的进一步分析。如上文所述，构建了RSus3启动子的一系列缺失，并在瓜尔豆胚乳、瓜尔豆胚胎子叶和来自12-20日龄幼苗的子叶上对其进行测试。另外，为了提高启动子的活性，构建了三种串联的启动子，并且用相同的组织进行了测试，以便评估启动子强度和组织专一性。
图16提供了来自对照ENOS启动子、RSus3启动子结构p1730和RSus3启动子结构pTandem leg/pro(串联重复)的瞬时GUS表达数据。其结果与上述在其他RSus3启动子结构上的发现吻合。以上结果证实了NOI的选择性胚乳表达。
在用RSus3结构轰击之后瓜尔豆胚乳中的瞬时GUS表达结果归纳在
图17中。
其结果表明，本发明的启动子能在胚乳中引起NOI的选择性表达。另外，本发明启动子的串联重复能导致表达水平的提高。
如
图17所示，在瓜尔豆胚乳中的表达仅受2700bp和1160bp之间序列的缺失的轻微影响。1160bp仍然具有显著表达这一事实表明，导致在瓜尔豆胚乳中表达的主要部分的顺式因子存在于1160bp和TATA框之间(÷989bp)。在p2700÷谷醇溶蛋白结构上除去了该部分，并且导致了与p2700相比启动子的活性降低了25％。
pTandem leg/pro在胚乳中能产生最高表达，比2700结构高3倍，并且其表达水平与NOS在胚乳中的表达相当。
在没有DNA的情况下用以相同方式处理过的微颗粒轰击瓜尔豆组织，以及在没有微颗粒的情况下进行PIG放电时没有观察到兰色斑点。用没有启动子的GUS结构(pGUSNOSt)轰击只产生了很少的兰色斑点，它可能是由非法重组到靠近启动子的染色体上而引起的。
为了对在胚乳和子叶中的表达进行比较分析，计算了相对轰击组织部位的值。平均为4周龄的胚乳包括0.2平方厘米的面积，而平均为发芽前的子叶具有相同的面积。平均为12日龄的子叶覆盖1.5平方厘米的面积，而平均为20日龄的子叶覆盖2.8平方厘米的面积。因此，将每12日或20日子叶的兰色斑点数对每0.2平方厘米的兰色斑点数进行校正。
图18表示只有Tandem leg/pro变体在启动子强度方面表现出高度显著的变化。尽管该结构引起的GUS表达的水平为亲本结构p2700的3倍，它保留了对胚乳的专一性。Tandem leg/pro变体在子叶中的表达水平与p2700一样低。共转化在轰击转化之后，通过测定瞬时基因表达所获得的数据的最大的变量在于将DNA输送到靶组织的效率的差别。业已证实，通过用一种含有不同报导基因的对照表达载体进行共转化可以弥补这一问题，并获得对瞬时基因表达的更精确的评估(Godon，C.，Caboche，M，Daniel-Vedele，F.1993，生物化学75591-595)。通过测定报导基因的活性，并以测试活性相对对照活性的比例形式表达，可以了解仅仅是由于轰击靶组织的DNA的量的差异所导致的波动。
同样用这种方法对RSus3启动子进行测试。用萤火虫荧光素酶基因(luc)作为报导基因与每一种变体融合，并按上述方法重复进行轰击转化，不过包括与测试质粒等摩尔量的两种对照质粒。在对来自同一个瓜尔豆种子的轰击转化的胚乳和发芽前的子叶进行的改进的瞬时表达研究中，测定了不同启动子结构的强度和组织专一性。每一个实验包括用三种独立的质粒同时进行转化。其中，一种质粒是测试质粒(p2700+内含子/luc+，p2700-内含子/luc+，pTandem leg/pro+内含子/luc+或pTandem leg/pro-内含子/luc+或pDB16/luc+)，其中，启动子与萤火虫荧光素酶基因融合(luc+)(
图19、20、21、22和23)。其余的两个质粒是对照质粒，其中，uidA(GUS)基因或renilla荧光素酶基因(pDB16/Rluc)受NOS启动子的控制(图24和25)。将2微克测试质粒与2微克每一种对照质粒混合，并用该DNA对颗粒进行包衣，制备、轰击、和随后的组织培养都是按上述方法进行的。
通过在液氮中研磨轰击过的组织，并用含有硼酸的缓冲液提取冷冻的浸出液用轰击过的组织制备酶提取物，硼酸能够阻止低温保存的材料中的半乳甘露聚糖发生胶凝。大约400毫克每一种组织用800微升的提取缓冲液(50mM磷酸二氢钠，50mM硼酸，1mM二硫苏糖醇，1mMEDTA二钠盐，10毫克/毫升牛血清白蛋白，通过氢氧化钠将pH调整到7.0)提取。在4℃下以12000g离心样品2分钟，并将所得到的上清液用于分析。用Turner TD-20/20发光计(Turner Designs，Sunnyvale，CA，美国)对所有三种报导基因的活性进行发光测定。按照在Promega技术手册No.40(Promega公司，Madison，WI，美国)中所披露的Dual-Luciferase方法在相同的反应混合物中依次测定两种荧光素酶活性。在该装置将20微升瓜尔豆组织提取物与100微升LARII试剂快速混合，在2秒钟之后测定并合并在随后10秒钟所发出的光线。在此之后，马上将100微升‘Stop和Glo’试剂添加到该反应混合物中，并用相同方法测定renilla荧光素酶的荧光。
按照GUS-LightTM系统的说明手册(TROPIX公司，Bedford，MA，美国)测定GUS活性。将20微升瓜尔豆组织提取物添加到180微升GUS反应缓冲液中，并在25℃下培养1小时。将试管放入发光计中，添加300微升‘发光加速计’，在2秒钟之后，测定并合并在随后10秒钟内所发出的光线。
将所得到的值归纳在下面的表中。
相对合并的光信号
相同的结果以‘启动子的相对强度’形式在图26中表示，它的值是通过将两种比例(测试比例和对照比例相除计算出的。测试比例是通过用由受NOS启动子控制的对照报导基因(uidA或Rluc)所获得的值除由受测试启动子结构控制的萤火虫荧光素酶所产生的荧光度而计算出的，对照比例是通过用对照报导基因(uidA或Rluc)的值除由萤火虫荧光素酶的荧光度而计算出的，这两种基因都是受NOS启动子的控制。‘启动子的相对强度’是通过用对照比例除测试比例并用所得到的值乘以100而计算出的。
图26所示的结果表示
图17所示结果的形式，就是说Tandemleg/pro结构能增强启动子的活性，同时能保持其组织专一性。尽管在早期的结果中似乎Tandem leg/pro启动子在胚乳组织中的强度似乎比NOS启动子的强度强2倍，但图26中的结果显示，这两种启动子实际上在该组织中表现出相似的强度。以上结果还表明，从结构中去除内含子似乎能增强在瓜尔豆组织中的启动子强度。对本发明的某些实施方案来说，这是一个优选特征。因此，NOI优选不包括内含子。总结总之，本发明涉及一种启动子，并且还涉及含有一种含有该启动子的结构。具体地讲，本发明涉及用一种启动子在一种生物中表达NOI。
在以上说明书中所提到的所有文献被收作本文参考。在不超出本发明范围和构思的前提下，对所述本发明方法和系统所作的各种改进和改变对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管业已结合的特定的优选实施方案对本发明进行了说明，但应当理解的是，本发明所要求保护的并不仅仅局限于这些具体的实施方案。实际上，对所述实施本发明的方案所作的对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的各种改进都属于以下权利要求书的范畴。
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序列表SEQ ID NO.1ACTTTAGATAATAAAGTAAGTCACAAGAAAAATAAATAATAATTCCAAATTTTTTTAATAAGACGAGTGGTCAAACAGTACAAGTAAAAACTCAAAATTCCTTATATTATGGGACTTATATTATGGGACGGAGGAAGTAGAAGATTGTAGCCAAGAAAAAAACAAAAACAAACACACCGCCACCTGGCAGGCATGCATCTTAGGTCGGCACATTGAGAGGTCGGCAGTAGACGAGTTACCCTACACAACTGCTTCTTCAGTGAGCTAGCTGCATGTTCTGTTCTGCATTTACATTGCAGGCAGCAGCTAGCAACAGTTTGCAGGAACAATCGATAATCCATTGTGTCAGGGAGGAACATGGAGAAAAACCGGGGCTGGAGACGAACGGGAGCAGCTGTACCGTACGTTTCTGAAGGCTGAACCCATCTGCGAAATCCGCAGATTGGTTTGTTCAATTCCAACTTGCAGTCCTTCAGATTGGTTGCATGTTCAACCGTAGTACATCTGAAAAATGAAGTGTTAAATACCTTGAGAAGACCTTCATGGAAGCATGCCTGCAGGCGATTAGCTAAGAAAAAAAAAATAAATGTACTTTTCGAAACTTAATTTTGGAGTTAGATTTTAGGGTGTTTCCATCGTAGTGTATTTTCTACTATTGCAGTTTAAACCGCTAATAGTCAGATATAAAATTTTATCTATAGATCATTTATAAATCATTTTTAGTTGCTTCGTTCATTTTTCTACCACTTATCAACCATAGCTCAACTGATCAATTGACAATAAAAGTTACTAAACGACATCGCTCATCACACACCCAACGCTCACCGATGGGTGCCTCTCGACCACGAGTTTAGCACTTGTGCAACATATATGCGTGCGATGAACATCTACTGATGCGCCATGCGAATTTTAGCGTTCGTTCATGACGCTTCCAACGGCACAGAGGCTGAGCAGCAGCATGCATGCATGGCTCTTGTGAAAACAAAAAAGGTTACTGGTAAATGACATGCTGCTGTAGCrAGTTAGCAGAATGCAAGGCCCATGCATATGCAATGCTATGCAACAAGTATAGTACCAGCATGTATGGTAGCCAGCTAACTAATCTATCAGCAGAGGCAGCAAGCTCGTGCATGGTGTGATGCACTTCTCTCCAGTAATCTAGTGGTAATTTTCACCCAAAGCGTTGCTCATATGGACAGTAATTAGTAATATTACCAAGGTTCACAATCCCGTTACCTGACCAAATACTACTCACGAATGGTATCTCTGGTTTTCGTTAAAACCGTTGGTAAACCAGCAAAAATAGACAAAATTTGTCAAAATTTTAAATTTTAGTTTTTTTTTTAACTTAGCCGGGAAACCTTGAAGTTTGTGCTGTCGAGCTGTCCTGGGAAGGACGGTTTTGGTTGGGATTGTGAACCCTGGTTACTGCACTTCATTTTTGAACAGATATTAGTGCAACAGACAAATGCCAACGCATTTTTTTCTGTTTACCGGCAAGCTGAAGCTTTTACGATCCCCATACCGCCGTTGCTGCAAACCTGCCAAGAAAGAGCAGCAGAAACAGGTGTCATTTTGTGGTGGAAAGCCAAGTAAAGTAAACAGAAGATGGAAGATAGTGAGGACCAGGGAGTGAGGCAGGGGACACATGGCCCACGCCTCCCTGCACATTTTCGTGTATAAATACAGGTGGATGCATCGCTCTCCCAGCATCCATCGGTTCTCTGCTCTGTTCATCCATAGAGTTTCCTCCTCTTCTCCTTCAGTGCAAGSEQ ID NO. 2GTAGAGAAGAGCATGTGTGTGTGTGTGTGTGAACTGTGAAGTGCAGAGTGCTTCTGTAGTTCTGTGTTATGTCCATAGTGATCTTGTTAGGATTGTTGCTATGGATGCATGATGTTATGGTTAATCTCTGAATTACAGTAGGGACTTCTCTGAGATCTCTGGATTAGTGGGGGGTGCTAAATTTTTTTCTGGTTGCATCAGCTTGGGTTTCTGGGATTGGTGTGGGTTCTTGCTCTGAATTTTGGTTCAGAATGTCGATTTGTTTTGTGTTTGCCCTCTGAAGTTGAGAGTAGCTATGATCCATCCAGCACAGAACTGCAGGTCCCTGCCTGCCGGCAGCATATACAGGACATGCCATTTTGCAAGCTCTGGGCTTATGGTTTCTCTTTTGGAGTTCTTCTTCTTGCATGATCTGTGTTCTCTAACAAAGAAGCAAGATTTAGCAACTTTATTCAGAGACAAGAAAAGGATCTGGCAACCTTTTGTTTCTGTTTTATCCTACTCGTAAAGATTGTTATTTAAGCAAAAATTTCCCAAAAGTTTTAAATATAATTTCCATGATGTGCCACTCTCATGTCCTTGAACCTGGCACTCATTATGGGCTCCTCAGAAGTGCTGTAGCTAATGTCACTAATCTTTTGTATCTTTGTTCGTAGTCTTGTATTTTATGATGCTTATCCCTTTGTGCTTTCCATGTTTGATGTCCAAATGTCATGGCAATGTTTTTGACTTCTAGTAGGGGTTTTAGTACCTTTTTGTTAGATAAGTACATCCAAATTCTGTTTATTTATTCAAAAATCATTCTGTTTATTCACTGAAAACATTTGTCCATTCAATGGAATCGTAAACTGTCTGTGTTTTTCAGSEQ ID NO. 3ACTTTAGATAATAAAGTAAGTCACAAGAAAAATAAATAATAATTCCAAATTTTTTTAATAAGACGAGTGGTCAAACAGTACAAGTAAAAACTCAAAATTCCTTATATTATGGGACTTATATTATGGGACGGAGGAAGTAGAAGATTGTAGCCAAGAAAAAAACAAAAACAAACACACCGCCACCTGGCAGGCATGCATCTTAGGTCGGCACATTGAGAGGTCGGCAGTAGACGAGTTACCCTACACAACTGCTTCTTCAGTGAGCTAGCTGCATGTTCTGTTCTGCATTTACATTGCAGGCAGCAGCTAGCAACAGTTTGCAGGAACAATCGATAATCCATTGTGTCAGGGAGGAACATGGAGAAAAACCGGGGCTGGAGACGAACGGGAGCAGCTGTACCGTACGTTTCTGAAGGCTGAACCCATCTGCGAAATCCGCAGATTGGTTTGTTCAATTCCAACTTGCAGTCCTTCAGATTGGTTGCATGTTCAACCGTAGTACATCTGAAAAATGAAGTGTTAAATACCTTGAGAAGACCTTCATGGAAGCATGCCTGCAGGCGATTAGCTAAGAAAAAAAAAATAAATGTACTTTTCGAAACTTAATTTTGGAGTTAGATTTTAGGGTGTTTCCATCGTAGTGTATTTTCTACTATTGCAGTTTAAACCGCTAATAGTCAGATATAAAATTTTATCTATAGATCATTTATAAATCATTTTTAGTTGCTTCGTTCATTTTTCTACCACTTATCAACCATAGCTCAACTGATCAATTGACAATAAAAGTTACTAAACGACATCGCTCATCACACACCCAACGCTCACCGATGGGTGCCTCTCGACCACGAGTTTAGCACTTGTGCAACATATATGCGTGCGATGAACATCTACTGATGCGCCATGCGAATTTTAGCGTTCGTTCATGACGCTTCCAACGGCACAGAGGCTGAGCAGCAGCATGCATGCATGGCTCTTGTGAAAACAAAAAAGGTTACTGGTAAATGACATGCTGCTGTAGCTAGTTAGCAGAATGCAAGGCCCATGCATATGCAATGCTATGCAACAAGTATAGTACCAGCATGTATGGTAGCCAGCTAACTAATCTATCAGCAGAGGCAGCAAGCTCGTGCATGGTGTGATGCACTTCTCTCCAGTAATCTAGTGGTAATTTTCACCCAAAGCGTTGCTCATATGGACAGTAATTAGTAATATTACCAAGGTTCACAATCCCGTTACCTGACCAAATACTACTCACGAATGGTATCTCTGGTTTTCGTTAAAACCGTTGGTAAACCAGCAAAAATAGACAAAATTTGTCAAAATTTTAAATTTTAGTTTTTTTTTTAACTTAGCCGGGAAACCTTGAAGTTTGTGCTGTCGAGCTGTCCTGGGAAGGACGGTTTTGGTTGGGATTGTGAACCCTGGTTACTGCACTTCATTTTTGAACAGATATTAGTGCAACAGACAAATGCCAACGCATTTTTTTCTGTTTACCGGCAAGCTGAAGCTTTTACGATCCCCATACCGCCGTTGCTGCAAACCTGCCAAGAAAGAGCAGCAGAAACAGGTGTCATTTTGTGGTGGAAAGCCAAGTAAAGTAAACAGAAGATGGAAGATAGTGAGGACCAGGGAGTGAGGCAGGGGACACATGGCCCACGCCTCCCTGCACATTTTCGTGTATAAATACAGGTGGATGCATCGCTCTCCCAGCATCCATCGGTTCTCTGCTCTGTTCATCCATAGAGTTTCCTCCTCTTCTCCTTCAGTGCAAGGCTTGAGGATCCAACTAGAAGATAGCAATGGSEQ ID NO. 4CAGGTGGATGCATCGCTCTCCCAGCATCCATCGGTTCTCTGCTCTGTTCATCCATAGAGTTTCCTCCTCTTCTCCTTCAGTGCAAGSEQ ID NO.5-外显子序列的第二部分GCTTGAGGATCCAACTAGAAGATAGCAATGGSEQ ID NO 6ACTTTAGATAATAAAGTAAGTCACAAGAAAAATAAATAATAATTCCAAATTTTTTTAATAAGACGAGTGGTCAAACAGTACAAGTAAAAACTCAAAATTCCTTATATTATGGGACTTATATTATGGGACGGAGGAAGTAGAAGATTGTAGCCAAGAAAAAAACAAAAACAAACACACCGCCACCTGGCAGGCATGCATCTTAGGTCGGCACATTGAGAGGTCGGCAGTAGACGAGTTACCCTACACAACTGCTTCTTCAGTGAGCTAGCTGCATGTTCTGTTCTGCATTTACATTGCAGGCAGCAGCTAGCAACAGTTTGCAGGAACAATCGATAATCCATTGTGTCAGGGAGGAACATGGAGAAAAACCGGGGCTGGAGACGAACGGGAGCAGCTGTACCGTACGTTTCTGAAGGCTGAACCCATCTGCGAAATCCGCAGATTGGTTTGTTCAATTCCAACTTGCAGTCCTTCAGATTGGTTGCATGTTCAACCGTAGTACATCTGAAAAATGAAGTGTTAAATACCTTGAGAAGACCTTCATGGAAGCATGCCTGCAGGCGATTAGCTAAGAAAAAAAAAATAAATGTACTTTTCGAAACTTAATTTTGGAGTTAGATTTTAGGGTGTTTCCATCGTAGTGTATTTTCTACTATTGCAGTTTAAACCGCTAATAGTCAGATATAAAATTTTATCTATAGATCATTTATAAATCATTTTTAGTTGCTTCGTTCATTTTTCTACCACTTATCAACCATAGCTCAACTGATCAATTGACAATAAAAGTTACTAAACGACATCGCTCATCACACACCCAACGCTCACCGATGGGTGCCTCTCGACCACGAGTTTAGCACTTGTGCAACATATATGCGTGCGATGAACATCTACTGATGCGCCATGCGAATTTTAGCGTTCGTTCATGACGCTTCCAACGGCACAGAGGCTGAGCAGCAGCATGCATGCATGGCTCTTGTGAAAACAAAAAAGGTTACTGGTAAATGACATGCTGCTGTAGCTAGTTAGCAGAATGCAAGGCCCATGCATATGCAATGCTATGCAACAAGTATAGTACCAGCATGTATGGTAGCCAGCTAACTAATCTATCAGCAGAGGCAGCAAGCTCGTGCATGGTGTGATGCACTTCTCTCCAGTAATCTAGTGGTAATTTTCACCCAAAGCGTTGCTCATATGGACAGTAATTAGTAATATTACCAAGGTTCACAATCCCGTTACCTGACCAAATACTACTCACGAATGGTATCTCTGGTTTTCGTTAAAACCGTTGGTAAACCAGCAAAAATAGACAAAATTTGTCAAAATTTTAAATTTTAGTTTTTTTTTTAACTTAGCCGGGAAACCTTGAAGTTTGTGCTGTCGAGCTGTCCTGGGAAGGACGGTTTTGGTTGGGATTGTGAACCCTGGTTACTGCACTTCATTTTTGAACAGATATTAGTGCAACAGACAAATGCCAACGCATTTTTTTCTGTTTACCGGCAAGCTGAAGCTTTTACGATCCCCATACCGCCGTTGCTGCAAACCTGCCAAGAAAGAGCAGCAGAAACAGGTGTCATTTTGTGGTGGAAAGCCAAGTAAAGTAAACAGAAGATGGAAGATAGTGAGGACCAGGGAGTGAGGCAGGGGACACATGGCCCACGCCTCCCTGCACATTTTCGTGTATAAATA
权利要求
1.一种启动子，包括相当于SEQ ID NO1所示序列或其变体、同源物、片段或衍生物的核苷酸序列。
2.一种启动子，具有相当于SEQ ID NO1所示序列或其变体、同源物、片段或衍生物的核苷酸序列。
3.一种启动子，包括相当于SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列。
4.一种启动子，具有相当于SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项的启动子，其中，所述启动子可以从水稻属的植物中获得。
6.一种能导致胚乳专一性表达的启动子，其中，该启动子可以从水稻属的植物中获得。
7.如权利要求1-6中任一项的启动子，其中，所述启动子可操作地连接于NOI上。
8.如上述权利要求中任一项的启动子，其中，所述启动子连接于SEQ ID NO2所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段上。
9.如权利要求8的启动子，其中，如果NOI可操作地连接于所述启动子上的话，那么SEQ ID NO2所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段就位于本发明的启动子和NOI之间。
10.如上述权利要求中任一项的启动子，其中，所述启动子包括表1中所示出的一种或多种鉴定的序列或其变体、同源物或片段。
11.如权利要求10的启动子，其中，所述启动子包括表1所示出的一种或多种鉴定序列。
12.如权利要求10或11的启动子，其中，所述启动子包括表1所示出的所有鉴定序列。
13.如上述权利要求中任一项的启动子，其中，所述启动子连接于SEQ ID NO5所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段上。
14.如权利要求8的启动子，其中，如果NOI可操作地连接于所述启动子上的话，那么SEQ ID NO5所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段就位于本发明的启动子和NOI之间。
15.一种结构，含有权利要求1-14中任一项的启动子，其中，所述启动子可操作地连接于NOI上。
16.一种表达载体，含有权利要求1-15中任一项的发明。
17.一种转化载体，含有权利要求1-16中任一项的发明。
18.一种转化过的宿主或宿主细胞，含有权利要求1-16中任一项的发明。
19.如权利要求18的转化过的宿主或宿主细胞，其中，所述宿主或宿主细胞是植物或植物细胞。
20.一种制备POI的方法，该方法包括表达至少编码POI的一部分的NOI，其中，所述NOI可操作地与一种启动子连接；如果NOI的表达产物不是完整的POI的话，可选地分离形成POI的NOI的表达产物；可选地分离POI；其中，所述启动子是权利要求1-19中任一项的启动子。
21.如权利要求20的方法，其中，所述NOI编码完整的POI。
22.一种在胚乳中表达NOI的方法，该方法包括在NOI可操作地与权利要求1-20中任一项的启动子连接的情况下表达NOI。
23.一种可以从保藏号NCIMB41011中获得的启动子序列。
24.在本文的实验部分所提供的任一种质粒。
25.用SEQ ID NO2所示序列或其变体、同源物、衍生物或片段提高NOI的表达水平的用途。
26.一种大体上如本文所述并且与上述权利要求中任一项相关的启动子。
全文摘要
披露了一种启动子。该启动子包括一种相当于SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物。
文档编号C12N15/82GK1358230SQ0080909
公开日2002年7月10日 申请日期2000年6月15日 优先权日1999年6月17日
发明者I·A·多纳尔森, T·B·拉斯穆森 申请人:丹尼斯科有限公司